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UNIVERSIDADE FEDERAL de SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
Disciplina de Endocrinologia
Chefe da Disciplina:
Prof Dr. Antônio Roberto Chacra
A minha orientadora, Dra Marise Lazaretti(Castro pelo incentivo, paciência e pelas inúmeras oportunidades que me ofereceu ao longo desta minha
Aos meus pais Ana e Manoel que apesar da distância sempre estiveram ao meu lado apoiando, confiando e respeitando minha escolha, a vocês peço desculpa pelo longo tempo que fique ausente e longe de casa e declaro publicamente o meu eterno amor e admiração.
Aos meus irmãos Ailton, Carlos, Elenice e Ana Claudia pelas melhores lembranças da minha infância e por manter forte dia após dia o elo que nos une.
AGRADECIMENTOS
Aos pacientes, sem os quais esse estudo não seria possível.
Aos professores da Disciplina de Endocrinologia da UNIFESP pelos ensinamentos ao longo da minha trajetória.
Aos meus eternos mestres Dr. José Gilberto H. Vieira e Dra. Cynthia Brandão pela paciência, amizade e pelo convívio harmonioso de todos estes anos.
Aos amigos do cálcio: Monique, Marília, Sérgio, Ulisses, Érika, Gabriella, Marcelo, André, Henrique, Patrícia, Patrícia Zach, Alessandra, Mônica, Márcia, Linda, Ana Paula, Rosângela, Audrey, Ana Laura, Andréia Lage pela presença e incentivo que sempre me foi dado.
Aos meus amigos pós(graduandos: Márcio, Claudia Nakabashi, Claudia Akemi, Rosa Paula, Maria Izabel, Manuel, Milena, Maria Regina, Danielle, Cleber, Alex, Marivânia, Teresa Vieira, Martha, Regina do Carmo, Monike, Sílvia, Gláucia, Caroline, Carolina, Mariana, Juliana, Rogério, Denise, Patrícia Molica, Patrícia Mory, Bianca, Deolinda, Fernando, Fernando Flecha, Paula Gama, Priscila, Ligia, por me ensinarem que vale a pena tentar e pelas palavras de conforto e incentivo.
Aos amigos do laboratório de biologia molecular: Felipe, Gisele, Gustavo, Rosana, Mariana, Flávia, Liliane, Walter, Janete por estarem sempre dispostos a me ajudar.
Aos meus eternos amigos( ajudantes: Teresa, Ilda, Gilberto, Ângela, Magnus, pela paciência e por me ouvirem nas horas de desespero.
Aos amigos Marcos Aurélio, Mário e Eleonor que sempre estiveram presentes na minha vida.
Aos residentes da Disciplina de Endocrinologia.
Aos funcionários da Disciplina de Endocrinologia: Vanda, Geni, Pedro, Elder, Ivonete, Filomena, Walquiria, Lilian, Ivone, Kelly, Samia.
ÍNDICE
ABREVIAÇÕES...ix
INTRODUÇÃO Definição...1
Diagnóstico e etiologia...1
OSTEOGENESIS IMPERFECTA 1. Definição...2
2. Classificação...2
3. Quadro clínico...4
4. Achados laboratoriais...6
5. Achados radiológicos...7
6. Tratamento...7
6.1. Bisfosfonatos 6.2. Mecanismo de ação 6.3. Uso de bisfosfonatos em OI OSTEOPOROSE PSEUDOGLIOMA 1. Introdução...15
2. Via de sinalização Wnt/βcatenina...16
3. Aspectos clínicos...17
4. Tratamento...17
OBJETIVOS 1. Estudo 1...19
2. Estudo 2...19
3. Estudo 3...19
ARTIGO 1...20
ARTIGO 2...23
ARTIGO 3...39
CONSIDERAÇÕES...59
CONCLUSÕES FINAIS...63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA...64
ABREVIAÇÕES:
ADP: 3(amino(1hidroxipropilidene(1,1(bisfosfonato APC: “Adenomatosus polyposis coli”
AppCp: “Adenosine([5`β(methylene] triphosfate” Appp1:” Triphosphoric acid 1(adenosin(5`y1 ester3” ANT: adenosina nucleotídeo translocase
BMD: Densidade mineral óssea
vBMD: Densidade mineral óssea volumétrica COLIA1: Colágeno tipo 1 cadeia α1
COLIA2: Colágeno tipo 1 cadeia α2 DI: Dentigonenesis imperfecta DNA: Ácido desoxirribonucléico
DXA: Dual energy X(ray Absorptiometry Dvl: Disheveled
Dkks: Dickkopfs
Dpyr: Deoxipiridinolina
EGF: Fator de crescimento epidermal FA: Fosfatase alcalina
FPP: Farnesil difosfato sintase Fz: Frizzled
GGPP: Geranilgeranil difodfato GH: Hormônio de crescimento GKS3: Glicogênio kinase sintase 3
HBM: Alta massa óssea ‘‘High bone mass” LDL: Lipoproteína de baixa densidade
LDLR: Receptor de Lipoproteína de baixa densidade
LRP5: Proteína 5 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade “ Receptor low–density lipoprotein receptor(related protein 5”
NTX: N(telopeptideo do colágeno tipo 1 OI: Osteogenesis imperfecta
OJI: Osteoporose juvenil idiopática OMS: Organização mundial de saúde ONJ: Osteonecrose de mandíbula OPPG: osteoporose pseudoglioma PAM: Pamidronato
P1CP: Propeptídeo carboxi(terminal do procolágeno tipo I “C(terminal propeptides of procollagen I”
P1NP: Propeptídeo amino(terminal do procolágeno tipo I “N(terminal propeptides of procollagen I”
Pyr: Piridinolina
_______________________________________________________Introdução
I INTRODUÇÃO:
1. Definição:
Osteoporose é o distúrbio ósseo metabólico mais comum na população adulta, sendo um grande problema de saúde pública. Caracteriza se por uma baixa massa óssea e deteriorização da micro arquitetura levando a uma fragilidade óssea com aumento da incidência de fraturas (1). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) o termo osteoporose é definido com T score ≥ 2.5 de densidade mineral óssea (BMD), osteopenia um T score entre 1.0 e 2.5 (2,3). Essa definição baseia se na avaliação da densidade mineral óssea (BMD) através da ‘‘dual energy X ray absorptiometry” (DXA) realizada em um grupo de mulheres caucasianas pós menopausadas e usadas como referência para classificar a população adulta em normal, osteopenia e osteoporose; usando o T score para essa classificação. Previamente considerada uma doença associada à idade, nas últimas décadas, tem crescido o interesse desse distúrbio na população infantil. No entanto, a interpretação da DXA na população infantil deve ser feita com extremo cuidado, já que ocorrem mudanças no tamanho e espessura do osso durante o período do crescimento ósseo, o qual é mais evidente na puberdade. Além disso, não se pode nos esquecer do fato de que a DXA reporta classicamente uma medida bidimensional de uma estrutura tridimensional, representando uma projeção da área óssea num plano coronal.
Na população infantil tem sido sugerido o uso do Z score para definição da massa óssea. Um Z score ≤ 2.0 caracteriza o que se deveria chamar de uma baixa massa óssea para a idade. Neste grupo ainda não está estabelecida a relação entre o valor da BMD e o risco de fratura como é descrito na população adulta. No entanto, Goulding e col (4) estudando um grupo de meninas entre 3 15 anos mostraram que para cada redução de 1 DP na BMD de corpo total, há um risco dobrado de uma nova fratura em meninas jovens.
2. Diagnóstico e etiologia:
_______________________________________________________________Introdução
apresentar histórico de uso de medicação como anticonvulsivante e glicocorticóides, ou história de imobilização prolongada entre outros fatores.
Deve se sempre que possível identificar a etiologia da osteoporose, para que se possa com isso realizar tratamento específico, quando indicado. Do ponto de vista didático, pode se classificar a osteoporose em primária e secundária. O grupo das osteoporoses primárias engloba as doenças hereditárias do tecido ósseo e osteoporose juvenil idiopática (OJI). A osteoporose de causa secundária pode estar presente em uma série de doenças como as doenças neuromusculares, as doenças crônicas, os distúrbios endocrinológicos, erros inatos do metabolismo, uso de medicações que podem comprometer o metabolismo ósseo, etc (5).
Neste trabalho serão abordadas duas causas de fragilidade óssea na infância: a osteogenesis imperfecta (OI) e a osteoporose pseudoglioma (OPPG), ambas são classificadas como osteoporose primária.
