Nesta pesquisa foram utilizados 18 mocós adultos jovens provenientes do município de Jucurutu, Região do Seridó do Rio Grande Norte, conforme autorização do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis – IBAMA (SISBIO número 22403-1, de 24/12/2009). Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas estabelecidas pelo National Research Council of the National Academy publicadas no livro “Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behavioral Research”. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais-UFRN sob número 015/2009.
Não foi possível determinar a idade dos animais, uma vez que foram todos capturados na natureza. Entretanto, utilizamos o parâmetro do peso corporal para estabelecer uma faixa compatível com indivíduos nem muito jovens, nem excessivamente velhos. Após a captura os animais foram acomodados em um ambiente com paredes de tela de arame presa a suporte de alvenaria, teto de telhas de cerâmica e piso de solo natural com vegetação rasteira e pedras, simulando o habitat natural do animal. Desta forma, os animais ficaram expostos às condições ambientais naturais de temperatura, umidade do ar e luminosidade, com alimentação e água ad libitum continuamente.
Do total de 18 animais (36 olhos), foram utilizadas 18 retinas para montagens planas (6 para marcação com anticorpo anti-TH, 3 com anti-opsina para cones S, 3 com anti-opsina para cones L/M, 4 para coloração por técnica de Nissl (cresil violeta), 1 para marcação com anti-Beta-tubulina e 1 para marcação com anti-calbindina); 4 olhos foram congelados em metanol com gelo seco e cortados num micrótomo de deslizamento (Leica SM 2000R) para estudo da anatomia macroscópica, 2 olhos foram emblocados em parafina/bouin para análise
61 da estrutura do olho e da retina, e 3 foram cortados em criostato para montagem em lâminas e análise da estratificação de cones, bastonetes, de células expressando dopamina, proteínas ligantes de cálcio, inclusive com a utilização de duplas marcações.
Anestesia e perfusão
Os animais foram adaptados ao escuro por um período de 2 a 3 horas, sendo então pré- anestesiados com cloridrato de tramadol e xilazina, ambos 5mg/Kg, e após 15 minutos, anestesiados com uma injeção intramuscular de cloridrato de ketamina (100 mg/kg), sendo mantidos com isoflurano e oxigênio por inalação. Uma vez anestesiados, foram tomadas medidas da rima palpebral com o auxílio de um paquímetro digital (Digimess). Os olhos foram fotografados dentro da órbita e sob anestesia profunda, foram perfundidos transcardiacamente inicialmente com 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato pH 7.4 (PB) com heparina (Parinex Hipolabor, 2 ml/1000 ml de solução salina) seguido de 700 ml de solução fixadora, consistindo de solução de paraformaldeído 4% em PB pH 7.4. As soluções foram impulsionadas através do leito vascular do animal por uma bomba de perfusão (Cole-Parmer), à qual foi conectada uma agulha inserida no ápice do ventrículo esquerdo, na direção da aorta ascendente, tendo sido feita prévia incisão na aurícula direita. Todo procedimento durou em torno de 30 minutos.
Concluída a perfusão, procedeu-se a enucleação dos olhos. Os crânios foram descarnados e macerados para estudo da órbita óssea e os encéfalos removidos e armazenados para estudos de outros projetos desenvolvidos no laboratório.
Os eixos dorsoventral e nasotemporal do olho foram devidamente registrados para posterior orientação da retina. Foram obtidas medidas morfométricas com o paquímetro digital: diâmetro axial do olho (AD), diâmetro equatorial do olho (ED) e diâmetro equatorial da córnea (EDC). Feito isso, foram feitas aberturas na córnea e os olhos foram imersos em
62 paraformaldeído 4% (Sigma-Aldrich) por 2 horas e depois armazenados em tampão fosfato (PB) 0,1 M, pH 7.4. Para as montagens planas, as retinas foram cuidadosamente dissecadas e mantidas em tampão fosfato 0,1 M, pH 7.4, 4º C. Para obtenção de secções verticais, três retinas de animais distintos foram crioprotegidas com sacarose 30% em PB 0,1 M, e áreas representativas das regiões central e periférica foram seccionadas (20 µm de espessura), em criostato (Leica CM 1900, Alemanha). As secções foram montadas em lâminas gelatinizadas e armazenadas a -20°C até o momento de sua utilização em procedimentos de imunoistoquímica.
