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FRANCISCO GILBERTO OLIVEIRA
ASPECTOS ANATÔMICOS DO OLHO E NEUROQUÍMICOS DA
RETINA DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Doutor em Psicobiologia.
NATAL
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FRANCISCO GILBERTO OLIVEIRA
ASPECTOS ANATÔMICOS DO OLHO E NEUROQUÍMICOS DA
RETINA DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Doutor em Psicobiologia.
Área de concentração: Psicologia Fisiológica
Orientadora: Profa. Dra. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa
Co-Orientadora: Profa. Dra. Belmira Lara da Silveira Andrade da Costa
NATAL
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AGRADECIMENTOS
À Professora Dra. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa pela orientação, serenidade, paciência, ensinamentos, dedicação e amizade, muito obrigado pela oportunidade.
À Professora Dra. Belmira Lara que dedicou muito do seu pouquíssimo tempo, colaborando com sugestões, protocolos, correções, idéias e muita paciência e boa vontade.
Ao Professor Jeferson, com quem tive o primeiro contato em Natal e desde então se prontificou a colaborar no que fosse necessário. Fez parte da minha seleção inicial e por força de compromissos não pode participar da banca. Muito grato pela amizade, pelos ensinamentos e pela disponibilidade sempre. Receba cordiais saudações rubronegras.
Aos Professores Dr. Fabricio e Dra. Patricia que gentilmente aceitaram nosso convite, largaram seus afazeres e vieram de Recife e do Rio de Janeiro respectivamente, contribuir com seus conhecimentos e sugestões para o aprimoramento do nosso trabalho.
Ao Professor Dr. Daniel pela colaborado com o nosso trabalho desde o seu início, tendo contribuído com sugestões na seleção inicial, na qualificação e agora como membro da banca.
Ao Professsor Dr. Judney que também compõe a banca e que no dia-a-dia do laboratório sempre colaborou com o que foi preciso.
Ao Professor Dr. Expedito, chefe do Departamento de Morfologia, pela parceria, amizade, conselhos e disponibilidade.
Ao incentivo, apoio e amizade de todos os companheiros do Laboratório de
6 À Miriam Regina Celi, técnica do laboratório de Neuroanatomia pela grande
colaboração e amizade.
Ao Departamento de Morfologia por todo o suporte necessário.
Aos companheiros do laboratório de Neurofisiologia da UFPE, que me deram sempre muito suporte quando das minhas estadas em Recife: Alinny, Aluizio, Davi, Eraldo, Igor, Pablo, Priscila, Rafael, Renata e Ricielle
Aos Professores que compartilham o laboratório de Neurofisiologia da UFPE, Ângela, Catarina, Marcelo, Reginaldo, e Valdir, pela colaboração.
À Socorro, Melina e Lourdinha, pelo auxílio técnico no laboratório de histologia da UFRN.
À Zenira Cosme Xavier pela assistência técnica no laboratório de Neurofisiologia da UFPE.
A minha família que me apoiou, incentivou, motivou e proporcionou o suporte necessário.
Aos amigos Ângela e Cicero pela motivação permanente e grande incentivo. Ao amigo Davis Landim pela colaboração na elaboração das figuras.
Aos funcionários e Professores do Departamento de Morfologia pela disponibilidade apoio e amizade.
Ao Instituto Internacional de Neurociências de Natal pelo treinamento em microscopia e utilização do miscroscópio confocal.
Ao Instituto do Cérebro de Natal pela utilização do microscópio confocal.
Aos Laboratório de Bioquímica da UFRN e de Citogenética da UFPE pela utilização do microscópio de imunofluorescência.
7 À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pela bolsa de doutorado, demais órgãos de fomento que deram suporte a pesquisa: CNPq,
FAPERN, FINEP e a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
8 Diz o preguiçoso: "amanhã farei".
Exclama o fraco: "amanhã, terei forças".
Assevera o delinqüente: "amanhã, regenero-me".
É imperioso reconhecer, porém, que a criatura, adiando o esforço pessoal, não alcançou,
ainda, em verdade, a noção real do tempo.
Quem não aproveita a bênção do dia, vive
distante da glória do século.
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RESUMO
10 uma densidade aproximadamente 10 vezes menor dos que os cones L, com diferentes graus de organização espacial. Outras populações neuronais da retina do mocó também foram detectadas em secções verticais com marcadores específicos. Análise comparativa das características anatômicas do olho do mocó sugere que o mesmo foi projetado para adquirir maior sensibilidade à luz, em detrimento da nitidez da imagem, compatível com uma visão em condições mesópicas. Adicionalmente, a distribuição dos 2 subtipos de células dopaminérgicas em uma faixa naso-temporal na retina superior parece adequada para um ganho em sensibilidade, coerente com as características de um animal com padrão de atividade predominantemente crepuscular.
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ABSTRACT
12 suggest that it was designed to acquire higher sensitivity to light, at expense of image sharpness, compatible with a vision at mesopic conditions. Additionally, the distribution of the 2 subtypes of dopaminergic cells in a naso-temporal band in the dorsal retina seems suitable to a gain in sensitivity, coherent with an animal with predominantly crepuscular activity pattern.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
1.1 Aspectos anatômicos e eco-fisiológicos da visão 14
1.2 O processamento visual e a estrutura interna da retina 17
1.3 O epitélio pigmentar 20
1.4 Fotorreceptores 21
1.5 Células horizontais 24
1.6 Células bipolares 27
1.7 Células amácrinas 29
1.8 Células ganglionares 33
1.9 Opsinas na evolução de mamíferos 36
1.10 Sistemas paralelos de transmissão dos níveis de intensidade luminosa:
vias ON e OFF
38
1.11 A retina como oscilador e os ritmos da retina 41
1.12 Sistemas fotossensíveis na retina interna - Papel da melanopsina 46
1.13 Importância da dopamina para a transição claro/escuro 51
1.14 O mocó como modelo experimental 55
2 OBJETIVOS 59
3 MATERIAIS E MÉTODOS 60
4 RESULTADOS 69
4.1 Primeiro artigo 70
4.2 Segundo artigo 93
4.3 Terceiro artigo 124
4.4 Outros resultados 143
5 CONCLUSÕES 147
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 148
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos anatômicos e eco-fisiológicos da visão.
O estudo das estruturas anatômicas que evolutivamente foram desenvolvidas por diferentes animais objetivando a captação de luz e sua utilização como indicativo do ambiente em sua volta, nos mostra uma imensa gama de tamanhos, formatos e princípios ópticos envolvidos, fornecendo evidências de que a óptica fisiológica é relativamente plástica, segundo palavras de Silveira (1985).
Inúmeros mecanismos adaptativos ao nicho temporal estão presentes no sistema visual de muitos vertebrados. Além de modificações nas dimensões e desenho ocular e na distribuição de células da retina, estes mecanismos envolvem também alterações na organização dos circuitos neuroquímicos relacionados com a resolução ou detecção de mudanças nos níveis de iluminação (Land & Nilsson, 2008), enquanto a simetria de como o ambiente é percebido é refletido no arranjo das células retinianas.
A qualidade do sistema óptico pode limitar a quantidade de informações que serão disponibilizadas para o cérebro, uma vez que a retina só pode codificar as informações que estão presentes nas imagens. Entretanto, a forma, o tamanho da pupila e o ajuste de foco são também particularmente importantes se um animal tem olhos adaptados para usar sob condições fotópicas, mesópicas ou escotópicas (Malmström & Kröger, 2006).
15 profundas influências dos hábitos e estilos de vida nos mais diversos habitats (Walls, 1942; Hughes, 1977; Peichl, 2005; Collin, 2008).
Nessa perspectiva, o olho funciona como canal de entrada, sendo um órgão bastante complexo e do ponto de vista funcional, constituído por dois sistemas, que apesar de distintos, possuem funções complementares: o primeiro, formado por um sistema óptico capaz de dirigir a penetração dos raios luminosos, tornando possível a formação de imagens do ambiente e o segundo, por um sistema sensorial, capaz de extrair informações da imagem formada.