II OSTEOGENESIS IMPERFECTA (OI)
1. Definição:
A OI é uma doença genética caracterizada por uma massa óssea baixa que envolve, na maioria dos casos, mutação em um dos genes que codificam o colágeno tipo 1 (COLIA1 e COLIA2). A molécula do colágeno tipo I é constituída por duas cadeias α1 e uma cadeia α2, que se entrelaçam formando uma tripla hélice. O gene que codifica a cadeia α1 está localizado no cromossomo 17, enquanto que o gene que codifica a cadeia α2 fica no cromossomo 7. Os achados clínicos mais comumente encontrados na OI são esclera azul, dentinogenesis imperfecta (DI), fraturas aos mínimos traumas, graus variáveis de baixa estatura, surdez e frouxidão ligamentar. Sua incidência varia de 1 a cada 15.000 a 20.000 nascidos vivos (6).
2. Classificação:
______________________________________________________________Introdução
Tipo I (Forma leve): Tem padrão de transmissão autossômica dominante, seu fenótipo é leve com estatura normal ou próxima ao normal. As fraturas normalmente ocorrem nos primeiros anos de vida, mas costumam diminuir após a puberdade. O envolvimento auditivo é freqüente, e ocorre geralmente em 50% dos indivíduos afetados. A esclera azul está presente desde a infância e permanece azul ao longo de toda a vida. Dentinogenesis imperfecta (DI) também pode esta presente.
Tipo II (Forma Letal): Na maioria das vezes é causada por uma nova mutação autossômica dominante (8). A massa óssea está intensamente diminuída e há múltiplas fraturas intra útero. Além disso, podem apresentar baixo peso ao nascimento, micro ou macrocefalia e catarata. Os pacientes geralmente vão a óbito em decorrência da fragilidade dos arcos costais e hipoplasia pulmonar, por má formação do sistema nervoso central ou por hemorragia cerebral.
Tipo III (Forma grave): Possui alta prevalência de fraturas ao longo da vida, é o tipo de OI (dentro da classificação de Sillence) mais grave dentre os pacientes que conseguem sobreviver ao período neonatal. Um dos achados clínicos típicos é a presença de face com formato triangular em decorrência do crescimento desproporcional entre o crânio e os ossos da face. A baixa estatura geralmente é secundária a deformidades dos ossos longos de membros inferiores, a fraturas vertebrais, escoliose e deformidade torácica. DI é um achado freqüente mais evidente na primeira dentição. Esclera azul pode estar presente na infância e adolescência e tornar se mais clara na idade adulta.
Tipo IV (Forma Moderada): Possui padrão de herança autossômico dominante, geralmente os pacientes têm baixa estatura para a idade e presença de fraturas em menor proporção que o tipo III. Essa forma geralmente tem uma apresentação clínica intermediária entre tipo I e III. Como no tipo III a esclera azul pode estar presente, mas que tende a normalizar com o passar dos anos. DI pode ou não estar presente.
______________________________________________________________Introdução
fenótipo ser semelhante ao apresentado pelos outros tipos clássicos de OI, não foram encontradas mutações no gene do colágeno tipo I.
Outro exemplo desta inespecificidade diagnóstica é a Síndrome Osteoporose Pseudoglioma (OPPG), a qual em relatos antigos de literatura foi chamada inicialmente de forma ocular de Osteogenesis imperfecta (12,13). Em 2001(14) Gong e col identificaram a mutação no LRP5, um gene relacionado à diferenciação osteoblasto, portanto, também não relacionada ao colágeno tipo I, como responsável pela OPPG. Essa síndrome será descrita com mais detalhes adiante.
3. Quadro clínico:
Além dos sinais e sintomas clássicos descritos acima, os pacientes portadores de OI ainda podem apresentar:
3.1. Envolvimento neurológico: apesar da maioria dos pacientes com OI não apresentarem comprometimento cognitivo, alterações neurológicas podem acompanhar esta síndrome. A invaginação vértebro basilar, apesar de ser uma complicação rara, merece atenção por ser potencialmente fatal (15). Os sintomas mais comuns desta complicação são: cefaléia, disfagia, hiperreflexia, quadriparesia, ataxia, nistagmo e perda auditiva. Outros achados neurológicos como hidrocefalia, macrocefalia, malformação de Dandy Walker (malformação do SNC caracterizada por hidrocefalia, ausência parcial ou completa do vermis cerebelar e cisto da fossa posterior, contíguo ao quarto ventrículo) e atrofia cerebral podem ser vistos nesses pacientes.
3. 2. Envolvimento cardiovascular:
_______________________________________________________________Introdução
3. 3. Envolvimento renal:
A hipercalciúria é um achado comum nos pacientes com OI. Em 1991 Chines e col (20), estudando 17 meninas e 30 meninos, descreveram a presença de hipercalciúria com valores médios de 6.1 ± 0.3 mg/kg/24h em 36% dos pacientes com OI estudados por eles. Esses autores também observaram que as crianças com hipercalciúria apresentavam menor estatura, além de uma maior taxa de fraturas em relação às crianças normocalciúricas. Em 1995 Chines e col (21) após segmento de quatro anos das crianças com hipercalciúria descrita previamente (20), observaram que, apesar da hipercalciúria, os pacientes não apresentavam comprometimento da função renal.
3. 4. Baixa estatura e envolvimento metabólico:
Apesar da baixa estatura ser um traço marcante nos pacientes com OI, a deficiência do hormônio de crescimento (GH) é rara nesta patologia. Num estudo publicado por Marini e col não foi evidenciada deficiência de GH nos pacientes com OI (22). Alguns pacientes podem apresentar um estado hiper metabólico que costuma se manifestar através de um maior grau de sudorese, e maior consumo de oxigênio (23). Hipertermia maligna também tem sido descrita nesses pacientes, normalmente durante indução anestésica com barbitúricos, fentanil, pancurônico e óxido nítrico (24). No entanto, a etiologia deste estado hiper metabólico e da hipertemia é desconhecida (23, 24).
3. 5. Envolvimento pulmonar:
A hipoplasia pulmonar pode ser encontrada na OI tipo II comprometendo o padrão respiratório e contribuindo, com isso, para a gravidade da apresentação clínica desse tipo de OI (25). Recentemente, a obstrução de vias áreas superiores foi descrita em três pacientes com OI, dois dos quais necessitaram de traqueostomia (26).
3. 6. Alterações do tecido conectivo e força muscular:
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3. 7. Dentes:
A DI é um dos sinais típicos da OI, mas sua gravidade não está relacionada com a gravidade do envolvimento do esqueleto. Caracteriza se pelo comprometimento da dentina, que se apresenta irregular e com diminuição do número dos túbulos, o que confere o aspecto típico desta alteração (30). A primeira dentição costuma ser mais afetada do que a permanente. A má oclusão dentária pode estar presente em 60 a 80% dos pacientes com OI (31). Levando se em consideração a presença ou não de DI podemos subdividir a OI tipo I e tipo IV em subtipo A quando a DI está presente ou subtipo B quando a DI está ausente.
4. Achados laboratoriais:
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5. Achados radiológicos:
Apesar da OI ser conhecida como a doença dos ossos de cristal, não há achado radiológico patognomônico desta doença. A presença de osso wormiano pode ser vista em aproximadamente 60% dos pacientes com OI, no entanto, não é um achado exclusivo desta patologia. O osso wormiano corresponde a pontos de ossificação primária visto no Raio X de crânio. Outro achado radiológico normalmente encontrado na OI tipo III é o aspecto pipoca (“popcorn”), geralmente presente nas epífises e metáfises dos ossos longos. Esse aspecto de pipoca “Popcorn” são calcificações que resultam na maturação e fragmentação desordenada na fise óssea, e sua presença indica distúrbio na ossificação endocondral que pode contribuir para o retardo do crescimento observado na OI (35). Além disso, uma porose difusa, afilamento e deformidade principalmente de ossos longos, pseudo artrose e sinais de fraturas podem ser vistas ao Raio X dos pacientes com OI.
6. Tratamento:
Até algum tempo atrás, o tratamento da OI visava apenas o manejo das fraturas e correções cirúrgicas das deformidades. Poucos estudos envolvendo número pequeno de pacientes testaram terapias com vitamina C (36), fluoreto de sódio (37), magnésio (38) e esteróides anabólicos (39), todos sem comprovação de eficácia. O uso de calcitonina mostrou se, inicialmente promissor (40), mas estes resultados não foram reprodutíveis (41), sendo o seu uso posteriormente abandonado.
Com o surgimento de drogas anti reabsortivas, como os bisfosfonatos, abriu se uma nova era no tratamento destas crianças, tornando se uma alternativa segura e eficaz para o tratamento da OI.
6.1. Bisfosfonatos:
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que vão conferir as propriedades químicas e farmacocinéticas dos bisfosfonatos. O radical R1 é responsável pela afinidade dos bisfosfonatos aos cristais de hidroxiapatita na matriz óssea e o radical R2 confere maior ou menor capacidade de inibir o osteoclastos.