Análise da anatomia do olho
Para identificação dos músculos extra-oculares, uma vez concluída a perfusão, 3 animais tiveram um olho mantido na órbita, quando então os crânios foram descarnados para facilitar a cuidadosa dissecação dos músculos, com o devido cuidado para manter os olhos sempre adequadamente hidratados. Uma vez concluída a dissecção, os músculos foram identificados e fotografados e em seguida os olhos foram excisados e armazenados em PB 0,1M, pH 7.4.
Para o exame macroscópico das estruturas internas do olho, quatro olhos foram enucleados previamente à fixação, imediatamente congelados por imersão em metanol com gelo seco e seccionados no plano ântero-posterior, em micrótomo horizontal de deslizamento. Ao longo de toda microtomia foram obtidas fotografias para posterior análise das seguintes dimensões: diâmetros axial e equatorial do olho, diâmetros axial e equatorial do cristalino, diâmetro equatorial da córnea, distância entre a córnea e a face anterior do cristalino e entre a face posterior do cristalino e a esclera. Essas medidas foram registradas no nível do nervo óptico e no nível do maior eixo do olho.
63 Dois olhos foram imersos em fixativo de Bouin (solução saturada aquosa de ácido picrico – 75 ml, formol 37 ou 40% - comercial – 20 ml, e ácido acético glacial – 5 ml) por 24 horas, desidratados em soluções de etanol em concentrações ascendentes, e emblocados em parafina. Foram obtidas secções transversais de 5 μm de espessura e coradas com Hematoxilina-Eosina para análise da organização em camadas do olho e estratificação da retina.
Imunoistoquímica em montagens planas
Montagens planas de 18 retinas foram obtidas seguindo o método de Stone (1981). Em algumas retinas, o epitélio pigmentar permaneceu firmemente aderido ao tecido retiniano, e para sua remoção foi adotado o protocolo descrito em Hemmi & Grünert (1999), com pequenas modificações, utilizando peróxido de hidrogênio (H2O2) 10% em tampão fosfato- salina (PBS) por 24h. Após esse procedimento, as retinas foram lavadas várias vezes em PBS e tratadas com uma solução de Hialuronidase (510 UI/ml) em PBS por 30 minutos (37ºC) para retirar o humor vítreo. A recuperação antigênica do tecido foi obtida em tampão borato 0,2M pH 9 (70°C) por 60 minutos, seguida de três lavagens em PBS por 5 min. cada. Foi feita inativação da peroxidase endógena (100 µl metanol + 100 µl H2O2 30% + 800 µl de PBS) durante 15 minutos, seguida de três lavagens em PBS por 5 min. cada e uma lavagem em PBS + Triton X-100 a 5% por 30 minutos. Subsequente a três lavagens em PBS (5 minutos cada), a preparação foi incubada em 10% de soro normal (compatível com os respectivos anticorpos) em PBS + triton X-100 0,3% (PBSTX) por 2 horas, seguida pelo anticorpo primário e 1% de soro normal por 5 dias (4º C). Após várias lavagens em PBS o tecido foi incubado no anticorpo secundário biotinilado durante três dias (4ºC) e em seguida, lavado e incubado no complexo Avidina - Biotina - Peroxidase (1:200, kit ABC Vector) por três dias (4º.C). Todos os anticorpos foram diluidos em PBSTX. A visualização do anticorpo foi obtida utilizando-se
64 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (2,5 mg de DAB em 10 ml de tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 por 20 minutos com agitação contínua, acrescida de H2O2 0,3%). Após a reação, as retinas foram lavadas em PBS, feitos alguns pequenos cortes periféricos para aplainar e possibilitar a montagem sobre lâminas de vidro gelatinizadas, mantendo a orientação naso-temporal e súpero-inferior. Após um período de 24h à temperatura ambiente, verificando que as retinas estavam bem aderidas às lâminas, as mesmas foram desidratadas em soluções crescentes de álcool, diafanizadas em xilol e montadas em lamínula, usando Entellan (Merck).A imunohistoquímica realizada nas secções verticais foi semelhante a das montagens planas, exceto pelos períodos de incubação mais curtos para o anticorpo primário (24 h) secundário e ABC (1h) e omissão do tratamento com hialuronidase, peroxidase endógena e triton X-100 5%.