Fazem parte do sistema óptico, os elementos refrativos, as estruturas para acomodação, a pupila e a hemisfera posterior do olho.
O sistema sensorial é representado pela retina, que organizada radialmente em diferentes camadas morfofuncionais, é responsável pela recepção, análise inicial e transmissão da informação para o encéfalo.
Diferentemente de outros órgãos sensoriais, a retina é derivada de uma porção do mesmo ectoderma neural que origina o resto do sistema nervoso central, com o qual mantém a conexão após migrar para a periferia (Graw, 1996). Além disso, a organização sináptica da retina é similar àquela de outras regiões do cérebro, apresentando uma grande complexidade funcional dentro de uma aparente simplicidade estrutural (Masland & Raviola, 2000). Sobre esse tecido neural é projetada uma imagem do mundo externo, invertida e focada como numa câmera fotográfica.
16 óptica, é transformada em impulsos elétricos, ou linguagem neural, através de uma rede neuronal que se inicia a partir dos fotorreceptores e, através da participação direta das células bipolares e da modulação feita por interneurônios (células horizontais, amácrinas e interplexiformes), ativa as células ganglionares que conduzirão as informações para os núcleos visuais encefálicos via nervo óptico (Wässle & Boycott, 1991; Wu, 1992; Reichenbach & Robinson, 1995; Collin, 2008).
A análise topográfica da densidade das células ganglionares da retina proporciona informações valiosas sobre a presença de especializações definidas pelo padrão de variação da densidade. Estudos da topografia dessas especializações fornecem informações sobre a localização de áreas de maior acuidade visual, e de como elas se relacionam com regiões do campo visual de interesse para os hábitos de vida de cada animal (revisões em Hughes, 1977; Ali, 1981; Collin, 1999, 2008). Medidas de espaçamento celular em regiões de pico de densidade de fotorreceptores e de células ganglionares também possibilitam estimar o poder de resolução espacial de cada especialização (Rolls & Cowey, 1970; Rodieck, 1973; Frisen & Frisen, 1976; Collin & Pettigrew, 1988a, b; Collin & Pettigrew, 1989; Shand et al., 2000; Miyazaki et al., 2002).
Dentre as especializações retinianas definidas pela distribuição das células ganglionares destacam-se a fóvea e a area centralis. Ambas são regiões caracterizadas pela alta densidade celular em relação a outras regiões da retina. A fóvea caracteriza-se por ser uma depressão do tecido neural que se origina do afastamento centrífugo das camadas mais internas de modo que a luz incide diretamente sobre os fotorreceptores. A area centralis é uma região onde ocorre aumento concêntrico na densidade das células retinianas com um pico de densidade pontual (Duke-Elder, 1958; Hughes, 1977; Collin, 1999).
17 baixa nos valores de densidade celular em um dos meridianos da retina, que foi designada de faixa visual ou "visual streak". Chievitz (1889, 1891) e Slonaker (1897) apud Collin & Pettigrew, 1988b, foram os primeiros a descrever, em vertebrados, uma região da retina em forma de faixa. Estas regiões em forma de faixa muitas vezes estão associadas com um espessamento da retina frequentemente observável sem o uso de microscópio óptico. Alguns autores especulavam que estas áreas eram regiões que permitiam um poder de resolução maior (Munk, 1970 apud Collin, 1999). Contudo, Walls (1942), sugeriu que estas poderiam ser também áreas de sensibilidade aumentada.
Postulou-se então, que estas zonas em forma de faixa permitem ao animal esquadrinhar o horizonte sem a necessidade de movimentos oculares significativos, os quais são necessários para explorar uma imagem visual quando uma area centralis ou uma fóvea estão presentes (Rowe & Stone, 1977; Tancred, 1981; Collin & Pettigrew, 1988a; Collin, 1999). A presença de uma faixa visual também possibilita a percepção de movimentos com um limiar de sensibilidade menor. Em várias espécies de vertebrados, as especializações retinianas em forma de faixa possuem uma representação desproporcionalmente grande no tecto óptico, o que ressalta a sua importância funcional (Jacobsen, 1962; Heric & Kruger, 1965; Bravo & Pettigrew, 1981; Ito & Murakami, 1984; Collin & Pettigrew, 1988b; Collin, 1999)
1.2 O Processamento Visual e a estrutura interna da Retina
18 Essa organização em rotas paralelas é feita por fibras do tracto óptico que terminam em diferentes áreas subcorticais, tais como complexo geniculado lateral, pretecto, colículo superior, núcleos do sistema óptico acessório, núcleo supraquiasmático e outras. Estas áreas desempenham diferentes papéis no processamento visual e recebem informações de diferentes tipos de células ganglionares retinianas (Wässle, 2004).
A retina de mamíferos, com uma espessura de aproximadamente 200 micrômetros, contém cerca de 55 tipos morfológicos de células distribuídas entre as categorias de células fotorreceptoras, células bipolares, células horizontais, células amácrinas/interplexiformes e células ganglionares (Masland & Raviola, 2000; Masland, 2001a, b; Wässle, 2004). Seus corpos celulares, prolongamentos e conexões sinápticas estão arranjados de forma laminar, podendo-se distinguir na retina as seguintes camadas, a partir da superfície externa: (1) o epitélio pigmentar (componente não neural) (PE); (2) a camada dos fotorreceptores (PL), que contém os segmentos externos e internos dos cones e bastonetes; (3) a camada nuclear externa (ONL), que contém os corpos celulares dos cones e bastonetes; (4) a camada plexiforme externa (OPL), que contém os terminais axônicos dos cones e bastonetes e os dendritos das células horizontais e bipolares; (5) a camada nuclear interna (INL), que contém os corpos das células horizontais, bipolares e amácrinas; (6) a camada plexiforme interna (IPL), que contém os terminais axônicos das células amácrinas e bipolares e dendritos das células ganglionares; (7) a camada de células ganglionares (GCL), que contém os corpos das células ganglionares e amácrinas deslocadas e (8) a camada de fibras ópticas (OFL), representada pelos axônios das células ganglionares constituindo o nervo óptico, que se projeta para diversas áreas como acima descrito.
19 máximo de pontos luminosos disponíveis na retina, as células ganglionares limitam a proporção dessas informações enviando-as centralmente. O conhecimento da posição dos olhos na cabeça e da distribuição de células retinianas possibilita identificar adaptações de cada espécie ao seu campo visual, o qual é peculiar para cada estilo de vida dentro do nicho ecológico que ele ocupa (Collin, 2008). A distribuição topográfica das células ganglionares em cada espécie examinada vem a ser única, “uma impressão digital”, que reflete a simetria de como o mundo é percebido e pode explicar comportamentos visuais, tais como movimento dos olhos e adaptações para um aumento de resolução no campo visual ao longo de vários eixos (revisão em Hughes, 1977; Collin, 1997; 1999; 2008).
Um subtipo específico de células ganglionares projeta diretamente para o núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo (Moore et al., 1995; Provencio et al., 1998), considerado o principal marcapasso circadiano em mamíferos, não estando envolvidas com o sistema formador de imagens. Investigações recentes confirmam que estas células ganglionares podem ser diretamente fotossensíveis podendo atuar como fotorreceptores circadianos (Bellingham & Foster, 2002; Hannibal et al., 2002; Paul et al., 2009).
20 As células de Müller, controlando a concentração de substâncias neuroativas no espaço extracelular, podem modular significativamente a atividade neuronal. Uma redução na captação de glutamato ou GABA, pode levar a um aumento da transmissão sináptica. O acúmulo de K+ no espaço extracelular, resulta de uma redução na remoção de K+ pelas células de Müller, o que leva a uma excitabilidade neuronal. Variações no pH também podem modular a atividade neuronal. Mesmo a pequena despolarização induzida por acidificação extracelular gerada pelas Células de Müller podem ter um efeito inibitório dramático na transmissão sináptica. Por exemplo: uma acidificação de 0,05 unidades do pH na retina da Salamandra, produz uma redução de 24% na transmissão sináptica entre fotorreceptores e neurônios de segunda ordem (Barnes et al., 1993; Newman & Reichenbach, 1996).