A alta afinidade de ligação dos bisfosfonatos ao tecido ósseo pode afetar algumas propriedades biológicas desses compostos como sua captação e retenção pelo esqueleto, sua difusão para dentro do tecido ósseo, seu potencial de liberação de droga a partir de reabsorção do osso, sua reciclagem e nova reabsorção pela superfície óssea.
Os bisfosfonatos foram desenvolvidos no século XIX, mas somente nos anos 60 seu uso, em doença ósseo metabólica, foi investigado e nos anos 90 seu mecanismo de ação foi demonstrado.
6.2. Mecanismo de ação:
Os bisfosfonatos podem ser separados em dois grupos de acordo com seu mecanismo de ação: bisfosfonatos simples (não nitrogenados ou non N BP) e bisfosfonatos nitrogenados (N BP). O primeiro grupo inclui o Etidronato, Clodronato e Tiludronato enquanto que no segundo grupo temos os bisfosfonatos mais recentemente desenvolvidos, como Pamidronato, Neridronato, Olpadronato, Alendronato, Ibandronato, Risedronato e Ácido Zoledrônico.
O mecanismo de ação básico dos bisfosfonatos envolve uma diminuição do recrutamento e da atividade dos osteoclastos, levando a uma diminuição do turnover ósseo pela inibição da reabsorção óssea.
Os bisfosfonatos do primeiro grupo (non N BP), após serem incorporados pelos osteoclastos durante a reabsorção óssea, são metabolizados no meio intracelular em análogos de ATP (que contém metileno) pela enzima “aminoacyl tRNA synthetase”, levando ao acúmulo no citosol osteoclasto de metabólitos do tipo AppCp ( adenosine [5`β
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Os bisfosfonatos mais potentes pertencem ao segundo grupo, os quais contêm na sua cadeia lateral um grupo amino, que pode ser uma cadeia alquílica (por exemplo: alendronato e ibandronate) ou dentro de um anel heterocíclico (por exemplo: risedronato e zoledronato). Esse grupo de bisfosfonatos age através da inibição da farnesildifosfato sintase (FPP sintase), uma enzima do ciclo do Mevalonato. Ao inibir essa enzima, diminui a
concentração celular do farnesildifosfato (FPP) e do geranilgeranildifosfato (GGPP) que são necessários para prenilação de pequenas GTPases (proteínas de ligação trifosfato guanosina), tais como Ras, Rho e Rab. Prenilação de proteínas é um processo que envolve a adição de um grupo prenil (isoprenoide) na porção carboxi terminal da proteína alvo, levando a uma modificação pós transcripcional da proteína. A prenilação dessas proteínas é crucial na sinalização de proteínas que regulam uma variedade de processos celulares necessários para a função dos osteoclastos, incluindo arranjo do cito esqueleto, membrana, fluxo de vesículas intracelulares e sobrevivência da célula (44).
Em 2006 Mönkkönen e col (45), estudando células da glia, macrófagos e osteoclastos tratados com ácido zoledrônico, sugeriram um novo mecanismo de ação dos bisfosfonatos nitrogenados (além do mecanismo clássico do ciclo do mevalonato). Esse novo mecanismo envolve a inibição da translocação mitocondrial ADP/ATP levando a apoptose de osteoclastos. Posteriormente, esse novo mecanismo de ação foi descrito por Mönkkönen e col (43), o qual estabelece que os N BPs incluindo Ácido Zoledrônico, induza
formação de um novo tipo de análogo ATP, denominado a Appp1 (Triphosphoric acid 1 adenosin 5’ y1 ester3). A inibição do FPP pelo N BPs pode levar ao acúmulo intracelular do substrato IPP (isopentanil profosfato), o qual é conjugado com AMP levando a produção de Appp1. Semelhante aos metabólitos tipo AppCp ( metabólitos da ação dos non N BPs) a Appp1 induz apoptose direta por bloquear a translocação mitocondrial do ADP/ATP.
A potência dos bisfosfonatos aumenta ou diminui de acordo com sua capacidade de inibir o ciclo do Mevalonato. Dentre os vários bisfosfonatos nitrogenados testados, o ácido zoledrônico foi o mais potente em inibir a ação da FPP, seguido do risedronato, ibandronato, alendronato e pamidronato nesta ordem (44, 46, 47, 48).
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Os bisfosfonatos podem ser de uso endovenoso ou oral. Apesar de o uso oral ser o mais rotineiramente utilizado no tratamento para osteoporose, o uso de bisfosfonato endovenoso tem crescido cada vez mais. Uma grande desvantagem do uso oral do bisfosfonatos é sua má absorção no trato gastrointestinal. Menos de 1% da dose oral administrada é absorvida. Além disso, essa absorção pode variar de individuo para indivíduo, bem como ser prejudicada pela presença de alimentação. A baixa absorção desses compostos é atribuída a sua elevada polaridade, o que impede seu transporte trans celular pela barreira epitelial. Além disso, a própria baixa solubilidade dos sais metálicos complexos formados a partir dos bisfosfonatos no trato gastrointestinal, pode ser outra possível causa da má absorção (49). Esta alta polaridade e baixa lipossolubilidade, por outro lado, fazem dos bisfosfonatos drogas com baixa toxicidade, uma vez que não penetram pelas membranas lipossolúveis. Sua alta afinidade pela hidroxiapatita faz com que seja depositado no tecido ósseo mineralizado logo na primeira passagem, com clareamento plasmático rápido. Somente durante o processo de reabsorção óssea é captado ativamente pelos osteoclastos, desencadeando uma série de efeitos metabólicos intracelulares que culminam com a desorganização do cito esqueleto, redução de sua atividade e, finalmente, morte celular.
Em adultos, este grupo de drogas tem sido usado no tratamento de osteoporose pós menopausa, osteoporose induzida por glicocorticóides, doença de Paget e hipercalcemia associada à malignidade. Em crianças, seu uso tem sido demonstrado com sucesso e segurança em pequenos grupos, há cerca de 20 anos, incluindo condições mais diversas como: osteogenesis imperfecta (OI) (50, 51, 52), osteoporose pseudoglioma (OPPG) (53, 54), osteoporose juvenil idiopática (OJI) (55), displasia fibrosa óssea (síndrome de McCune Albright) (56, 57), osteoporose secundária à glicocorticóide ou imobilização prolongada (58), e na hipercalcemia associada à leucemia linfocítica aguda (59).
6.4. Efeitos adversos:
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rior, episclerite e conjuntivite transitória têm sido descritas com o uso endovenoso de bisfosfonatos (60). Mialgia transitória, leucopenia, linfopenia e distúrbios gastrointestinais podem ocorrer com o uso de bisfosfonatos (61).
Outro efeito potencial do uso de bisfosfonato é o efeito tóxico renal. Em 1994 O’Sullivan e col descreveram a ocorrência de falência renal aguda com aumento de creatinina sérica em um paciente que fez uso inadvertido de altas doses de etidronato endovenoso (62). Mais recentemente, casos de nefrotoxicidade em pacientes que receberam alendronato (63, 64) pamidronato (65) e ácido zoledrônico (66) têm sido descritos. O mecanismo da nefrotoxicidade do N BPs é desconhecido. Existem hipóteses de que o modo de ação dos N BPs em inibir a FPP no ciclo do mevalonato pode também ser o responsável pela nefrotoxicidade (67, 68).
Apesar da segurança do uso de bisfosfonatos na prática clínica, também tem sido descrita na literatura a ocorrência de osteonecrose de mandíbula (ONJ) em pacientes com câncer, tratados com bisfosfonatos endovenoso (69, 70), e com isso tem crescido a preocupação com a segurança do uso de bisfosfonatos oral, em pacientes com osteoporose. A principal apresentação clínica da ONJ é uma área óssea exposta em mandíbula, maxila ou palato. Aproximadamente 80% da ONJ envolvem lesão indolor, e 60% dos casos ocorrem após extração dentária ou cirurgia alveolar (71). A ONJ já havia sido descrita em literatura geralmente associada à irradiação de cabeça e pescoço, osteomielite e uso de glicocorticóides (70, 71, 72, 73). Em recente revisão de literatura, envolvendo uso de bisfosfonatos no tratamento de osteoporose a prevalência de ONJ foi relativamente baixa (74). Recentemente Brown e col (75) estudaram quarenta e dois pacientes pediátricos com osteoporose que receberam bisfosfonatos endovenoso por um tempo médio de 6.5 anos e foram avaliados clínica e radiologicamente para ONJ. Dos quarenta e dois pacientes, trinta e sete estavam recebendo pamidronato 1 mg/kg/dose (dose média acumulada 19.8 mg/kg) e ácido zoledrônico 0.05 mg/kg/dose (dose média acumulada 0.49 mg/kg), quatro tinham recebido somente ácido zoledrônico e apenas um recebeu pamidronato. Os autores não encontraram evidências de ONJ em nenhuma das crianças estudadas.