Dupla marcação
Em secções verticais foram realizadas duplas marcações para investigar colocalização de: GABA e tirosina hidroxilase (TH); Parvalbumina (PV) e colina acetiltransferase (ChAT), calbindina (CB) e calrretinina (CR), CB e TH, opsinas S e L/M. Neste caso, as secções foram incubadas inicialmente numa solução de bloqueio contendo 5% de albumina bovina (BSA), 0,3% triton X-100 por 60 min e simultaneamente então com os anticorpos primários por 24 h a 4°C. As secções foram lavadas em PB e incubadas com os secundários fluorescentes também simultâneamente, por 4 h. Após lavagens em PB as lâminas foram montadas em glicerol 40% em PB e analisadas utilizando um microscópio de epifluorescencia (Leica, DM LB)
No caso das duplas marcações com anticorpos primários obtidos num mesmo animal (opsina S - L/M), foi inicialmente feita a incubação em um anticorpo primário individual e reação com DAB, e após a marcação com DAB, os cortes ficaram 30 minutos no tampão
65 glicina pH 2,2. Foram então lavados com PB e incubados no outro anticorpo primário seguido pelo fluorescente.
Foi feita uma dupla marcação também numa montagem plana para investigar colocalização de CB em células dopaminérgicas. Todos os passos antes descritos para as montagens planas foram mantidos, alterando apenas a partir da incubação dos anticorpos primários. Estes foram incubados simultaneamente. Anti-TH diluição 1:500 + anti-CB 1:500 + 1% de soro normal em PBSTX durante 5 dias (4º C). Após 3 lavagens de 5 minutos cada em PBS, o tecido foi incubado nos anticorpos secundários Fluorescein anti-rabbit e TritC anti- mouse 1:200, durante 3 dias (4º C). Após lavagens em PBS o tecido foi colocado numa lâmina gelatinizada. Após secagem, colocado em glicerol 40% em PB, coberta com lamínula e analisada utilizando um microscópio de epifluorescencia (Leica, DM LB)
Análise dos dados Células dopaminérgicas
Para a distribuição das células dopaminérgicas, seis montagens planas foram usadas para medir a área da retina, densidade celular espacial total, gradiente centro-periferia e tamanho do corpo celular. Análise da distribuição topográfica das células dopaminérgicas foi obtida a partir da obtenção de imagens digitalizadas de campos adjacentes e sucessivos ao longo de toda a extensão retiniana de modo a permitir uma contagem de todas as células dopaminérgicas. Entre as seis retinas examinadas, foram obtidas de 227 a 312 janelas de amostragem de 0,8 mm2. Os valores obtidos em cada janela foram transferidos para um mapa da retina em papel milimetrado, de modo a representar a distribuição numérica das populações de células dopaminérgicas
Para caracterizar as populações de células dopaminérgicas presentes ao longo de toda a extensão retiniana, foram analisados parâmetros morfométricos, tais como tamanho e
66 diâmetro do corpo celular, além de parâmetros relativos ao padrão de estratificação na INL e intensidade de imunorreatividade em diferentes excentricidades. As análises de corpo celular foram realizadas a partir de imagens digitalizadas obtidas através de video camera (Nikon DXM1200) acopladas ao microscópio, objetivas de 100 X com óleo de imersão. Para as medidas de área, diâmetro e contagens de células, foi utilizado o software Image J 1.45s, (National Institutes of Health, USA).