É interessante notar que a luz atravessa todas essas camadas a partir da camada de células ganglionares, até alcançar os fotorreceptores.
1.3 O Epitélio Pigmentar
21 disponível para ser reutilizado pelos fotorreceptores. Considerando que a luz danifica segmentos externos dos fotorreceptores por meio da fotoxidação de lipídios, lipoproteínas e outras moléculas, existe uma necessidade contínua de renovação dos segmentos externos, e é exatamente o que ocorre. A cada dia, os segmentos externos adicionam cerca de 10% de comprimento na sua base e o epitélio pigmentar remove de sua porção mais apical (Bharti, et al., 2010).
1.4 Fotorreceptores
22 cones são menos sensíveis à penumbra, mas são sensíveis à cor. Estudos comparativos destacam que além do pigmento específico de bastonetes, a rodopsina, há quatro diferentes famílias de pigmentos de cones, espectralmente distintas: uma classe sensível ao comprimento de onda longa a média (L), maximamente sensível a região do espectro que vai do verde ao vermelho (490 – 570 nm), uma classe sensível ao comprimento de onda média (M) que corresponde ao verde (480 – 535 nm), uma classe sensível ao comprimento de onda curta (S) que compreende do azul ao violeta (410 – 490 nm), e uma segunda classe S, de onda curta sensível ao ultra-violeta (355 – 440 nm). Embora alguns pássaros e peixes possuam até 5 tipos de cones, entre os mamíferos, apenas humanos, alguns macacos e marsupiais australianos são tricromatas, ou seja, possuem três classes espectrais de cones. (Jacobs, 2002; 2008; Peichl, 2005; Bowmaker, 2008).
23 transdução da luz leva a uma redução do GMPc e assim à hiperpolarização da célula. Fotorreceptores são sensíveis a pequenas alterações na iluminação. Alterações prolongadas ou lentas da iluminação levam à adaptação à luz, que é regulada pelas alterações da concentração de cálcio. Bastonetes adaptados ao escuro são tão sensíveis à luz, que podem detectar um único fóton. Sob a detecção de um fóton, o potencial de membrana hiperpolariza, e diminui a liberação de glutamato em suas sinapses.
Os cones respondem aos estímulos luminosos com hiperpolarização graduada e liberam o glutamato no seu terminal sináptico especializado denominado de pedículo. A liberação do glutamato é alta em condições de escuro e é reduzida pela luminosidade (Haverkamp et al., 2000).
O pedículo de cone é provavelmente a sinapse mais completa no sistema nervoso central. Contém aproximadamente entre 20 e 50 fitas, e cada uma delas é flanqueada por vesículas sinápticas. Invaginações nessas tiras possibilitam que sejam inseridos dendritos de células horizontais e de células bipolares de cone do tipo ON. Os contatos das células bipolares de cone do tipo OFF, são localizados na base dos pedículos de cones (Wässle, 2004). Cada pedículo de cone faz mais de 500 contatos. Embora haja um número menor de células pós- sinápticas, cada uma delas recebe múltiplos contatos. Dois tipos de células horizontais e oito tipos de células bipolares de cones estão sempre envolvidos com cada pedículo de cone. Dessa forma, na primeira sinapse da retina, a informação luminosa é distribuída para múltiplas vias (Wässle, 2004).
24 Esses acoplamentos possibilitam que seja aumentada a resposta ao estímulo luminoso (Lamb et al., 1976).
Os terminais sinápticos dos bastonetes contêm apenas uma zona ativa com uma sinapse em fita e uma invaginação. A invaginação apresenta dois tipos de processos pós sinápticos: dendritos de células horizontais e dendritos de células bipolares. As espículas dendríticas das células horizontais penetram profundamente na invaginação dos bastonetes para aproximar seus receptores glutamatérgicos do local de liberação das vesículas sinápticas. Os dendritos de duas ou mais células bipolares penetram na invaginação, mas estão longe do local de liberação das vesículas sinápticas (Rao-Mirotznik et al., 1995).
Dos terminais sinápticos de cones e bastonetes, os sinais são transferidos para as células bipolares e células horizontais. As células horizontais proporcionam interações laterais na OPL. Um tipo de célula bipolar associada a bastonetes e pelo menos nove tipos de células bipolares associadas cones, transferem os sinais luminosos para a IPL, onde estes sinais podem interagir com dendritos de células amácrinas e células ganglionares (Wässle, 2004).
O desenvolvimento de anticorpos contra opsinas de bastonetes e cones abriu o caminho para identificar a população de bastonetes e as subpopulações de cones, possibilitando estudar as suas distribuições através da retina. Mesmo assim, é importante destacar que apenas os anticorpos contra a opsina S marcam seletivamente os segmentos externos dos cones que a contêm, uma vez que, dada a proximidade estrutural entre as opsinas de cones M e L, não foi possível desenvolver anticorpos seletivos para cada um deles (Ahnelt & Kolb, 2000).
1.5 Células horizontais
25 cones ou bastonetes. Entretanto, alguns roedores possuem apenas um tipo e já tem sido proposto um terceiro tipo em alguns animais (Masland, 2012). A despeito de algumas variações em sua morfologia, as células horizontais parecem seguir um plano bastante simples (Müller & Peichl, 1993; Peichl et al., 1998). Elas promovem feedbacks inibitórios para cones, bastonetes e possivelmente para os dendritos das células bipolares, embora ainda haja controvérsia (Hermann et al., 2011). A interpretação principal desta função é que ela fornece um mecanismo de controle de ganho local para a retina. As células horizontais são moderadamente espalhadas lateralmente, se acoplam por junções comunicantes e medem o nível médio de iluminação que cai sobre uma região da superfície da retina. Elas então subtraem um valor proporcional de saída dos fotorreceptores, o que serve para manter o sinal de entrada para a circuitaria da retina interna dentro de uma determinada faixa, o que vem a ser uma função extremamente útil no mundo natural, onde uma cena pode conter objetos individuais com brilhos que variam em várias ordens de magnitude. O sinal que representa o brilho mais intenso poderia trazer um problema para a retina, da mesma forma como o brilho de um objeto numa sala escura satura o filme de uma câmera, impossibilitando fotografar o objeto brilhante e ao mesmo tempo a parte mais escura (Masland, 2012).
26 Adicionalmente, as células horizontais ajustam a resposta do sistema para um nível total de iluminação – elas medem a iluminação através de um campo bastante amplo e dele subtraem o sinal que é transmitido para a retina interna acerca de uma imagem local. Com efeito, isto reduz a redundância do sinal transmitido para a retina interna. A luminância média através de uma grande região da retina é compartilhada por muitos cones e contém pouca informação. Quando um estímulo local ocorre, ele excede ou cai abaixo da média; a ocorrência deste evento local é o principal sinal transmitido para a retina interna (Masland, 2001). Bastonetes recebem um tipo separado de retroalimentação de células horizontais, realizado por uma especialização de uma célula horizontal que contata cones (a célula horizontal do tipo b/H2). Um processo axonal de uma mesma célula que contata cones contata também bastonetes a uma maior distância do seu soma (Nelson et al., 1975). O sistema de retroalimentação de bastonetes é assim isolado do sistema de cones, sensivelmente porque as faixas de brilho cobertas por bastonetes e cones são bastante diferentes. Esta pode ser uma das consequências da evolução tardia dos bastonetes, o que lhes permite ter uma retroalimentação independente pelas células horizontais, sem a criação de um outro tipo de célula horizontal (Masland, 2001a, b).
27 As células horizontais se comunicam umas com as outras através de junções comunicantes. A força desta comunicação varia em estados funcionais e é modulada pela dopamina secretada por células amácrinas (Weiler et al., 2000).