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O primeiro trabalho que mostra o uso de bisfosfonato em OI foi feito por Devogelaer col em 1987 (76). Os autores descrevem o uso de 3 amino 1hidroxipropilidene 1,1bisfosfonato (ADP ou pamidronato) via oral, em uma criança de doze anos de idade portadora de OI. Nesse trabalho, os autores observaram evidências clínicas e radiológicas dos prováveis efeitos benéficos do bisfosfonato no tratamento da OI, além de descreverem a presença de estrias rádio opacas na metáfise óssea, que correspondiam exatamente ao período de tratamento. Alguns meses depois, Huaux e col (77) confirmaram os achados de Devogelaer ao evidenciarem o aumento de densidade óssea em duas crianças portadoras de OI tratadas com ADP. Até o início dos anos 90, havia poucos trabalhos descrevendo o uso de bisfosfonato em crianças com OI. Em 1997, Willians e col (78) descreveram o uso de pamidronato endovenoso (15mg) em um menino com OI para tratamento de hipercalcemia aguda desenvolvida após episódio de fratura. Posteriormente os autores mantiveram neste paciente tratamento profilático com clodronato na dose de 520mg/ 2 vezes ao dia. Landsmeer Beker e col (79) em 1997 descreveram o uso de Olpadronato por via oral na dose de 5mg /dia e 10mg/dia em três crianças portadoras de OI tipo III durante 5 a 7 anos. Os autores demonstraram diminuição do número de fraturas, tendência a restaurar o tamanho normal das vértebras e ausência de efeitos colaterais. Em 1998 Astron e Soderhall (80) relataram o uso endovenoso mensal de Pamidronato por 2 a 3 anos em três crianças portadoras de OI. Nesse trabalho, os autores demostraram aumento da densidade mineral óssea visto pela DXA, bem como diminuição do turnover ósseo demonstrado através dos marcadores ósseos. Um dos trabalhos envolvendo um maior número de participantes foi realizado por Glorieux e col em 1998 (81) que descreveram o uso de Pamidronato endovenoso na dose média de 6.8±1.1mg/kg/ano a cada 4 ou 6 meses durante o período de 1.3 a 5 anos, em um grupo de trinta crianças com idade entre 3 e 16 anos. Os autores demonstraram redução da FA e NTX, com aumento da BMD e diminuição da taxa de fraturas.
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Tabela 1: Relação dos trabalhos que avaliaram o uso de bisfosfonatos em crianças com fragilidade óssea. Os trabalhos enumerados de 1 a 8, o de nº 11 e o de nº12 foram feitos com pamidronato
endovenoso; o trabalho de nº9 usou neridronato e o trabalho de nº10 descreve a comparação entre alendronato via oral e pamidronato endovenoso.
Autores Ano N Dose/kg Faixa etária Tempo de
seguimento(meses)
Efeitos adversos BMD No de fraturas
1. Plotkin e col (82)
2000 9 0,5mg/kg por 3 dias, 4/4 meses 2.3 20,7 meses 12 meses Febre aumento diminuição
2. Lee yung
Seng e col (83)
2001 6 1,5mg/kg, 2/2 meses 4,9 13,7 anos 12 23 meses Febre aumento diminuição
3. Rauch e col (84)
2002 125 < 2 anos: 0,25 0,5mg/kg/dia por 3 dias, 2/2 meses 2 3 anos: 0,38 0,75mg/kg/dia por 3 dias, 3/3meses >3 anos: 0,5 1mg/kg/dia por 3 dias, 4/4 meses
1,4 17,5 anos 2,4 anos (27 meses) não avaliado aumento não avaliado
4. Falk e col (85)
2003 6 0,5 1,0mg/kg/dia, 4/4 meses (2 4 meses) 1,8 14,7 anos 27 39 meses febre, mialgia,
irritabilidade, astenia
aumento não houve diferença
5. Rauch e col (86)
2003 165 < 2 anos: 0,25 0,5mg/kg/dia por 3 dias, 2/2 meses 2 3 anos: 0,38 0,75mg/kg/dia por 3 dias, 3/3meses >3 anos: 0,5 1mg/kg/dia por 3 dias, 4/4 meses
2 semanas 17,9 anos
4 anos não avaliado não avaliado não avaliado
6. Zeitlin e col (87)
2003 125 < 2 anos: 0,25 0,5mg/kg/dia por 3 dias, 2/2 meses 2 3 anos: 0,38 0,75mg/kg/dia por 3 dias, 3/3meses >3 anos: 0,5 1mg/kg/dia por 3 dias, 4/4 meses
0.5 17.9 anos 4 anos não avaliado não avaliado não avaliado
7. DiMeglio e col (50)
2004 9 < 24 meses: 0,5mg/kg/dia por 3 dias, 2/2meses 24 36 meses: 0,75 mg/kg/dia por 3 dias, 3/3 meses > 36 meses: 1mg/kg/dia, por 3 dias, 4/4 meses
1 35 meses
11 29 meses Febre aumento diminuição
8. Arikoski e col (88)
2004 26 1mg/kg/ dia por 3 dias, 3/3meses 3,2 15,5 anos 12 meses não avaliado aumento não avaliado
9. Gatti e col (89)
2005 44 2mg/kg/ciclo (Neridronato), 3/3 meses 6 11 anos 3 anos Sintomas flu like aumento diminuição
10. DiMiglio e col (90)
2006 18 1mg/kg/dia por 3 dias, 4/4 meses (Pamidronato) 1mg/kg/dia (alendronato)
3 13 anos 2 anos febre, mialgia,
vomito
aumento diminuição
11. Choi e col (91)
2007 11 30mg/m21x/mês 0.9 13.8 anos 6 36 meses Febre aumento diminuição
12. Lowing e col (92)
_______________________________________________________________Introdução
II Osteoporose pseudoglioma (OPPG)
1. Introdução:
A OPPG é uma doença autossômica recessiva rara caracterizada por alterações oculares e ósseas. Estima se que sua incidência na população seja de aproximadamente de 1:2. 000.000 com predomínio pelo sexo masculino na proporção de 3:1 (98).
O interesse pelo estudo genético da OPPG ganhou ênfase quando em 1996 Gong e colaboradores (99), analisando 16 amostras de DNA, mapearam a região 11q12 13 como gene candidato responsável pela OPPG. Em 1998 Hey e col (100), na tentativa de encontrar genes candidatos para diabetes mellitus tipo1 no lócus 11q13, identificaram um novo membro da família de receptores de lipoproteína de baixa densidade (LDL), o qual foi nomeado como ”low–density lipoprotein receptor related protein 5” (LRP5). O mesmo grupo realizou a clonagem do c DNA de ratos e encontrou homologia de 94% com a proteína humana. Em 1998, Dong e col (101) isolaram o c DNA do LRP5 em humanos. Recentemente Gong e col (14) identificaram mutações no gene do LRP5 como causadoras da OPPG. Em adição Levasseur e col (102) observaram que ratos com deficiência na lrp5, apresentavam baixa massa óssea, baixo peso corporal e comprometimento ocular. Em 2002 Kato e col (103), estudando ratos com deficiência de lrp5, confirmaramm os dados de Levasseur (102)
O gene do LRP5 está localizado no cromosomo11q12 13 (104) e codifica uma proteína de 1615 aminoácidos, faz parte da família do receptor de lipoproteínas da baixa densidade (LDLR), os quais são receptores de superfície celular com um único domínio transmembrânico. Até o momento 13 membros dessa família foram descritos.
_______________________________________________________________Introdução
tre esses receptores de superfície é crucial para a sinalização intracelular. A porção extracelular do LRP5 liga se a diferentes fatores, sendo os mais importantes os receptores da família Wnt, Dickkopfs (Dkks) e Frizzled (Fz). O LRP5 age como co fator para o receptor Wnt, na sinalização intracelular que envolve o mecanismo de ação da ß catenina.
2. Via de sinalização Wnt (wingless): Figura 2
As proteínas da família Wnts são ricas em cisteínas e são importantes na osteoblastogenesis através de sua interação com outros receptores de superfície da membrana celular na via canônica da ativação da ß catenina. A via de sinalização Wnt pode ocorrer por três diferentes caminhos que pode envolver uma via canônica e duas vias não canônicas. As duas vias não canônicas envolvem o cálcio e a via de polaridade celular. A via canônica envolve diretamente o LPR5, o qual juntamente com outros receptores está envolvido na estabilização da ß catenina e será descrita com mais detalhes a seguir.
