2. Material e Métodos
2.1. Cultura de tecido caloso e condições de crescimento
2.1.1. Seleção e manutenção de linha celular adaptada a 150 mM NaCl
Linhas celulares de S. tuberosum tolerantes a concentrações crescentes de NaCl foram obtidas a partir de tecido caloso cultivado em meio nutritivo sem sal, tendo-se recorrido a dois métodos de seleção, a seleção directa e a gradual, para a obtenção dessas linhas (Queirós, 2001; Queirós et al., 2007). A linha crescida na presença de 150 mM NaCl foi selecionada como sistema modelo para os estudos descritos nesta tese, por se tratar daquela que, estando exposta a um elevado nível de salinidade, manteve uma proliferação celular e crescimento regulares ao longo do tempo. No entanto, no início do presente trabalho procedeu-se à obtenção de novo do material biológico, de modo, a reduzir-se a possibilidade de ocorrência de variação somaclonal, um fenómeno favorecido pela longa permanência do tecido caloso em contacto com o sal através de um elevado número de repicagens (Rus et al., 1999). Assim, a linha adaptada foi estabelecida por via da seleção gradual, uma vez que este método revelou-se mais eficaz na obtenção de tecido caloso capaz de crescer na presença de 150 mM NaCl sem se registarem perdas consideráveis de material por mortalidade (Queirós et al., 2007). Para esse efeito, foi usada uma cultura estabelecida de tecido caloso, que havia sido induzida a partir de folhas jovens de plantas de S. tuberosum L. cv. Désirée (Queirós, 2001) e que foi mantida em frascos de cultura com 100 mL de meio de manutenção (Tabela 2.1) previamente esterilizados por autoclavagem (121ºC, 24 min). Esta cultura foi designada por linha controlo (Figura 2.1A). No momento de se proceder à repicagem do tecido caloso para meio fresco, porções de tecido controlo (cerca de 2-4 g) foram inicialmente transferidas para meio de manutenção ao qual se adicionou 50 mM NaCl; ao fim de 28 dias, procedeu-se à transferência dos fragmentos não necrosados de tecido caloso crescido na presença de 50 mM para o mesmo meio mas com 100 mM NaCl, repetindo-se o procedimento após quatro semanas, em que o tecido foi subcultivado para meio de manutenção com 150 mM NaCl. A linha adaptada usada neste trabalho foi conseguida ao fim de quatro repicagens sucessivas no meio contendo 150 mM NaCl (Figura 2.1B).
As culturas de tecido controlo e adaptado a 150 mM NaCl foram mantidas em estufa climatizada (25 1ºC) e sujeitas a um fotoperíodo de 16 h de luz fornecida por um conjunto de lâmpadas fluorescentes com uma intensidade luminosa de 40-60 mol m-2 s-1. A renovação do meio nutritivo (Tabela 2.1) foi realizada após quatro semanas de cultura em condições assépticas.
Tabela 2.1 – Composição do meio de cultura utilizado na manutenção de tecido caloso de S.
tuberosum. De notar que para a manutenção da linha adaptada foi adicionado ao meio 8766 mg L–1
NaCl. A ambos os meios controlo e suplementado com 150 mM foi adicionado 0,62% (p/v) de agar após o ajuste de pH para 5,7 com solução de KOH.
Compostos inorgânicos mg L–1 Compostos orgânicos mg L–1
NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 Fe-EDTA KI H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoSO4.7H2O 1650 1900 440 370 170 40 0,83 6,2 16,9 8,6 0,25 0,025 0,025 Biotina Ácido nicotínico Piridoxina Tiamina Mio-inositol Glicina Ácido fólico Sacarose Hidrolisado de caseína 0,05 0,5 0,5 0,5 2 5 0,5 20 000 1000 Reguladores crescimento mg L–1 Ácido 2,4- -diclorofenoxiacético (2,4-D) 2 Benzilaminopurina (BA) 0,5
Figura 2.1 – Tecido caloso controlo mantido na ausência de NaCl (A) e tecido crescido na presença de 150 mM NaCl ao fim de 4 meses de cultura (B).