Fotorreceptores
Análise da distribuição topográfica de cones verde/vermelho e azul foram obtidas de campos de amostragem de 138 x 110 µm, a cada 0,5mm através de toda a extensão da retina. Em média 510 ± 96 janelas de amostragem foram analisadas em 6 retinas (3 montagens planas para cones S e 3 para cones L) usando objetivas de 100 X em óleo de imersão. Imagens digitais dos campos de amostragem foram obtidos via video camera (Nikon DXM1200) acoplada a um microscópio Olympus (BX41). Para contagens de células, foi utilizado o software Image J 1.45s, (National Institutes of Health, USA). Todos os dados foram transferidos para mapas em papel milimetrado e convertido para células/mm2.
Células ganglionares - Marcação de Nissl.
Quatro montagens planas foram coradas com cresil violeta para análise da distribuição topográfica de células ganglionares, de acordo com um protocolo previamente descrito (Oliveira et al., 2006). Foram obtidas imagens digitalizadas da GCL a cada mm de distância por toda a extensão da retina, com o uso de um microscópio óptico Olympus BX50, (objetiva de 40 X) acoplado a uma video camera (Nikon DXM1200). Para a contagem das células, foi utilizado o software Image J 1.45s (National Institutes of Health, USA).
67 Todos os dados foram transferidos para mapas em papel milimetrado e convertido para células/mm2. Foram obtidas entre 169 e 176 janelas de amostragem por retina examinada. Todos os neurônios observados na GCL foram contados, de acordo com o critério estabelecido por Stone (1981). Avaliação da densidade e número total das células se fez por um método de integração considerando a área ocupada por linhas de isodensidade e o valor de densidade de cada uma das linhas.
68
Tabela de anticorpos
Anticorpos primários Diluição Anticorpos secundários Diluição
rabbit polyclonal anti-blue opsin (Millipore)
1:200 W 1:1000 SV
Goat-anti-guinea pig (Jackson Immuno Research Lab)
1:1000 Rabbit monoclonal anti- -
tubulin EP1569Y (Millipore)
1:200 Goat-anti-Rabbit (Vector) 1:200
mouse monoclonal anti- calbindin D (CB) C-8666 (Sigma)
1:500 Donkey-anti-goat (Jackson
Immuno Research Lab)
1:1000
rabbit policlonal anti- calretinin (CR) AB 5054 (Chemicon)
1:1000 Donkey-anti-mouse (Jackson
Immuno Research Lab)
1:1000
goat policlonal anti-Choline acetyltransferase (ChAT) (Millipore)
1:500 Goat-anti-mouse (Jackson Immuno Research Lab)
1:1000
guinea pig anti-GABA (Protos Biotech Inc.)
1:500 Donkey anti-rabbit (Jackson Immuno Research Lab)
1:1000 mouse monoclonal anti-
neurofilament [NF-01] to 200kD - ab7795 (abcam)
1:500 Goat-anti- rabbit biotinylated
(Jackson Immuno Research Lab)
1:1000
mouse monoclonal anti- Parvalbumin (PV) P-3171 (Sigma)
1:1000 Alexa fluor 594 goat anti- mouse
1:200
mouse monoclonal anti- Protein Kinase C P7504 (Sigma-Aldrich)
1:2000 Alexa fluor 594 donkey anti- mouse
1:200
rabbit polyclonal anti- red/green opsins (Millipore)
1:200 W 1:2000 SV
Fluorescein goat anti-rabbit (Vector)
1:200 Anti-rodopsina 1:100 Fluorescein goat anti-guinea
pig IgG (Vector)
1:200 rabbit polyclonal anti-TH
AB152 (Millipore)
1:500 Fluorescein Trit C donkey anti- mouse (Jackson Immuno Research Lab)
1:200
Fluorescein Trit C donkey anti- goat (Jackson Immuno
Research Lab)
1:200
Rhodamine-conjugated 546 donkey anti-rabbit IgG (Jackson Immuno Research Lab)
1:200
Rhodamine Fit C donkey anti- mouse
1:200 Alexa fluor 488 goat anti-
rabbit
1:200 Alexa fluor 488 goat anti-
mouse
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RESULTADOS