A via de sinalização canônica/Wnt/ß catenina é complexa e requer a ligação do Wnt com co receptor Fz e LRP5/6, para estabilização do sistema Wnt/ ß catenina intracelular, durante a ativação da formação óssea. Quando ocorre a ligação Wnt/ LRP5/Fz na membrana celular há um recrutamento e fosforilação da proteína intracelular Disheveled (Dvl), que vai então para a superfície celular. Quando está no citoplasma a Dvl está ligada à molécula de Axin, glicogênio kinase sintase 3 (GKS3) e APC (adenomatous polyposis coli), formando um complexo que leva á fosforilação da ß catenina e sua degradação. No entanto quando a Dvl é recrutada para a superfície celular, o complexo terciário é desfeito, a GKS3 libera a ß catenina, a qual se acumula no citoplasma e migra para o núcleo celular onde se liga aos fatores de transcrição TCF/LEC (fator de células T/ fator de ligação de leucócitos). A ligação ß catenina/TCF/LEC é crucial na ativação do gene de transcrição do Ruxn2/CBFA1. Por outro lado, se a ligação Wnt Fz/LRP5/6 é inibida, haverá captura intracelular da ß catenina com formação de um complexo terciário que facilita a sua fosforilação e degradação pelo sistema umbiquinina proteossoma. A inibição da ligação Wnt/LRP5/Fz ocorre quando os receptores de superfície celular Kremen e receptor Dickkopfs (Dkks) se ligam ao LRP5, bloqueando então a ligação do LRP5 a Wnt, comprometendo a via de sinalização da ß catenina (104, 105, 106).
_______________________________________________________________Introdução
a ganho de função, levando a um fenótipo com massa óssea aumentada (HBM); como mutações com perda função do LRP5 que compromete a via de sinalização levando a um quadro clínico compatível com OPPG (14).
3. Aspectos clínicos:
A apresentação clássica da OPPG envolve o comprometimento ósseo caracterizado por uma baixa massa óssea e envolvimento ocular; o quadro ocular pode ser uma displasia vitroretiniana com evidência de massa pseudogliomatosa, anormalidade da câmara anterior, opacidade corneana, evoluindo para phthisis bulbi. Apesar do achado ocular mais característico da OPPG ser o phthisis bulbi, tem sido descrita a presença de catarata isolada, bem como coloboma retiniano. Além do envolvimento ocular típico e a presença de osteopenia grave, podemos encontrar ossos wormianos no crânio, vértebras côncavas, deformidade de ossos longos; além disso, os pacientes podem apresentar relativa microcefalia, hipotonia muscular, frouxidão ligamentar e baixa estatura (107). Pela presença do envolvimento ocular, no início, essa patologia foi descrita como forma ocular da Osteogenesis Imperfecta (12, 13), posteriormente viu se que se tratava de uma entidade própria e não de uma forma ocular da OI. A gravidade da doença ocular não tem relação com o quadro ósseo. Comprometimento cognitivo pode estar presente nesses pacientes, entanto, ocorre em uma minoria e é independente do comprometimento ocular e do envolvimento ósseo.
Com relação às alterações laboratoriais não há alteração laboratorial típica da OPPG, de uma maneira geral os marcadores do metabolismo ósseo solicitados em exames de rotina costumam estar normais (108). Alguns dos achados clínicos da OPPG (como a presença de fragilidade óssea e fraturas) são também vistos na OI, isso justifica o fato de alguns pacientes portadores da OPPG serem inicialmente diagnosticados como portadores de OI. Nesse aspecto, o estudo genético poderia auxiliar no diagnóstico diferencial entre essas duas patologias tendo em vista que na OPPG as mutações envolvidas estão localizadas no gene LRP5 e na OI a maioria das mutações responsáveis por essa síndrome estão no gene COLIA.
_______________________________________________________________Introdução
Devido à raridade desta patologia não há consenso sobre o seu tratamento. Em 2000 Zacarin e col (54) relataram resultados favoráveis com uso de bisfosfonato em três crianças impúberes portadoras de OPPG. Nesse trabalho a dose usada foi de 1mg/kg dividida em 3 dias consecutivos a cada 6 meses por 2 anos. Posteriormente Bayran e col (53) descreveram o uso de pamidronato na dose de 1mg/kg mensal durante três anos com melhora do quadro álgico e mobilidade, além de aumento da BMD de coluna (0,416mg/cm2
_
___________________________________________________________Objetivos
OBJETIVOS:
ESTUDO 1:
1. Investigar a presença de mutação no gene do LRP5 em dois irmãos com quadro clínico de Osteoporose Pseudoglioma (OPPG).
ESTUDO 2:
1. Avaliar a eficácia do uso de Pamidronato em duas crianças com Osteoporose Pseudoglioma (OPPG).
ESTUDO 3
_________________________________________________________________Artigo 1
ARTIGO 1
A novel mutation in the LRP5 gene is associated with osteoporosis pseudoglioma syndrome.
_________________________________________________________________Artigo 2
ARTIGO 2:
"A three year pamidronate therapy follow up of two brothers with Osteoporosis Pseudoglioma Syndrome (OPPG) carrying an LRP5 mutation"
Elizabete Ribeiro Barros, Magnus R. Dias da Silva, Ilda S Kunii and Marise Lazaretti Castro
________________________________________________________________Artigo 2
Elizabete Ribeiro Barros1* , Magnus R. Dias da Silva2, Ilda S Kunii1, Marise Lazaretti Castro1.
Division of Endocrinology1, Department of Biochemistry2, Federal University of São Paulo, Brazil
Short title: Pamidronate in LRP5 mutation.
Keywords: Osteoporosis Pseudoglioma, LRP5, skeletal fragility, bisphosphonate
*Corresponding author. E mail: elizabete.barros@unifesp.br
Address reprint requests to: Elizabete Ribeiro Barros, Division of Endocrinology, Universidade Federal de São Paulo. Rua Pedro de Toledo, 781, 12º andar, 04039 032 São Paulo SP, Brazil,
________________________________________________________________Artigo 2
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Osteoporosis pseudoglioma (OPPG) is a rare syndrome characterized by severe osteoporosis and ocular defects caused by homozygotic inactivation mutations in the LRP5 gene. Bisphosphonate has been demonstrated to improve Bone Mineral Density (BMD) in children with OPPG. We present here a three year follow up of two brothers with OPPG carrying a novel mutation in the LRP5 gene, which were treated with intravenous pamidronate.
Methodology: We looked for a mutation in LRP5 gene in two brothers (12 and 4 years old) with clinical features of OPPG (blindness, low BMD and fragility fractures) and in their consanguineous parents to confirm the diagnosis of OPPG. The patients were treated with bisphosphonate for 3 years. They received 1mk/kg/day of pamidronate for 2 consecutive days, every 3 months during the first year, and every 4 months in the subsequent years. Calcium, phosphorus, total alkaline phosphatase, PTH, hepatic transaminases, creatinine and hemogram tests were performed before each infusion. Bone densitometry was performed at the baseline and at the end of the follow up.
________________________________________________________________Artigo 2
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The osteoporosis pseudoglioma syndrome (OPPG) is an autosomal recessive disorder characterized by low bone mass with consequent fragility fractures associated with ocular globe degeneration, which results in severe visual impairment [1] [2]. In contrast to other hereditary childhood pathologies that affect the bones and induce fractures, individuals with OPPG do not present with defects in collagen synthesis, calcium homeostasis, or bone turnover [3]. In addition to the bone involvement, ocular abnormalities are frequent and consist of retino hyaloid dysplasia with eyeball contraction (phthisis bulbi).
Recently, Gong et al. identified mutations in the low density lipoprotein receptor related protein 5 gene (LRP5) as the cause of OPPG [3]. The LRP5 gene is located on the long arm of chromosome 11 at 11q13.4, it has 23 exons, and it encodes a transmembrane protein with 1615 amino acids. In the osteoblast membrane, LRP5 acts as Wnt co receptor by forming a complex with two other receptors, Frizzled (Fz) and Kremen, and it is crucial for intracellular signaling [1]. In eye development, LRP5 may act through Norrin signaling rather than Wnt pathway [4].
Due to the rarity of this dramatic condition, there is no consensus about any form of treatment for the bone fragility. The recent acquired knowledge regarding LPR5 function in osteoblast activities does not totally support the use of bisphosphonate in the treatment of this disease; however, it has been used in 3 children [5] and in 1 woman [6] with encouraging results regarding bone pain and bone mineral density.
We had the opportunity to follow up on two brothers from consanguineous parents with clinical characteristics of OPPG, in whom we have identified LRP5 gene mutations. In an attempt to improve bone mass and reduce the rate of fractures, we treated the patients with pamidronate plus calcium and vitamin D for three years. Their clinical features and our results are further described .