1.6 Células bipolares
É tarefa das células bipolares transferir as informações recebidas dos fotorreceptores para as células amácrinas e ganglionares. Modernas técnicas anatômicas, sustentadas por evidências fisiológicas, indicam que atualmente existem 12 diferentes tipos de células bipolares (Masland, 2012), sendo uma especificamente para bastonetes e onze que recebem informações primárias apenas de cones na retina de mamíferos (Wässle et al., 2009). A exceção fica por conta de um tipo de célula bipolar especializada, que contata seletivamente cones sensíveis a um comprimento de onda curto, os cones S. Simetricamente, algumas células bipolares evitam os terminais de cones azuis. De qualquer modo, a regra central que predomina na organização funcional e estrutural da retina é que cada célula bipolar contata todos os terminais de cones dentro da propagação da arborização dendrítica. Essa é uma regra geograficamente simples (Masland, 2012).
28 De acordo com sua resposta à luz, as células bipolares podem ser divididas em ON e OFF (Kolb & Nelson, 1995; Euler et al., 1996; Hartveit, 1997; DeVries, 2000). Células bipolares ON respondem mais fortemente se o estímulo é mais brilhante do que o background e células bipolares OFF respondem mais fortemente se o estímulo é mais escuro que o background. Os axônios das células bipolares ON e OFF terminam em diferentes níveis na IPL, que pode ser dividida em 5 subcamadas. Os terminais axonais das células do tipo ON são mantidos na metade mais interna da IPL, enquanto as bipolares OFF tem seus terminais na metade mais externa (Famiglietti et al, 1977; Nelson et al., 1978).
Essa dicotomia funcional é o resultado da expressão de diferentes receptores glutamatérgicos (GluRs) nas sinapses entre fotorreceptores e dendritos de células bipolares (Nomura et al., 1994; Brandstätter et al., 1997; DeVries, 2000; Hack et al., 1999, 2001; Haverkamp et al., 2001; Wässle et al., 2009).
Similarmente, a distinção entre células bipolares sustentadas e transientes é causada pelas expressões "rápida ou lenta" inativação dos receptores glutamatérgicos (Awatramani & Slaughter, 2000; DeVries, 2000). Isso cria quatro classes de células bipolares: ON-sustentada, ON-transiente, OFF-sustentada e OFF-transiente. Os diferentes tipos estruturais/moleculares das células bipolares mostram uma grande diversidade de formas de onda de resposta, em resposta à luz. Além da simples dimensão tônica versus fásica, estas respostas apresentam complexas misturas de ambas (Wu et al., 2001).
29 Além da divisão em ON e OFF, a maior parte das células bipolares é classificada como células bipolares difusas (DB). São células que realizam entre e 5 e 10 sinapses com vários cones, e possuem uma arborização dendrítica e axonal bastante ampla. As células DB1, DB2 e DB3 são células bipolares do tipo OFF, enquanto as células DB4, DB5 e DB6 são células bipolares do tipo ON (Cohen & Sterling, 1990a; b; Boycott & Hopkins, 1991; Boycott, Wassle, 1991; Calkins et al., 1994; Calkins & Sterling, 1996).
As células bipolares de bastonetes recebem informações dos bastonetes e conduzem essas informações para um tipo de neurônio denominado célula amácrina AII, a qual por sua vez realiza sinapses com terminais de células bipolares de cones e estes com células ganglionares. Provavelmente esse arranjo seja decorrente da evolução tardia dos bastonetes (Masland, 2001). Assim sendo, a via de bastonetes utiliza a circuitaria de cones pré-existente, de tal forma que o complexo circuito da retina interna não precisou ser reinventado para a via de bastonetes (Masland, 2001).
1.7 Células amácrinas
30 explicar disparos sincronizados entre as células ganglionares. Entrada compartilhada de uma célula amácrina comum tende a produzir disparo uníssono das células ganglionares. A correlação cruzada é ampla, se mediada por sinapses químicas e mais limitada se mediada por junções comunicantes, sabidamente existentes entre células amácrinas e ganglionares (Vaney, 1994). Tem sido proposto que o disparo correlato entre células ganglionares representa uma forma de multiplicação de sinal, que poderia expandir a capacidade de condução da informação pelo nervo óptico (Masland, 2001a, b).
Muitas células amácrinas são neurônios sem axônios, e a falta de uma clara polaridade dificulta o reconhecimento de suas entradas e saídas. Por conta de suas múltiplas conectividades, elas são difíceis de conceituar. Elas retroalimentam as células bipolares que as dirigem, fazem sinapses com as células ganglionares e também com outras células amácrinas (Dowling & Boycott, 1966; Eggers & Lukasiewicz, 2011, Jusuf et al., 2005; Lin et al., 2000). Sua grande diversidade estrutural termina por desencorajar determinadas pesquisas, mas apesar de tudo, algum progresso está sendo feito, especialmente nos casos onde uma célula amácrina é estruturalmente distinta ou pode ser geneticamente marcada (Masland, 2012).
31 bastonete surgida filogeneticamente mais tarde utiliza a já existente rede de cones. Um grupo de células amácrinas catalogadas como A17 (Menger & Wässle, 2000) sustentam uma sinapse de retroalimentação recíproca sobre as células bipolares de bastonetes. Elas recebem informações de células bipolares de bastonete e imediatamente enviam de volta um sinal GABAérgico inibitório. Este retorno inibitório das células amácrinas GABAérgicas sobre os terminais axônicos das células bipolares é um importante fator que contribui para modificar a faixa dinâmica das células bipolares (Euler & Masland, 2000), aumentando a fidelidade da informação transmitida pelas células bipolares de bastonetes (Grimes et al., 2010; Sandell et al., 1989). Essa é a principal tarefa das células A17 e talvez a única, devendo-se considerar inclusive, que a atividade das células A17 são irrelevantes para eventos que ocorrem à luz do dia (Masland, 2012).
32 Há ainda as células amácrinas “starburst”. Estas células parecem estar intimamente
associadas com um circuito computacional particular. Elas arborizam em finos estratos dentro da camada plexiforme interna, onde fazem sinapses colinérgicas excitatórias sobre determinadas células ganglionares, notadamente aquelas particularmente sensíveis a estímulos em movimento. Por ação sobre as células ganglionares do tipo excitação e/ou inibição, considerando que estas células liberam acetilcolina e GABA (O’Malley et al., 1992), elas são importantes para selecionar direção (Yoshida et al., 2001; Masland, 2001a, b; Masland & Raviola, 2000; Wässle, 2004).
O corpo das células amácrinas pode estar localizado tanto na INL como na GCL. As células amácrinas localizadas na GCL são denominadas células amácrinas deslocadas, e podem ser facilmente distinguidas das células ganglionares por seu pequeno soma e pela ausência de axônios que projetam para o cérebro. A primeira evidência que células pequenas na GCL são neurônios e não células da glia foi apresentado por Hughes & Wieniawa-Narkiewicz (1980) para a retina de gatos. Desde então, a morfologia e padrão de arborização das células amácrinas deslocadas tem sido examinados: seis tipos de células amácrinas deslocadas foram identificadas na retina de rato (Perry & Walker, 1980), 11 tipos no porquinho da índia (Kao & Sterling, 2006), 4 na retina de gatos (Wässle et al., 1987a) e 11 tipos na retina de camundongos (Gustincich et al., 1997; Badea & Nathans, 2004; Lin & Masland, 2006).
33 proporção de neurônios da GCL que são células amácrinas difere de espécie para espécie. Correspondem aproximadamente a um terço na retina de coelho (Hughes & Vaney, 1980; Vaney, 1980) e salamandra (Zhang et al., 2004); 40% na retina de hamster (Linden & Esbérard, 1987); 50% na retina de rato (Perry & Walker, 1980), porquinho da índia (Kao & Sterling, 2006), esquilo (Abreu et al., 1993); e 75–80% na retina periférica de gato (Hughes & Wieniawa-Narkiewicz, 1980; Wässle et al., 1987a) e humana (Curcio and Allen, 1990). Na retina de camundongos, as células amácrinas correspondem a 59% dos neurônios na GCL (Jeon et al., 1998; Müller et al., 2007).
