TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS PELA BACTÉRIA Serratia

Os testes de biodegradação das éter-aminas foram realizados inicialmente para avaliar o potencial degradador da bactéria Serratia marcescens, caracterizada na literatura como um microrganismo presente na barragem de rejeito da flotação do minério de ferro de uma mineradora de Minas Gerais (ARAÚJO, 2007). Os testes foram realizados com a éter- monoamina e a éter-diamina separadamente e também em uma solução aquosa contendo 25% e 75% em massa, respectivamente. Todos os sistemas continham a concentração inicial calculada de 28mg.L-1_{. A quantificação do coletor orgânico presente nas amostras,} ao longo dos testes, foi realizada pelo Método do Verde de Bromocresol. A Figura 5.5 apresenta o perfil encontrado utilizando o meio de cultura caldo nutriente, durante os 20 dias de observação. 0 5 10 15 20 15 20 25 30 35 40 45

BIODEGRADAÇÃO - Caldo Nutriente Serratia marcescens Co nc e nt ra ç ã o (mg.L -1 ) Tempo (dias) Monoamina Diamina Solução

Figura 5.5. Análise pelo método do Verde de Bromocresol da biodegradação das éter-aminas, utilizando o meio Caldo Nutriente, pela bactéria Serratia marcescens.

82 A concentração inicial de éter-monoamina foi de 38,3mg.L-1_{, seguida de 37,1mg.L}-1 _{após 3} dias de incubação. No 7° dia a concentração encontrada foi de 33mg.L-1_{, e no 13° dia havia} 31,2mg.L-1. A quantificação no 15° dia não mostrou diferença significativa com a análise anterior, sendo a concentração de 31,8mg.L-1. Ao final dos 20 dias de observação foram quantificados 30,7mg.L-1 de éter-monoamina. Já para a éter-diamina, a concentração inicial foi de 39,0mg.L-1, seguida de 37,1mg.L-1 após 3 dias de incubação. No 7° dia a concentração encontrada foi de 32,6mg.L-1, e no 13° dia havia 31,5mg.L-1. A quantificação no 15° apresentou a concentração de 32,5mg.L-1. Ao final dos 20 dias de observação foram quantificados 29,6mg.L-1. Nas análises dos testes contendo a solução das aminas a concentração inicial foi de 37,4mg.L-1, seguida de 36,7mg.L-1 após 3 dias de incubação. No 7° dia a concentração encontrada foi de 32,1mg.L-1, e no 13° dia havia 31,0mg.L-1. A quantificação no 15° apresentou a concentração de 31,8mg.L-1. Ao final dos 20 dias de observação foram quantificados 29,6mg.L-1 de éter-aminas.

As concentrações iniciais encontradas para todos os testes utilizando o caldo nutriente apresentaram valores maiores do que o valor calculado, sendo de 38,3, 39,0 e 37,4mg.L-1 para éter-monoamina, éter-diamina e solução de aminas, respectivamente, permanecendo maior que o valor calculado ao longo de todo o monitoramento.

A Figura 5.6 apresenta o perfil encontrado para os testes de degradabilidade das aminas pela Serratia marcescens utilizando o meio de cultura Bromfield modificado, durante os 20 dias de observação. Neste meio de cultura a concentração inicial foi de 27,7mg.L-1 _{de éter-} monoamina. Houve um aumento da concentração para 31,3mg.L-1 após 3 dias de observação e foram encontrados 30mg.L-1 em 7 dias. Após 13 dias, a concentração não sofreu alteração, permanecendo em cerca de 30mg.L-1, mas no 15° dia, foram encontrados apenas 28,5mg.L-1. No último dia de análise a concentração de éter-monoamina encontrada foi de 30,2mg.L-1.

83 0 5 10 15 20 15 20 25 30 35 40 45

BIODEGRADAÇÃO - Bromfield modificado

Serratia marcescens C on ce nt ra çã o (mg .L -1 ) Tempo (dias) Monoamina Diamina Solução

Figura 5.6. Análise pelo método do Verde de Bromocresol da biodegradação das éter-aminas, utilizando o meio Bromfield modificado, pela bactéria Serratia marcescens.