PATIENTS AND METHODS
________________________________________________________________Artigo 2
months later, a fracture in the right femur was detected. After that, he was referred to our hospital. Upon physical examination he had a fracture with immobilization in the right leg and was blind with atrophic ocular globes. His cognitive ability, muscle strength, and reflexes were normal. Dental development was apparently normal. In addition, he was pubertal (Tanner G3P3). His anthropometric and biochemical characteristics are shown in Table 1 and bone densitometry parameters are shown in Table 2.
The youngest brother (JVOP) was 4 years old at that time and was born blind. At 2 years and 6 months, he had a fracture of the right femur after a fall from his height. He had atrophic ocular globes, blindness, and horizontal nystagmus. He was pre pubertal (Tanner G1P1) with bilateral cryptorchia. He had normal muscle tonus and no hyperextensive joints or altered teeth. His anthropometric and biochemical characteristics are also shown in Table 1 and bone densitometry parameters are shown in Table 2.
Both of the boys had adequate calcium intake and sun exposition. Their parents are healthy, consanguineous (cousins) (Figure 1), had normal bone mineral density (BMD) (Table 3) and no history of fractures or blindness. There were no similar cases in the family.
This protocol was previously approved by the Federal University of Sao Paulo Ethical Committee and written informed consents were obtained from all participants and legal guardians.
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Every 3 months in the first year, and every 4 months in the second and third years, the patients received 1mg/kg/day of dissodic pamidronate (Aredia©, Norvatis) for 2 consecutive days. Pamidronate was diluted in normal saline solution and each infusion lasted at least 4 h. Additionally, both brothers received oral calcium (500mg/day) and vitamin D (5000 7000UI/week) supplementation.
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________________________________________________________________Artigo 2
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Before starting treatment and before every subsequent infusion, fasting blood samples were collected for determination of ionized calcium (Ca2+), total calcium (CaT), total alkaline phosphatase (AP), phosphorus (P), creatinine, aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase (ALT), hemogram and intact parathyroid hormone (PTH). Chemiluminescent commercial assays (Elecsys 1010, Roche Diagnostics, EUA) were used to quantify intact PTH. Ca2+ was measured by a specific ion electrode method (AVL 9180 Electrolyte analyzer, AVL scientific Corporation, EUA). Creatinine, P and CaT were determined by an automated colorimetric method (BM/Hitachi 917). AP was measured by the kinetic enzyme method (DGKC/Bayer) while AST and ALT were measured by kinetic UV IFCC. Hemograms were performed by the automatic method (Cell Dyn 3700/Abbott).
)
For LRP5 gene analysis, whole blood samples from the two brothers, their parents, a maternal aunt, and 50 normal controls were collected. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes using a commercial Puregene Isolation Kit (Gentra Systems, USA) and then quantified and amplified by PCR for all 23 exons of the LRP5 gene, including intron/exon limits, using the primers described by the Osteopororis Pseudoglioma Syndrome Collaborative Group [3].
The twenty three PCR reactions were previously standardized using the following parameters: 20 mM Tris HCl, 50 mM KCl, pH 8.4, 0.2 mM of each dNTP, 1.5 mM MgCl2, 2.5
U of Taq DNA polymerase, and 0.2 to 0.4 pmol of each primer in a final volume of 50 qL. Thermocycling consisted of: denaturation at 94 °C for 5 minutes, 35 cycles at 94 °C for 1 minute, annealing for 1 minute and extension at 72 °C for 30 seconds, followed by a final extension step at 72 °C for 10 minutes. The PCR reactions were carried out using a GeneAmp PCR Thermocycler System (Applied Biosystems, USA). Amplification products were confirmed by electrophoresis on a 1.8% agarose gel and staining with ethidium bromide.
The PCR products were purified using a commercial GFX PCR DNA and Gel Band
________________________________________________________________Artigo 2
For mutation analysis, sequencing was performed with an automated DNA sequencer (ABI PRISM 3100, Applied Biosystems) by real time electrophoresis using a dye terminator cycle sequencing kit. The sequencing parameters were: 2 L of Big Dye v.2 (DNA Sequencing
Kit, Applied Biosystems, USA), 1 L of each primer F and R at 3.12 pmol/ L, 6 L of
sequencing buffer, 6 L of DNAse free water, and 20 ng of purified DNA. The results were analyzed and the sequences were identified by BLAST searching.
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Clinical and laboratory follow up
Neither of the patients had any new fractures during the follow up period. The oldest brother (MLOP) increased his stand height by 4cm during the 3 years of observation (1.33 cm/year), but he presented with deformed bowing legs as a consequence of his previous femur fracture. The pubertal development maintained its normal course and he was at Tanner V at the final assessment. The youngest brother (JVOP) grew up normally during the three years of follow up and was still prepubertal at the end of the observational period.
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The family pedigree is demonstrated in figure 1. We studied both brothers, their parents and a maternal aunt grandmother. The other members of the family that are presented are defined as supposedly heterozygote (Figure 1). We identified an LPR5 missense mutation in the third codon of exon 8, in which an asparagine is replaced by an isoleucine (N531I), in two siblings with OPPG (homozygosis) and their consanguineous parents (heterozygosis). The patients were found to be homozygous for this mutation, while their parents and aunt are heterozygous (Figure 2).
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During the follow up period, the LRP5 gene was sequenced in two brothers in an attempt to identify the presence of a mutation. During the molecular investigation we found a missense mutation in exon 8 that causes a change from asparagine to isoleucine at position 531 (N531I) in the protein. This is a novel mutation that is homozygotic in the siblings, heterozygotic in their parents, and absent in 50 tested normal controls (Figure 1). The finding of a heterozygous mutation in the parents is in agreement with autosomal recessive inheritance which is typical for OPPG. Although there are some new descriptions of heterozygous LRP5 gene mutations causing bone fragility [7], the consanguineous parents are asymptomatic and display neither bone mass nor ocular alterations. We believe that this mutation is responsible for the OPPG phenotype of the patients described here.
Although report of the use of bisphosphonate in the treatment of OPPG, as far we know, is restricted to just two publications [5, 6], there is vast experience with this class of drugs in children and adolescents with other bone and mineral disorders, such as osteogenesis imperfecta [ 8, 9, 10], fibrous dysplasias [11], osteoporosis juvenile idiopathic [12] and hypercalcemia [13].
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inflammatory cytokines TNFα and INFγ (14). The symptoms last 24 to 48 hours and are usually strongest after the first infusion and progressively decrease their intensity following the subsequent infusions (15).
After beginning pamidronate treatment, no new fractures were observed during the 3 years of follow up in either of the two brothers. In the youngest patient, we observed a significant increase (31%) in the lumbar spine BMD, with a gain of one standard deviation (Z score) for his age at the end of the observational period. In the older patient, an observed increment of BMD was also evident (16.4%); however, the Z score did not change and he developed bowing legs, which certainly prejudiced his stand up stature. Nevertheless, he has been declared to have subjective improved in mobility and bone pain with the treatment. Our findings are compatible with those observed by Zacharin and Cundy (6), who described three patients with OPPG. They also showed that younger patients responded to the treatment with biphosphonates (pamidronate and clodronate) better than older patients.
Bone diseases in children that are treated with pamidronate are mostly associated with high bone turnover, which justifies the use of antireabsorptives such as bisphosphonates. However, the primordial defect in OPPG, as demonstrated in our patients, is located in the LRP5 gene. This gene encodes for a protein that is present at the membrane of osteoblasts and their precursors. In the presence of a mutation that induces a loss of function, bone formation is decreased. Based on this result, the rationale for the treatment of these OPPG patients would be the use of a medication that would be able to stimulate bone formation rather than to decrease reabsorption. However, such available medication is not indicated for growing individuals, as in the case of teriparatide. Because of the statements above, bisphosphonate is the only available treatment option for these patients at this moment.
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Gong et al. [3] demonstrated that a mutation in the LRP5 gene was responsible for OPPG in humans. They also showed that LRP5 is able to mediate Wnt signaling in vitro by the canonical pathway, suggesting a role for this protein during osteoblastic differentiation and proliferation. So far, 27 mutations have been reported in OPPG patients and all of them are located in the extracellular domain of LRP5 [2, 19, 20, 21, 22]. The reported mutations are of the missense/nonsense type or are small insertions or deletions. Loss of function mutations lead to defective Dickkopf LRP5 Wnt pathway signaling, impairment of osteoblastic differentiation and compromised bone formation. On the other hand, mutations in the LRP5 gene resulting in gain of function were found to be responsible for phenotypes characterized by increased bone mass [ 21, 22, 23]. All of these findings strongly suggest the importance of this pathway in the control of bone development and present a new horizon for the study of bone physiology and physiopathology, especially related to the current poor understanding of bone formation control. Recent knowledge opens new possibilities for the development of drugs focused on the treatment of diseases characterized by low and high bone mass, such as osteoporosis and sclerosing bone syndromes.