2.1.2. Exposição de tecido caloso a tratamento de choque com 150 mM NaCl
Para avaliar o efeito do tratamento de choque com NaCl no comportamento do tecido caloso, parte do tecido controlo crescido em meio de cultura sem sal (Figura 2.2A1) foi
transferido diretamente para meio contendo 150 mM NaCl, sem qualquer adaptação prévia à presença do sal (Figura 2.2A2). Por sua vez, o tecido adaptado e cultivado em meio salino
(Figura 2.2B1) foi transferido para o mesmo meio mas sem NaCl (Figura 2.2B2). Ao fim de
quatro semanas de cultura em estufa climatizada e nas condições acima descritas efetuou- se a colheita do tecido caloso exposto a tratamento de choque salino (Figura 2.2A3) e
crescido na ausência de sal (Figura 2.2B3).
Figura 2.2 – Esquema do procedimento utilizado para analisar o comportamento do tecido caloso quando sujeito à alteração das condições de crescimento. O tecido caloso controlo (A1) foi cultivado em meio contendo 150 mM NaCl (A2), e ao fim de 28 dias de cultura foi
colhido (A3). O tecido adaptado crescido na presença de 150 mM NaCl (B1) foi mantido
durante 28 dias em meio nutritivo sem sal (B2), sendo depois colhido (B3).
2.1.3. Colheita de tecido caloso
A colheita do material controlo e adaptado foi realizada ao fim de 28 dias de cultura, coincidindo com o momento em que o tecido caloso controlo era subcultivado para meio fresco e tendo decorridos seis meses de permanência do tecido adaptado em meio salino, sendo que esteve exposto durante quatro meses a 150 mM NaCl. De salientar, que nas várias colheitas realizadas ao longo deste trabalho foi nosso objetivo assegurar que o
material adaptado apresentasse o mesmo tempo de exposição ao sal, de modo a minorar as diferenças entre réplicas biológicas.
O material biológico usado para a avaliação de determinados parâmetros bioquímicos e estudo do sistema de defesa antioxidante foi colhido em três datas diferentes, a partir de tecido caloso mantido em quatro frascos predefinidos para avaliar o crescimento. Em cada colheita procedeu-se à pesagem do tecido contido em cada frasco para quantificação do crescimento; posteriormente, o tecido caloso de cada condição experimental foi congelado e reduzido a pó em azoto líquido, dividido em alíquotas que foram pesadas e armazenadas a 80ºC. Para os restantes estudos foi também usado material recolhido de pelo menos quatro frascos de cultura, em três datas diferentes, funcionado assim cada colheita como um ensaio independente. Material fresco foi processado de imediato para os estudos de ultraestrutura e de transporte em vesículas de tonoplasto, como indicado adiante. Por sua vez, o tecido caloso destinado à avaliação genotípica foi inicialmente sujeito a uma secagem rápida em papel de filtro, para ser depois congelado e reduzido a pó em azoto líquido e guardado a 80ºC. Já para a análise proteómica por eletroforese bidimensional foram usadas amostras de material controlo e adaptado que fora submetido a um processo de liofilização, após congelamento e redução a pó em azoto líquido.
Relativamente à colheita do tecido que foi sujeito ao tratamento de choque com sal, esta foi realizada no final do tratamento, isto é, quatro semanas após a transferência do tecido caloso controlo para meio de cultura com sal. Paralelamente, procedeu-se à colheita do tecido adaptado que havia sido transferido para meio sem sal. De mencionar, que o material usado para os vários estudos foi recolhido de dez frascos de cultura, operação realizada em duas datas. O tecido caloso colhido foi pesado, congelado e reduzido a pó em azoto líquido e armazenado a 80ºC.