A concentração inicial de éter-diamina foi de 28,7mg.L-1. Houve um aumento da concentração para 30,9mg.L-1 após 3 dias de observação e foram encontrados 30,1mg.L-1 em 7 dias. A quantificação no 13° dia resultou na concentração de 30,7mg.L-1 e no 15° dia, foram encontrados apenas 28,8mg.L-1. No último dia de análise a concentração de éter- diamina encontrada foi de 29,8mg.L-1. Para a solução das aminas a concentração inicial foi de 29,1mg.L-1, aumentando para 31,2mg.L-1 após 3 dias de observação. Foram encontrados 30,4mg.L-1 em 7 dias, 30,2mg.L-1 no 13° e no 15° dia, foram encontrados apenas 29,7mg.L-1. No último dia de análise a concentração de éter-diamina encontrada foi de 31,6mg.L-1.

As concentrações iniciais encontradas para todos os testes utilizando o meio Bromfield modificado como meio de crescimento microbiano estão de acordo com a concentração calculada, que foi de 28mg.L-1. Já as quantidades de éter-aminas encontradas após 3, 7, 13, 15 e 20 dias de incubação são maiores do que a concentração calculada.

Era esperado que as concentrações iniciais de aminas fossem próximas à concentração calculada e que ao longo do monitoramento esse valor fosse diminuindo independente do

84 meio de cultura utilizado, pois a bactéria S. marcescens é descrita na literatura como degradadora desse coletor orgânico, estando presente nas barragens de rejeito da flotação do minério de ferro (ARAÚJO, 2007), e que o período de degradação é relativamente pequeno, como apontado por CHAVES (2001), que também analisou amostras de uma barragem de rejeitos da flotação de minério de ferro e observou que o tempo de decomposição da amina é bastante curto, sendo que em 12 dias de monitoramento a quantidade de amina foi reduzida para menos da metade da quantidade inicial. Assim como CHAVES (2001), REIS (2004) observou que depois de 14 dias após a primeira extração da amina, não foram encontrados mais coletores no líquido da flotação e em 6 dias, a concentração de amina era de aproximadamente a metade da quantidade encontrada no primeiro dia de extração.

Ainda nos estudos conduzidos por ARAÚJO et al. (2010), foi avaliaada a biodegradação das éter-aminas pela Serratia marcescens bizio 1823AL, nas concentrações de 10, 40 e 60mg.L-1, em diferentes temperaturas, (25, 30, 35 e 38°C) e os resultados mostraram, inicialmente, lentas taxas de biodegradação, especialmente em altas concentrações de amina. Para concentração de 10mg.L-1, as taxas de biodegradação foram muito próximas umas das outras em todas as temperaturas testadas, o que mostrou baixa interferência da temperatura para este parâmetro. No entanto, para as concentrações de 40 e 60mg.L-1, a temperatura influenciou significativamente nas taxas de biodegradação das éter-aminas, sendo a maior influência para a temperatura de 38°C.

Uma hipótese para a diferença na concentração inicial observada e a calculada, assim como a concentração final acima da calculada para os dados com o caldo nutriente, e o aumento da concentração durante os experimentos com o Bromfield modificado está nas colorações encontradas para os meios de cultura testados. O meio de cultura Bromfield modificado, após a autoclavação, apresenta coloração bastante transparente e depois da inoculação e crescimento bacteriano, esse mesmo meio de cultura torna-se pouco turvo esbranquiçado. Como inicialmente o meio não apresentou qualquer tipo de coloração, a metodologia de quantificação utilizada foi eficaz para a análise da concentração de éter-aminas, quantificando exatamente a quantidade de coletor presente no meio. Mas após alguns dias de incubação, o meio Bromfield modificado sofreu alteração da cor e essa mudança pode

85 ter influenciado a metodologia de quantificação do coletor, alterando a concentração encontrada ao longo do monitoramento.

O meio caldo nutriente apresenta coloração amarelada transparente após a autoclavação e, assim como o meio Bromfield modificado, sofre alteração da cor após a inoculação e crescimento de microrganismos, tornando-se amarelado opaco. A concentração inicial observada pode ter sofrido interferência da cor inicial do meio de cultura e, como a metodologia utilizada é colorimétrica, o resultado pode ter sofrido alguma alteração. As concentrações observadas ao longo dos testes foram menores do que a inicial, mas ainda maiores do que a inicial calculada, o que pode significar uma menor interferência da cor do meio de cultura turvo ou ainda que a interferência tenha sido constante, mas as éter-aminas tenham realmente sido degradadas pela Serratia marcescens.