In summary, we have described the presence of a novel LRP5 gene mutation in two brothers with blindness and fragility fracture, which confirm the diagnosis of Osteoporosis Pseudoglioma Syndrome. In these patients, the use of cyclic intravenous pamidronate was safe and efficacious at increasing bone mass and decreasing the fracture rate during the three years of follow up.
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Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM):
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Table 1: Anthropometrics and biochemical parameters at baseline and during follow up (3 years) of pamidronate treatment.
Ca2+: ionized calcium; AP: alkaline phosphatase; PTH: parathyroid hormone; P: phosphorus; AST: aspartate amino transferase; ALT: alanine amino transferase; Cr: creatinine.
Parameters Baseline First year Second
year
Third year Normal range
MLOP Age (years) 12 15
Height (cm) Z score 157.0 +0.44 161.0 0.93 Weight (kg) Z score 53.0 +1.47 58.0 +0.18
CaT (mg/dl) 9.4 8.8 8.5 9.1 8.5 10.5
Ca2+ (mmol/l) 1.27 1.32 1.31 1.26 1.24 1.38
P (mg/dl) 6.0 4.0 4.6 3.8 4.0 7.0
AP (UI/L) 568 330 318 235 < 970
PTH (pg/ml) 32 21 16 28 10 70
AST (U/L) 20 21 23 24 < 38
ALT (U/L) 14 29 28 34 < 41
Cr (mg/dl) 0.7 0.9 0.8 0.9 0.8 1.2
JVOP Age (years) 4 7
Height (cm) Z score 98.5 0.22 112.5 0.65 Weight (kg) Z score 13.2 1.42 17.3 1.44
Total calcium (mg/dl) 9.5 9.5 8.5 8.5 8.5 10.5
Ca2+(mmol/l) 1.31 1.34 1.32 1.33 1.24 1.38
P (mg/dl) 5.1 4.5 4.4 5.1 4.0 7.0
AP (U/L) 542 339 262 262 < 970
PTH (pg/ml) 21 19 21 25 10 70
AST (U/L) 20 20 23 24 < 38
ALT(U/L) 14 26 28 34 < 41
________________________________________________________________Artigo 2
Table 2: Bone mineral density (BMD) and bone mineral content (BMC) of the two patients (MLOP and JVOP)
Lumbar spine (L1L4) baseline Lumbar spine (L1#L4) third year
BMD(mg/cm2) BMC(g) Z score BMD(mg/cm2) BMC(g) Z score MLOP 0.512 25.16 3.9 0.596 28.91 3.8 JVOP 0.227 6.46 5.4 0.298 8.88 4.4
Table 3: Lumbar spine and femoral neck BMD, respectives Z scores and anthropometric measures from patient´parents at baseline.
Age
(years)
Weight
(kg)
Height
(cm)
Lumbar Spine Femoral neck
________________________________________________________________Artigo 2
Figure 1: Pedigree of the OPPG siblings carrying the N531I mutation
Figure 2: Sequencing chromatogram of theLRP5gene Exon 8 from the patients, parents, and a representative control. The affected siblings are homozygous, whereas their parents are heterozygous.
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A
Siblings
Parents
________________________________________________________________Artigo 2
REFERENCES
1.Westendorf JJ, Kahler RA and Schroeder TM. Wnt signaling in osteoblasts and bone diseases. Gene, 2004; 341: 19 39.
2. Levasseur R, Lacombe D and Vernejoul MC. LRP5 mutation in osteoporosis pseudoglioma syndrome and high bone mass disorders. Joint Bone Spine, 2005; 72: 207 214.
3. Gong Y, Slee RB, Fukai N, Rawadi G, Roman Roman S, Reginato AM, Wang H, Cundy T, Glorieux FH, Lev D, Zacharin M, Oexle K, Marcelino J, Suwairi W, Heeger S, Sabatalos G, Apte S, Adkins WN, Allgrove J, Arslan –Kirchener M, Batch JA, Beighton P, Black GC, Boles RG, Boon LM, Borrone C, Brunner HG, Carle GF, Dallapiccola B, De Paepe A, Floege B, Halfhide ML, Hall B, Hennekam RC, Hirose T, Jans A, Juppner H, Kim CA, Keppler Noreuil K, Kohlschuetter A, LaCombe D, Lambert M, Lemyre E, Letteboer T, Peltonen L, Ramesar RS, Romanengo M, Somer H, Steichen Gersdorf E, Steinmann B, Sullivan B, Superti Furga A, Swoboda W, van den Boogaard MJ, Van Hul W, Vikkula M, Votruba M, Zabel B, Garcia T, Baron R, Olsen BR, Warman ML; Osteoporosis Pseudoglioma Syndrome Collaborative Group. LDL receptor related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development. Cell 2001; 107: 513 23.
4. Ai M, Heeger S Bartels CF, Schelling DK and Osteoporosis Pseudoglioma Collaborative Group. Clinical and molecular findings in osteoporosis pseudoglioma syndrome. Am J Hum Genet. 2005; 77: 741 753.
5 .Zacharin M and Cundy T. Osteoporosis pseudoglioma syndrome: treatment of spinal osteoporosis with intravenous bisphosphonates. J Pediatr. 2000; 137: 410 415.
6. Bayram F, Tanriverdi F, Kurtoglu S, Atabek ME, Kula m, Kaynar L, Kelestimur F. Effects of 3 years of intravenous pamidronate treatment on bone markers and bone mineral density in a patient with osteoporosis pseudoglioma syndrome (OPPG). J Pediatr Endocrinol Metab. 2006; 19: 275 279.
7. Hartikka H, Makitie O, Mannikko M, Doria AS, Daneman A, Cole WG, Ala Kokko L, Sochett EB. Heteozygous mutations in the LDL receptor related protein 5 (LRP5) gene are associated with primary osteoporosis in children. J Bone Miner Res. 2005: 789 789
________________________________________________________________Artigo 2
9. Plotkin H, Rauch F, Bishop NJ, Montpetit K, Ruck Gibis J, Travers R, Glorieux FH. Pamidronate treatment of severe osteogenesis imperfecta in children under 3 years of age. J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85: 1846 1850.
10. Zeitlin L, Rauch F, Travers R, Munns C and Glorieux FH. The effect of cyclical intravenous pamidronate in children and adolescents with osteogenesis imperfecta type V. Bone. 2006; 38: 13 20.
11. Zacharin M and O'Sullivan M Intravenous pamidronate treatment of polyostotic fibrous dysplasia associated with the McCune Albright syndrome. J Pediatr. 2000 ; 137: 403 409. 12. Hoekman K, Papapoulos SE, Peters AC and Bijvoet. Characteristics and bisphosphonate treatment of a patient with juvenile osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 1985; 61: 952 956.
13. Sellers E, Sharma A and Rodd C. The use of pamidronate in three children with renal disease. Pediatr Nephol. 1998; 12: 778 781
14. Adami S, Bhalla AK, Dorizzi R, Montesanti F, Rocini S, Salvagno G, Cascio V. The acute phase response after bisphosphonate administration. Calcif Tissues Int. 1987; 41:326 331.
15. Thiebaud D, Sauty A, Burckhardt P, Leuenberger P, Sitzler L, Green JR, Kandra A, Zieschag J, Ibarra de Palacios. An in vitro and in vivo study of cytokines in the acute phase response associated with bisphosphonates. Calcif Tissue Int. 1997; 61: 386 392.
16. Gong Y, Vikkula M, Boon L, Liu J, Beighton P, Ramesar R, Peltonen L, Somer H, Hirose T, Dallapiccola B, de Paepe A, Swoboda W, Zabel B, Superti Furga A, Steinmann B, Brunner HG, Jans A, Boles RG, Adkins W, van den Boogaard MJ, Olsen BR and Warman ML. Osteoporosis pseudoglioma syndrome, a disorder affecting skeletal strength and vision, is assigned to chromosome region 11q12 13. Am J Hum Genet. 1996 ; 59: 146 151.
17. Hey PJ, Twells RC, Phillips MS, Yusuke Nakagawa, Brown SD, Kawaguchi Y, Cox R, Guochun Xie, Dugan V, Hammond H, Metzker ML, Told JA and Hess JF. Cloning of a novel member of the low density lipoprotein receptor family. Gene. 1998; 216: 103 111.