Várias observações sugerem que as células amácrinas deslocadas provavelmente têm papéis modulatórios no processamento visual. Células amácrinas com pequeno campo dendrítico podem estar envolvidas no caminho direto do fluxo de informações, enquanto as células com maiores campos dendríticos são moduladoras, com uma influência indireta na transmissão de informações (Masland, 1988). Assim, embora existam muitos diferentes tipos de células amácrinas na GCL, as células starbust representam a grande maioria (Vaney et al., 1981), novamente sugerindo um papel modulatório no processamento visual (Masland, 1988; Müller et al., 2007).
1.8 Células ganglionares
34 temporais (tônica ou fásica), tamanho do campo receptivo, sensibilidade de contraste e sua capacidade de detectar direção de movimento.
Atualmente, considera-se que ~20 tipos de células ganglionares cobrem a retina (Masland, 2012). A identificação dos diferentes tipos morfológicos, ocorre através do estudo com marcadores retrógrados que são injetados nos alvos encefálicos ou mesmo pela aplicação de marcadores seletivos para populações específicas. No gato por exemplo, 3% das células ganglionares possuem grandes corpos celulares, arborização dendrítica ampla e esparsamente ramificadas, são denominadas de células alfa, e são imunomarcadas contra neurofilamentos.
A ramificação dendrítica e a densidade das células alfa mostram uma relação inversa através da retina: a grande arborização dendritica e a baixa densidade celular ocorre nas regiões mais periféricas da retina enquanto na região central, há uma grande densidade celular com pequena arborização dendrítica.
35 de outros mamíferos, como cão, furão, coelho e camundongo (Peichl, 1991) e têm como prováveis homólogas na retina de primatas as células ganglionares parvocelulares (células P). As células tipo beta (ou P primata) correspondem ao tipo “brisk-sustained” ou células X dos fisiologistas (Wässle & Boycott, 1991). Células ganglionares parvocelulares são o tipo de célula ganglionar mais frequente na retina de primatas, correspondendo a cerca de 70–80% (Kolb & Marshak, 2003), e na retina central seus campos dendríticos são extremamente pequenos, de tal modo que elas contatam uma única célula bipolar parvocelular, a qual é conectada a um único cone (Kolb & Marshak, 2003). Dessa forma, elas representam o sistema de acuidade da retina de primatas e são as células ganglionares seletivas para cones L–M (Dassey, 1993; Wässle, 2004).
36 identificado através de imunoistoquímica (Lucas et al., 2001; Berson et al., 2002; Berson, 2003; Gooley et al., 2003).
Cada um dos tipos de células ganglionares provê cobertura completa da retina com suas árvores dendríticas, o que tem consequências importantes para o processamento visual na retina. Um feixe de luz projetado sobre a retina – após transdução nos fotorreceptores e transferência para a camada plexiforme interna pelas células bipolares – pode estimular pelo menos uma célula ganglionar de qualquer tipo. Como os diversos tipos de células ganglionares são dedicados a processar diferentes aspectos deste feixe de luz (contraste, tamanho, movimento, comprimento de onda e outros), a informação contida no feixe de luz é canalizada em canais paralelos (Wässle, 2004).
É interessante destacar que os dendritos dos diferentes tipos de células ganglionares estratificam em diferentes níveis da camada plexiforme interna, sem superposição. Dentro dos respectivos estratos elas encontram os terminais axônicos das células bipolares e os processos das células amácrinas que elas necessitam contactar. Embora na retina de primatas as células ganglionares do tipo magnocelular (M) e parvocelular (P) sejam predominates e representem juntas 80% do total, as demais células ganglionares também estão presentes, seguindo o padrão geral de mamíferos com vários tipos de células ganglionares (Masland, 2001a, b; Dacey et al., 2003; Wässle, 2004; Abbot et al., 2012).
1.9 Opsinas na evolução de mamíferos
37 subfamílias, as quais correspondem a uma classificação funcional que tem como parâmetro o tipo de proteína G acoplada a receptores. As subfamílias são as seguintes: a subfamília acoplada a transducina visual de vertebrados e a opsinas não visuais, a subfamília neuropsina, a subfamília da opsina encefalopsina, a subfamília da opsina melanopsina, acoplada a uma proteína Gq, a subfamília de opsinas acopladas a proteína Go, a subfamília peropsina e a subfamília fotoisomerase retinal. As subfamílias diversificaram inicialmente em deuterostômios (incluindo vertebrados) e protostômios (maioria dos invertebrados), sugerindo a existência de um ancestral comum animal para essas opsinas. As opsinas têm uma estrutura sete alças transmembrana similar aquelas de outras proteínas G acopladas a receptores de membranas, mas se distinguem por apresentarem um resíduo de lisina, que é um sítio de ligação da retina na sétima hélice. Evidências acumuladas sugerem que muitas opsinas atuam como pigmentos que ativam proteínas G, de forma dependente de luz tanto em sistemas visuais como não visuais, enquanto poucas servem como fotoisomerases, gerando o cromóforo usado por outras opsinas, e algumas opsinas têm função ainda desconhecida (Terakita, 2005).
38
1.10 Sistemas paralelos de transmissão dos níveis de intensidade luminosa: vias ON
e OFF
O primeiro estágio de processamento neuronal que percebe a informação de luz e extrai diferentes características, as quais são então processadas em paralelo e projetadas da retina em direção ao cérebro, é realizada por quatro principais tipos de neurônios: células horizontais, células bipolares, células amácrinas e células ganglionares. É tarefa das células bipolares projetar as informações dos fotorreceptores para as células ganglionares. A maioria dos contatos sinápticos na retina ocorre em duas camadas plexiformes. A camada plexiforme externa contém os prolongamentos das células fotorreceptoras, células bipolares e células horizontais, enquanto a camada plexiforme interna contém os prolongamentos de células bipolares, amácrinas e ganglionares. Assim, as células horizontais têm uma influência modulatória no nível das sinapses entre o fotorreceptor e as células bipolares (camada plexiforme externa), e as células amácrinas têm uma influência modulatória no nível das sinapses entre as células bipolares e as células ganglionares (camada plexiforme interna). Na via de bastonetes há células amácrinas AII interpostas entre as células bipolares de bastonete e as células ganglionares. Desta forma, as células na retina processam os sinais de um ou mais fotorreceptores resultando em pequenos ou grandes campos receptivos.
Um campo receptivo corresponde a uma região no espaço em que um estímulo de luz pode induzir uma resposta neuronal, que tanto pode ser um aumento (resposta “on”) como uma redução (resposta “off”) da freqüência de disparo do potencial de ação das células ganglionares (Tessier-Lavigne, 2000).
39 na sua zona de terminação, a qual é novamente nos pedículos de cone. Este arranjo sináptico foi denominado de tríade. Em primatas, cerca de 10 diferentes tipos morfológicos de células bipolares projetam da sinapse de cone para a camada plexiforme interna (Boycot & Wässle, 1999). Quatro delas são tipos de células bipolares “off” e seis delas são tipos de células bipolares “on”. Duas células bipolares de cone, uma “on” e uma “off”, são especialmente sensíveis à informação de contraste, outras duas são responsivas à porção verde-vermelho da luz, e uma é devotada à luz azul (Calkins et al., 1998). Além disso, há três tipos de células bipolares de cone especializadas em detectar informação direcional, ou seja, fluxo retiniano ou movimento (Berry II et al., 1999). Na via fotópica, células bipolares de cone fazem sinapses de cone em díades sobre dendritos de células ganglionares e amácrinas.