Diante dos resultados encontrados para os dois meios de cultura testados e dos perfis de degradação de éter-aminas discutidos na literatura, foram realizadas análises, em duplicatas, sem a adição de aminas para observar a interferência que o meio de cultura estaria provocando nos resultados. A Tabela 5.3 apresenta os valores das absorbâncias, assim como as concentrações correspondentes.

Tabela 5.3. Absorbâncias e concentrações encontradas nos testes sem a adição de éter-aminas.

Bromfield modificado Caldo Nutriente Tempo

(dias)

Absorbância Concentração (mg.L-1_{) Absorbância Concentração (mg.L}-1₎ Teste A Teste B Teste A Teste B Teste A Teste B Teste A Teste B

0 0,005 0,008 -1,68 -1,55 0,271 0,281 10,01 10,45 3 0,093 0,092 2,185 2,141 0,226 0,277 8,034 10,28 7 0,076 0,078 1,438 1,526 0,158 0,163 5,044 5,263 13 0,08 0,089 1,613 2,009 0,15 0,13 4,692 3,812 15 0,074 0,076 1,35 1,438 0,181 0,124 6,055 3,548 20 0,099 0,103 2,449 2,625 0,095 0,083 2,273 1,745

O meio Bromfield modificado apresentou pequenas absorbâncias nos testes com ausência de éter-aminas, enquanto o meio caldo nutriente apresentou valores significativos durante todo o período de observação. Os resultados encontrados inferem que os meios de cultura utilizados, principalmente o caldo nutriente, interferem nos resultados, uma vez que suas

86 absorbâncias são diferentes de zero. Assim, para avaliar em qual faixa de comprimento de onda esses meios de cultura não apresentam resultados que comprometem a metodologia de quantificação de éter-aminas, foi realizada uma varredura no espectrofotômetro para os dois meios, de 450 à 550nm. Os valores obtidos desse procedimento podem ser observados na Tabela 5.4. Os resultados da varredura indicaram que para o Bromfield modificado, comprimentos acima de 453nm não apresentaram absorbância suficiente para interferir no resultado final de quantificação dos coletores e para o caldo nutriente, comprimentos de onda acima de 470nm não interferem nos resultados. Os resultados da varredura indicaram que para o meio Bromfield modificado, a existência de um perfil não degradador do coletor encontrada não sofreu significativas interferências do meio de cultura, indicando que neste meio a bactéria não degradou as aminas. Já no caldo nutriente, os resultados sofreram interferência do meio, mas mesmo assim não foi detectado o perfil de degradação esperado. Essas observações sugerem que na barragem de rejeito a S. marcescens pode estar presente, mas associada a um grupo de microrganismos biodegradadores das éter-aminas.

A interferência do meio de cultura nos resultados finais foi eliminada uma vez que no laboratório de resíduos e efluentes, n°62, do DEQUI/UFOP, foi desenvolvida uma nova metodologia de quantificação de éter-aminas, utilizadas na flotação do minério de ferro, na qual a leitura no espectrofotômetro era realizada no comprimento de onda de 485nm, comprimento este no qual os meios de cultura não apresentaram valores de interferência nos resultados finais.

87 Tabela 5.4. Varredura dos meios de cultura, de 450 à 550nm.

Bromfield modificado Caldo Nutriente Comprimento de onda (nm) Absorbância A Absorbância B Absorbância A Absorbância B 450 0,005 0,009 0,059 0,031 451 0,007 0,004 0,036 0,023 452 0,002 0,001 0,031 0,021 453 0 0 0,025 0,016 454 0 0 0,022 0,014 455 0 0 0,018 0,012 456 0 0,017 0,011 457 0 0 0,014 0,010 458 0 0 0,013 0,009 459 0 0 0,013 0,007 460 0 0 0,012 0,007 465 0 0 0,008 0,004 470 0 0 0,004 0,002 475 0 0 0,001 0,001 480 0 0 0,001 0 485 0 0 0,000 0 490 0 0 0 0 495 0 0 0 0 500 0 0 0 0 505 0 0 0 0 510 0 0 0 0 515 0 0 0 0 520 0 0 0 0 525 0 0 0 0 530 0 0 0 0 535 0 0 0 0 540 0 0 0 0 545 0 0 0 0 550 0 0 0 0