________________________________________________________________Artigo 2
19. Jiao X, Ventruto V, Trese MT, Shastry BS and Hejtmancik JF. Autosomal recessive familial exudative vitreoretinopathy is associated with mutations in LRP5. Am J Hum Genet. 2004; 75: 878 884.
20. Little RD, Carulli JP, Del Mastro RG, Dupuis J, Osborne M, Folz C, Manning SP, Swain PM, Zhao SC, Eustace B, Lappe MM, Spitzer L, Zweier S, Braunschweuger K, Benchekroun Y, Hu X, Adair R, Chee L, FitzGerald MG, Tulig C, Caruso A, Tzellas N, Bawa A, Franklin B, Mc Guire S, Nogues X, Gong G, Allen KM, Anisowiez A, Morales AJ, Lomedico PT, Recker SM, Van Eerdewegh P, Recker RR and Johnson ML. A mutation in the LDL receptor related protein 5 gene results in the autosomal dominant high bone mass trait. Am J Hum Genet. 2002; 70: 11 19.
21. Toomes C, Bottomley HM, Jackson RM, Towns KV, Scott S, Mackey DA, Craig JE, Jiang L, Yang Z, Trembath R, Woodruff G, Gregory Evans CY, Gregory Evans K, Parker MJ, Black GC, Downey LM, Zhang K and Inglehearn CF. Mutations in LRP5 or FZD4 underlie the common familial exudative vitreoretinopathy locus on chromosome 11q. Am J Hum Genet. 2004; 74: 721 730.
___________________________________________________________________Artigo 3
ARTIGO 3:
SEGURANÇA E EFICÁCIA DO USO DE ÁCIDO ZOLEDRÔNICO COMPARADO AO
PAMIDRONATO EM CRIANÇAS COM OSTEOGENESIS IMPERFECTA: Um ano de
seguimento.
Elizabete Ribeiro Barros1, Gabriela L Saraiva1e Marise Lazaretti Castro1
Unidade de doença osteo metabólica, Divisão de Endocrinologia, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil.
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Authors: Elizabete Ribeiro Barros1*, Gabriela L Saraiva1e Marise Lazaretti Castro1
Bone and Mineral Unit, Division of Endocrinology, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil.
*Corresponding author's: Elizabete Ribeiro Barros. Rua Pedro de Toledo, 781, 12 andar, Vila Clementino. São Paulo SP Brazil. CEP: 04039 032. Fone: 55 11 50845231. Fax: 55 11 50845231. E mial: elizabete.barros@unifesp.br
Key words: osteogenesis imperfecta, zoledronic acid, efficacy, BMD, pamidronate.
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Osteogenesis imperfecta (OI) is a genetic disorder that occurs in 1 out of 20,000 newborns [1] and is characterized by bone fragility and an increased risk of fractures and skeletal deformities. Its most common defect is derived from a disruption of type I collagen, the major protein component of bone tissue. The OI pleiotropic phenotype is given by a series of clinical features that may or may not be present, such as blue sclera, dentinogenesis imperfecta, short stature, skeletal deformities, ligamentous laxaty, and hearing loss [2]. Its severity is closely related to the number of fractures and bone deformities, which can vary widely in different types of OI, even among patients the same family.
According to the original classification of Sillence [3] in 1979, OI was classified based upon clinical findings as type I, II, III, or IV; this classification system has become broadly employed. Progress in molecular studies has added three new types (V, VI, VII) to this syndrome classification [4 7]. However, due to the relative inaccessibility of molecular screening for mutation, diagnosis and classification of OI is still based on clinical features. OI type I is characterized by mild clinical findings in patients with frequent familial inheritance of autosomal dominant traits. Type II is the most severe form, usually lethal in the neonatal period. Type III is characterized by multiple fractures and severe skeletal deformity, which ultimately limits the patient to a wheelchair. The latter generally presents height and weight impairment, while maintaining characteristic facies including a triangular shape of the face, prognathism and frequent dental abnormalities. Type IV is of intermediary clinical severity between types I and III.
The bone mineral density in patients with OI (measured by DXA) is generally low. Moreover, histomorphometric studies have shown increased osteoclastic activity and
decreased osteoblastic activity, with markedly reduced bone volume [8.9].
Until recently, the treatment of OI was based almost exclusively on orthopedic surgery aimed at correcting fractures and/or deformities. However, clinical treatment with
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outcomes for OI patients [11 16]. Different doses and intervals have been reported, but for safety reasons, the infusion rate needs to be slow, usually taking four hours or more.
A late generation bisphosphonate of higher antiresorptive potency, termed as zoledronic acid, can be used with faster infusions of between 15 and 30 minutes, and is becoming an attractive therapeutic option. The rapid infusion rate considerably facilitates its use in children. However, the safety and effectiveness of its use in the child population is still limited. In 2004, Hogler et al. [17] described the use of zoledronic acid in a group of 34 children suffering from various bone disorders, including Mc Cune Albright syndrome, steroid induced osteoporosis, Perthes disease, and avascular necrosis. The study demonstrated that zoledronic acid was safe. Later, Munns et al. [18] described the use of zoledronic acid in a group of children with diseases like those described by Hogler, reinforcing its safety.
Based on these observations, we conducted a prospective, open study in children with OI, wherein patients were randomly selected and randomized to receive either zoledronic acid or pamidronate in order to evaluate the comparative safety and effectiveness of these bisphosphonates.
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This research protocol was previously approved by the Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) ethics committee, and all of the patients’ legal guardians furnished written consent.
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The PAM group was composed of 11 children with an average age of 9.2±4.6, consisting of nine boys and two girls (Table 1). The dose intervals varied with age. Children under three years of age received pamidronate in a dosage of 1 mg/kg/day for two consecutive days, every three months, and children over three years of age received pamidronate in a dosage of 1 mg/kg/day for two consecutive days, every four months. The pamidronate was diluted in a sterile saline solution at 0.9%, and was infused intravenously during a period of four hours.
The ZOL group was composed of 12 children, with an average age of 6.1±4.0, consisting of eight boys and four girls. The dose intervals varied with age. Children under three years of age received zoledronic acid with a dosage of 0.025 mg/kg/day for two consecutive days, every three months, and children over three years received zoledronic acid with a dosage of 0.05 mg/kg/day for two consecutive days, every four months. Zoledronic acid was diluted in a sterile saline solution at 0.9% in volumes that varied from 50 to 100ml according to the child’s weight, and was infused during a period of 30 minutes. Zoledronic acid (Zometa®) was kindly supplied by Novartis, and the pamidronate used was obtained from the hospital pharmacy as used in the daily clinical treatment of OI.
Both the PAM and ZOL groups received a total of four cycles of biphosphonates. All patients also received daily vitamin D and calcium supplements in the appropriate doses for their age.
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Before starting the treatment and before every subsequent infusion, fasting blood samples were collected to determine the total calcium (Ca), total alkaline phosphatase (AP), phosphorus (P), intact parathyroid hormone (i PTH), aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase (ALT), hemogram, and creatinine (Cr). Osteocalcin (OC) and linked C telopeptide of type I collagen (CTX) were measured at baseline and before the last (4th) infusion.
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were measured by kinetic UV IFCC (Roche Diagnostics, USA). Hemogram was obtained by an automatic method (Cell Dyn 3700/Abbott, USA). Immunoradiometric assays (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capristrano, CA) were employed to measure 25OH vitamin D at baseline.
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The patient’s weight was measured using an electronic scale (FilizolaR Mod E 300) with a sensitivity of 200 g, and height was determined using a stadiometer with a sensitivity of 1 mm. Children with important deformities in the limbs, or younger than three years, were measured in the horizontal position. All other measurements were done in an ortostastic position. Height and weight measurements were converted to an age and sex specific Z score using reference software [19].
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BMD was performed in the antero posterior direction at the lumbar spine (lumbar vertebra 1 to 4) and total body using a Hologic QDR 4500A (Hologic, Inc., Waltham, MA, USA) at baseline and after the 4th infusion of either pamidronate or zoledronic acid. Areal BMD (g/cm2) and BMC (g) were measured and the Z scores from the lumbar spine BMD were calculated by pediatric software based on an age and sex matched normal population from a database provided by the densitometer manufacturer. The second densitometry was done within 30 days of the last infusion of pamidronate or zoledronic acid. Lumbar spine BMD was obtained in the PAM group in 8 and 10 patients at baseline and at the end of the study, respectively. For the ZOL group, BMD was obtained in 9 and 11 children at baseline and after treatment, respectively. Severe scoliosis was the major limiting factor in the analysis of lumbar spine BMD. Total body BMD at baseline was obtained in the PAM group in 10 patients at baseline and after treatment, whereas in the ZOL group, it was measured in 12 patients at baseline and 11 after treatment.
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Statistical analyses were done with Statistical Analysis System (SAS) version 9.1.