As células bipolares de bastonete não fazem sinapse diretamente sobre as células ganglionares, mas sobre dois tipos de células amácrinas, uma delas sendo a célula amácrina AII. As células amácrinas AII fazem sinapses inibitórias com células bipolares de cone “off” e
células ganglionares “off” e contactam sobre células bipolares de cone através de grandes
junções comunicantes. Desta forma, elas são neurônios que produzem sinais de polaridade oposta em células ganglionares “on” e “off” (Morgans et al., 2009; Shen et al., 2009). As vias clássicas são ON1 e OFF1. Na via ON1, bastonetes são hiperpolarizados pela luz e transferem
seus sinais para a invaginação de dendritos das células bipolares de bastonetes. Células de bastonetes expressam o receptor para glutamato mGluR6, provocando uma inversão do sinal na sinapse, sendo despolarizadas pela luz. Elas transferem seu sinal através de uma sinapse glutamatérgica (AMPA; α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) para células amácrinas AII. Células amácrinas AII formam junções comunicantes com os axônios
das células bipolares ON de cone, as quais por sua vez, fazem sinapse com as células
ganglionares ON. Na via OFF1, a via dos bastonetes para as células AII é idêntica a ON1,
40
axônios de células bipolares OFF de cones, as quais por sua vez, formam sinapses com
células ganglionares OFF. Na via ON2 o sinal dos bastonetes é transmitido para os pedículos
de cone através de junções comunicantes e então segue a via de cone para as células
ganglionares ON. A via OFF2 é comparável àquela de ON2 para as células ganglionares OFF.
Na via OFF3, células bipolares OFF de cone formam contatos sinápticos diretos com a base
de esférulas de bastonetes e transfere sinal diretamente para células ganglionares OFF. A
recente avaliação de um camundongo nocaute para a conexina 36, tem mostrado que
diferentes vias operam sob diferentes condições de luz (Wässle, 2004). O processamento das informações através dos cones e bastonetes ao longo das vias on e off está esquematizado na figura 1.
Figura 1. A via dos fotorreceptores na retina de mamíferos. OS/IS, segmentos externos e internos de
bastonetes e cones; ONL, camada nuclear externa; OPL, camada plexiforme externa; INL, camada nuclear
41
1.11 A retina como oscilador e os ritmos da retina
A alternância entre claro e escuro no ambiente é provavelmente um dos eventos mais importantes na vida diária de um organismo. A diferença de intensidade nos níveis de iluminação entre noite e dia é de tal magnitude (0,1 a 100.000 lux) que tanto a retina como outras estruturas fotorreceptoras, capazes de detectar tais mudanças, desenvolveram um sistema de temporização endógeno, capaz de permitir antecipar tais alterações e desenvolver mecanismos de adaptação às mesmas (Tosini & Fukuhara, 2002).
Na retina, muitos dos processos em nível fisiológico, celular e molecular exibem um ritmo circadiano. Como exemplos, podemos citar sensibilidade visual, renovação dos discos dos segmentos externos dos bastonetes e fagocitose pelo epitélio pigmentar da retina, expressão de genes imediatos e genes dos pigmentos visuais em fotorreceptores, níveis de segundos-mensageiros e atividades de enzimas nas vias de transdução do sinal, expressão de arilalquilamina N-acetiltransferase (NAT), enzima de síntese do neurohormônio melatonina, e a própria liberação desta substância das células fotorreceptoras, além da liberação do neuromodulador dopamina dos neurônios retinianos internos (Cahill & Besharse, 1995; Iuvone et al., 2005).
42 Besharse, 1993, 1995), indicando que esse ritmo não é dependente do oscilador principal. Subsequentemente, a presença de um relógio circadiano na retina foi também demonstrada em várias outras espécies de vertebrados (ver Tosini & Fukuhara, 2002), incluindo mamíferos (Tosini & Menaker, 1996, 1998; Sakamoto et al., 2000).
Em mamíferos, a primeira evidência de um oscilador circadiano na retina foi fornecida por um estudo em hamster (Mesocricetus auratus), em que retinas em cultura exibiram ritmo circadiano da síntese de melatonina por pelo menos 5 dias. Os ritmos foram sincronizados por ciclos de luz aplicados in vitro e entraram em livre-curso em escuro constante. Além disso, o período em livre-curso da síntese de melatonina em retinas de hamsters homozigotos com mutação tau, os quais têm o período do ritmo circadiano em livre-curso 4 horas mais curto que o selvagem, foi correspondentemente mais curto. Donde se concluiu que a retina de mamífero contém um oscilador circadiano geneticamente programado que regula a síntese de melatonina (Tosini & Menaker, 1996). Um ritmo circadiano na liberação de melatonina foi referido para cultura isolada ou enriquecida de células em retinas de camundongo (Tosini & Menaker, 1998) e rato (Tosini et al., 1998). Assim, experimentos com uma cepa particular de camundongo (C3H/rd), cujos fotorreceptores tipo bastonete sofreram degeneração durante o desenvolvimento pós-natal, demonstraram que, embora a biossíntese de melatonina permaneça, o seu ritmo circadiano desaparece com a perda completa de bastonetes (Tosini & Menaker, 1998). Esta observação sugere que bastonetes não são necessários para a síntese de melatonina, mas o são para a sua expressão rítmica (Tosini & Fukuhara, 2002).
43 supraquiasmático e o outro depende da sua presença para manter a oscilação circadiana (Sakamoto et al., 2000).
O mecanismo responsável pela geração da oscilação circadiana requer a presença intracelular de determinados genes relógio, os quais podem ser identificados pelo método de hibridização in situ para identificar quais células expressam o RNA mensageiro (mRNA) para os genes relógio. A expressão de genes relógio foi identificada no núcleo supraquiasmático (ver por exemplo, Shearman et al., 2000; Ko & Takahashi, 2006), porém na retina é ainda matéria de investigação. Na retina de Xenopus foi concluído que os fotorreceptores continham um relógio circadiano, porque estes mantinham o ritmo circadiano da síntese de melatonina, mesmo quando mantidos em isolamento (Cahill & Besharse, 1993, 1995). Subsequentemente, foi encontrado que o homólogo do gene clock é expressado fortemente nos fotorreceptores bastonetes e cones, e apenas fracamente nas camadas neurais da retina de Xenopus (Zhu et al., 2000; Hayasaka et al., 2010).
44 co-localizado em células amácrinas com dopamina, calbindina e cal-retinina, mas não com acetilcolina, nem tampouco foi expressada nas células ganglionares melanopsinérgicas (Witkovsky et al., 2003). Na retina de rato foi visto que RNA de Per1 e Per2 são do mesmo modo distribuídos difusamente entre todas as camadas nucleares (Zhuang et al., 2000). Outros dados disponíveis sobre a localização celular de gene relógio na retina do rato dão conta de que Clock e BMAL1 exibem intensa expressão, com fortes sinais dos transcritos na camada nuclear interna e camada de células ganglionares (Namihira et al., 1999). Per1 e Per2 expressam-se nos fotorreceptores, mas a grande maioria dos transcritos parece estar localizada na camada nuclear interna (Namihira et al., 2001). Dados obtidos em um estudo com a técnica de microdissecção por captura a laser e reação em cadeia transcriptase-polimerase reversa, indicam que Per1, Per3, Cry1, Cry2, Clock, Bmal1, Ver-erba e Rora RNAs, e não Per2 e Npas2 estão presentes na camada de fotorreceptores na retina de ratos, acompanhado de um
ritmo circadiano robusto da síntese de melatonina (Tosini et al., 2007). Estes dados demonstram que a retina de mamíferos deve conter um marcapasso circadiano funcional na camada de fotorreceptores, além da retina interna.
45 e Per2 sendo induzido apenas em ZT2 (Namihira et al., 2001). Estes resultados sugerem que a responsividade à luz dos genes relógio na retina são diferentes da responsividade à luz dos mesmos genes no núcleo supraquiasmático. Neste núcleo, os genes respondem à iluminação de uma maneira mais restrita, ou seja, suas respostas são dependentes da fase circadiana. Per1 aumenta em ZT16-24, e Per2 aumenta apenas em ZT16 (Miyake et al., 2000), enquanto os transcritos de BMAL1 alcançam um pico em ZT2 (Honma et al., 1998). Clock responde à luz apenas durante a noite (Abe et al., 1999). Além disso, um estudo referiu que após lesão do núcleo supraquiasmático, a ritmicidade de Per2 na retina desaparece, a despeito da permanência de um robusto ritmo circadiano do RNA mensageiro de NAT (Sakamoto et al., 2000). Isto poderia sugerir que a presença de um mecanismo de relógio na retina não depende da transcrição rítmica de genes Per.
Do exposto, torna-se evidente a existência de algumas diferenças no padrão de expressão dos genes relógio na retina em comparação com o núcleo supraquiasmático. Entretanto, ainda há muito a ser esclarecido com relação a essa questão. Sobretudo, é fundamental identificar com precisão as células que constituem o marcapasso e medir nestas células o padrão de expressão dos genes-relógio (ver Tosini & Fukuhara, 2002; Tosini et al., 2008).
46 Ribelayga et al., 2002; Doyle et al., 2002a, b; Tosini & Fukuhara, 2002; Iuvone et al., 2005). Além disso, a melatonina inibe a síntese/liberação de dopamina através de uma ação sobre receptores de melatonina MT2 (Dubocovich, 1983; Ribelayga et al., 2004) e, ao mesmo tempo, a dopamina inibe a síntese/ liberação de melatonina a partir de células fotorreceptoras atuando sobre receptores D2/D4 (Nguyen-Legros et al., 1996; Tosini & Dirden, 2000). Esses dados sugerem que a regulação dos níveis de melatonina e dopamina na retina pode ser parte de um complexo mecanismo de retroalimentação no qual a melatonina é rítmica e regula a liberação da dopamina e a dopamina modula o ritmo da melatonina, embora não seja necessária para a geração daqueles ritmos (Cahill & Besharse, 1995).
Embora nem todos os ritmos descritos ocorram em todas as classes de vertebrados, há inúmeras evidências de que a ritmicidade circadiana é altamente conservada na fisiologia da retina. É geralmente aceito que os ritmos circadianos da retina permitem ao organismo antecipar e adaptar-se a grandes variações na intensidade de luz durante o período de 24 horas, possibilitando uma otimização das funções visuais para cada situação fótica (Iuvone et al., 2005).
1.12 Sistemas fotossensíveis na retina interna – Papel da melanopsina
47 células ganglionares que expressam melanopsina foram denominadas células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs) (Berson et al., 2002; Berson, 2003; Warren et al., 2003).
É importante considerar as muitas diferenças estruturais e funcionais existentes entre os fotorreceptores clássicos e as ipRGCs, que se projetam diretamente para o cérebro. Entre os alvos dessas projeções estão o núcleo supraquiasmático, principal marcapasso e sincronizador dos ritmos circadianos ao ciclo claro-escuro (Gooley et al., 2001; Berson et al., 2002; Hannibal et al., 2002; Hattar et al., 2002; Berson, 2003) e o folheto intergeniculado (Hattar et al., 2002; Morin et al., 2003), que também participa da regulação dos ritmos circadianos (Harrington, 1997). Também recebe terminais das ipRGCs o núcleo olivar pré-tectal (Hattar et al., 2002; Morin et al., 2003), um elemento chave nos circuitos de mediação dos reflexos pupilares à luz (Trejo & Cicerone, 1984; Clarke & Ikeda, 1985; Young & Lund, 1994). Outros alvos das ipRGCs, implicando sua participação em diversas outras funções, incluem a região pré-óptica, a zona subparaventricular do hipotálamo, o núcleo geniculado lateral ventral e o colículo superior (Hattar et al., 2002; Gooley et al., 2003; Morin et al., 2003; Hannibal & Fahrenkrug, 2004).
48 que a visão normal, exigindo um período de tempo que vai de segundos a vários minutos de iluminação para reiniciar o relógio biológico. É interessante destacar que o espectro de ação das respostas à luz nas ipRGCs corresponde àquele da fotossincronização circadiana (Nayak et al., 2007).
A fotossensibilidade das ipRGCs exibe adaptação tanto à luz quanto ao escuro. Sob iluminação constante, a fotorresposta de fundo diminui gradualmente, enquanto a resposta a flashes luminosos superpostos aumenta. Após um período de exposição ao escuro, as ipRGCs readquirem completa sensibilidade à luz (Wong et al., 2005). Tal adaptação pode proporcionar ao organismo uma fina sintonia que o habilita a perceber pequenas mudanças nas condições de luminosidade (Nayak et al., 2007).
Os campos dendríticos das ipRGCs proporcionam completa cobertura da retina. Nas retinas adaptadas à luz, a resposta à iluminação das ipRGCs é feita acima de um componente rápido, derivado da entrada de cones, e um componente mais lento, baseado numa resposta intrínseca a luz. Na retina de primatas há cerca de 3.000 células contendo melanopsina. Aproximadamente 40% delas estão localizadas na camada nuclear interna e seu pico de densidade é na fóvea. Seus dendritos estratificam-se na camada nuclear interna ou na camada de células ganglionares, mas elas parecem ser células centro ON (Wässle, 2004).
49 fortalecida pela evidência morfológica de que as ipRGCs recebem entrada de fotorreceptores retinianos via células bipolares e amácrinas. Esta evidência foi obtida em estudos de microscopia eletrônica em camundongo, no qual foi visto que dendritos imunorreativos a melanopsina na região interna (ON) da camada plexiforme interna são pós-sinápticos a terminais de células bipolares e amácrinas, enquanto que dendritos imunorreativos a melanopsina estratificando-se na região externa (OFF) da mesma camada recebem apenas terminais de células amácrinas. Isto sugere que os sinais provenientes de bastonetes e/ou cones podem ser capazes de modificar a capacidade intrínseca de resposta à luz destas células ganglionares que expressam melanopsina (Belenky et al., 2003).
50 plexiforme interna de ratos e humanos é um produto da pressão seletiva. Esta associação anatômica pode ser adaptativa e reflete algum grau de vantagem evolutiva adquirida por ter os dendritos das ipRGCs adjacentes aos sítios de liberação de dopamina. Isto é particularmente importante quando considerada a curiosa associação aparente entre dendritos de células expressando melanopsina e pericários imunorreativos a TH (Vugler et al., 2007).
51 origem de sinais circadianos que, ao modular a função das ipRGCs, influenciam indiretamente o núcleo supraquiasmático.
1.13 Importância da dopamina para a transição claro/escuro
52 1983; Mangel & Dowling, 1987), levando informações da camada plexiforme interna, primariamente relacionada com aspectos dinâmicos e temporais do estímulo visual, de volta para a camada plexiforme externa, que parece corresponder ao estágio do processamento da informação visual, em que são processados aspectos estáticos e espaciais da iluminação (Brandies & Yehuda, 2008). Em algumas retinas de vertebrados, o neurônio dopaminérgico é uma célula amácrina, em outras é uma célula interplexiforme, mas em algumas espécies, como o gato (Oyster et al., 1985) o rato e o camundongo (Witkovsky et al., 2008), os dois tipos estão presentes. Algumas células dopaminérgicas co-localizam com o ácido gama-aminobutírico (GABA), o que pode ser a base de uma modulação intracelular de dopamina por GABA (Nguyen-Legros et al., 1997).
Dois tipos morfológicos de células amácrinas dopaminérgicas (tipo 1 e tipo 2) foram descritos pela primeira vez na retina de macaco Rhesus (Mariani & Hokoc, 1988). As células tipo 1 têm comparativamente grandes corpos celulares, são densamente coradas, estão situadas quase exclusivamente na fileira mais interna da camada nuclear interna, seus processos arborizam no extrato mais externo da camada plexiforme interna e dão origem a finas fibras orientadas radialmente na camada nuclear interna. As células tipo 2 têm comparativamente às células tipo 1, pequenos corpos celulares, menor intensidade de coloração para TH, a maior parte encontra-se localizada na INL, seguido da IPL e GCL, e seus processos arborizam no centro da camada plexiforme interna (Mariani & Hokoc, 1988). Uma categorização semelhante, embora com variações na relação entre os dois tipos, foi encontrada na retina de coelho (Tauchi et al., 1990) e do camundongo transgênico (Gustincich et al., 1997; Feigenspan et al., 1998). Em camundongos selvagens, albinos ou pigmentados, apenas um tipo morfológico foi identificado (Versaux-Botteri et al., 1984).
53 gato e coelho (Hokoç & Mariani, 1988). Por esta via, em mamíferos, a produção e liberação da dopamina retiniana são estimuladas pela exposição à luz (Kramer, 1971; Iuvone et al., 1978; Witkovsky et al., 2004), embora os neurônios dopaminérgicos sejam tonicamente ativos, apresentando disparos espontâneos de repouso, moduladas pela luz (Gustincich et al., 1997; Feigespan et al., 1998). Uma vez liberada, a dopamina atua tanto localmente como através de sinapses com os neurônios adjacentes, e dependendo da transmissão parácrina, pode afetar as funções de inúmeras células da retina não necessariamente adjacentes às células dopaminérgicas (Jensen & Daw, 1986; Bjelke et al., 1996). Nesse ponto é importante mencionar que neurônios dopaminérgicos estão perfeitamente posicionados na retina interna para facilitar a propagação de dopamina pela transmissão volumétrica, podendo receber influências provenientes da entrada de mais de um tipo de célula bipolar e fazendo sinapses morfologicamente definidas com dois tipos de células amácrinas, as células AII e as células A17, ambas as quais fazem parte da via dos bastonetes (Voigt & Wässle, 1987; Witkovsky, 2004). Elas liberam dopamina extrassinapticamente de seu próprio soma (Puopolo et al., 2001) e ao que parece, a grande maioria das células na retina possui receptores dopaminérgicos (Nguyen-Legros et al., 1999), de modo a capturar e utilizar este neurotransmissor.
54 através de uma liberação difusa, parácrina, do neurotransmissor. Experimentos usando células amácrinas transgenicamente marcadas em cultura mostraram que a liberação extrassináptica é controlada por potenciais de ação espontâneos na ausência de entrada sináptica e modulada por entradas, presumivelmente também parácrinas, de outros neurônios retinianos (Gustincich et al., 1997; Puopolo et al., 2001).
É interessante destacar que a dopamina exerce um papel antagônico ao da melatonina na regulação da fisiologia adaptativa da retina. Enquanto a dopamina funciona como um sinal químico para a luz, produzindo mecanismos fisiológicos de adaptação à luz, a melatonina tem efeitos adaptativos ao escuro (Green & Besharse, 2004; Iuvone et al., 2005). Ao que tudo indica, os fotorreceptores secretores de melatonina e as células amácrinas/interplexiformes secretoras de dopamina, formam uma alça de feedback celular, funcionando na regulação da fisiologia retiniana circadiana (Iuvone et al., 2005). Além disso, foi visto que as células dopaminérgicas da retina atuam também modulando a expressão de melanopsina em células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (Sakamoto et al., 2005; Vugler et al., 2007). As interações envolvendo dopamina, melatonina e melanopsina foram abordadas anteriormente no contexto dos ritmos da retina e sistemas fotossensíveis da retina interna.
55
1.14 O mocó como modelo experimental
O mocó (Kerodon rupestris), é uma espécie tipicamente Brasileira, nativa da região Nordeste, sendo encontrado desde o Piauí até o norte de Minas Gerais (Cabrera, 1961).
Taxonomicamente, o mocó é classificado na ordem Rodentia, superfamília Cavioidea, família Caviidae, subfamília Caviinae, gênero Kerodon, juntamente com Cavia (Cavia porcellus), Galea (Galea spixii) e Microcavia (Microcavia niata) (Cabrera, 1961; Lacher,
1981).
O mocó pertence a um grupo de roedores que tem sido estudado por pesquisadores neurocientistas brasileiros desde os anos oitenta, compreendendo a cutia (Dasyprocta aguti e outras espécies), capivara (Hydrochaerus hydrochaeris), e a paca (Cuniculus paca) (Silveira, 1985; Silveira et al., 1989; Picanço-Diniz et al., 1991; Rocha et al., 2009), e também o porquinho da índia (Cavia porcellus), o qual tem sido estudado em laboratórios de diferentes partes do mundo (Jacobs & Deegan, 1994; Peichl & González-Soriano, 1994; Parry & Bowmaker, 2002). De acordo com a classificação que usa a forma do crânio como característica primária (Carleton & Musser, 2005) – Anomaluromorpha, Castorimorpha, Hystricomorpha, Myomorpha, e Sciuromorpha, este grupo é parte da subordem Hystricomorpha, uma das cinco subordens de roedores aceita no padrão de classificação de Rodentia.
56 Os mocós são animais endêmicos da caatinga, habitando a região do semi-árido nordestino, onde estão localizadas as rochas graníticas, que lhes servem como refúgio e abrigo contra os predadores, os quais são principalmente os gatos macambira e vermelho, as raposas, o gavião pé de serra e o jacurutu (Carvalho, 1969; Lacher, 1981). São altamente adaptados às condições ecológicas regionais, como o calor, a escassez de água e de alimentos, principalmente nos períodos das grandes secas nas regiões do semi-árido nordestino. São herbívoros e costumam se alimentar de cascas de árvores, brotos, pequenos arbustos e ramos de algumas espécies de plantas trepadeiras (Mendes, 1985; 1987). Em cativeiro aceitam bem frutas como banana, mamão, jambo, manga, e raízes como batata doce, além de capim fresco e folhas de mangueira (observações próprias). Atingem a fase adulta aos 200 dias, podendo atingir até 50 cm de comprimento e 1 quilo de peso corporal (Roberts et al., 1984).
57 que podem detectar a presença do homem e de outros animais a longas distâncias. A audição é também bastante aguçada, de modo que qualquer ruído curto, de pequena intensidade, como um assobio, um pequeno galho quebrado, ou o barulho de folhas roçando o solo, costumam atlertar o mocó (Carvalho, 1969). Quanto à reprodução, ocorrem nascimentos ao longo do ano, exceto no período que vai de abril a junho. As fêmeas apresentam estro pós-parto, podendo acasalar-se poucas horas após o nascimento dos filhotes. Embora as proles sejam pequenas a cada parto (cerca de 1 a 2 filhotes), o curto período gestacional (75 dias) garante uma elevada produção de crias a cada ano. Os animais atingem o tamanho do adulto aos 200 dias, embora a primeira concepção das fêmeas possa ocorrer aos 115 dias de vida (Lacher, 1981; Roberts et al., 1984).
58 Esta espécie foi escolhida como um modelo animal de roedor regional para estudos de ritmos circadianos no Laboratório de Cronobiologia-UFRN. Além da caracterização do ritmo de atividade e outras respostas circadianas deste animal (Sousa & Menezes, 2006), estudos prévios do nosso laboratório demonstraram a existência de proteínas ligantes de cálcio nos centros circadianos do mocó (Cavalcante et al., 2008), além de projeções da retina diretas aos núcleos talâmicos paraventricular (PVT) (Nascimento Jr. et al., 2008) e mediodorsal (MD) (Nascimento Jr. et al., 2010a), envolvidos nos ritmos circadianos e modulação de reconhecimento visual, respectivamente. Foi descrito também que este roedor tem uma projeção retino-hipotalâmica semelhante ao descrito para outros mamíferos diurnos ou noturnos, além de peculiaridades no que diz respeito a distribuição de neurônios positivos ao peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e vasopressina (VP) no núcleo supraquiasmático (Nascimento Jr. et al., 2010b). Recentemente, também foram descritos os grupamentos serotoninérgicos do mocó (Soares et al., 2012). Várias publicações estão em andamento com a participação de estudantes de pós-graduação e iniciação científica.
