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Bioquímica clínica em geriatria

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Academic year: 2021

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Faculdade de Farmácia

Bioquímica Clínica em Geriatria

Maria Regina Nolasco Martins Viseu

Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora

Maria João Monteiro dos

Santos Ferreira da Silva e coorientado pela Professora Doutora Maria Cristina

Crespo Ferreira Silva Marques.

Mestrado em Análises Clínicas

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O estágio no âmbito do VIII Mestrado em Análises clínicas decorreu no período de 1 de março de 2016 a 31 de agosto de 2016, em dois laboratórios diferentes, pelo que este relatório está dividido em duas partes.

Na primeira parte irei descrever a atividade desenvolvida no laboratório de Imunologia e Biologia Molecular (LIBM) do Centro Hospitalar de Setúbal que decorreu em regime laboral de 35 horas semanais, sob a orientação da Dr.ª Maria João Peres, assistente principal da carreira dos técnicos superiores de saúde e farmacêutica especialista, compreendendo as áreas laboratoriais Pré-analítica, Imunologia e Biologia Molecular. A segunda parte corresponderá à atividade desenvolvida no Dr. Joaquim Chaves, Laboratório de Análises Clínicas (JCLAC) em regime pós-laboral e que abrangeu o core laboratorial - área de Hematologia e Química Clinica, sob a orientação do farmacêutico especialista Dr. Carlos Cardoso.

Na globalidade, este estágio permitiu realizar e observar metodologias desenvolvidas em diferentes plataformas analíticas, para determinação de uma enorme variedade de parâmetros laboratoriais. Neste relatório irei dar uma explicação resumida das metodologias utilizadas, dos parâmetros analíticos e do seu valor semiológico.

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The internship for the 8th Master’s in clinical analysis took place between 1st March and 31st August 2016, in two different laboratories, which is why the report is divided into two parts.

In the first part, I will describe the work undertaken in the immunology and molecular biology laboratory of Setúbal Hospital, during a 35-hour weekly schedule, under the guidance of Dr. Maria João Peres, health and pharmaceutical specialist in the pre-analytical, immunology and molecular biology laboratory areas.

The second part focusses on the work done at the Dr. Joaquim Chaves clinical analysis laboratory after working hours, which included the laboratory core areas of hematology and clinical chemistry, under the guidance of the specialist pharmacist, Dr. Carlos Cardoso.

Overall, this internship allowed the observation and practice of methodologies that were developed with different analytical platforms, to determine a wide variety of laboratory parameters. In this report, I will give a brief explanation of the methodologies used, analytical parameters and their diagnostic value.

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I. Lista de abreviaturas 1

II. Índice de figuras 5

III. Índice de tabelas 6

Parte I – Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular 7

Introdução 7

A – Imunoquímica 7

1. Sistemas analíticos e metodologias 8

1.1 ImmunoCAP250® 8

1.2 Microarray ImmunoCAP ISAC® 9

2. Parâmetros analíticos e valor semiológico 10

2.1 Doseamento IgE total 10

2.2 Doseamento de IgE específica 10

2.3 Phadiatop® e phadiatop® infant 11

2.4 Triptase 11

2.5 ImmunoCAP ISAC 12

B. Imunidade Celular 12

1. Subsecção Citometria de Fluxo 12

1.1 Sistemas analíticos e metodologias 13 1.1.1 Citómetro de Fluxo BD FACSCanto II

e BD Sample Preparation Assistent III 13 1.2. Parâmetros analíticos e valor semiológico 14 1.2.1 Imunofenotipagem Linfocitária 14

1.2.2 Tipagem HLA B27 14

1.2.3 Teste de ativação de basófilos 15 2. Subsecção Cultura Celular

15

2.1 Sistemas analíticos 15

2.1.1 Leitor de radiação Beta Microbeta 1450 Plus

e Cell Harvester Wallac 15

2.2 Parâmetros analíticos e valor semiológico 17

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C. Biologia Molecular 19

1. Sistemas analíticos e metodologias 19

1.1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 19

1.2 PCR/RT-PCR e CLART® – Clinical Array Technology 20

1.3 RT-PCR e Autoblot 3000 21

2. Parâmetros analíticos e valor semiológico 22

2.1 Carga Viral do HIV-1 22

2.2 Carga Viral do HCV 22

2.3 Carga Viral do HBV 23

2.4 Pesquisa e Tipagem do DNA do Vírus do

Papiloma Humano (HPV) 23

2.5 Pesquisa de vírus Herpes e Neurotrópicos 24

2.6 Pesquisa de vírus Respiratórios 24

2.7 Genotipagem do vírus da hepatite C 25

D. Controlo de Qualidade 25

Parte II – Dr. Joaquim Chaves, Laboratório de Análises Clínicas (JCLAC) 29

Introdução 29

A - Química Clínica 29

1. Sistemas analíticos e métodos gerais 30

1.1 ADVIA® 2400 Chemistry System 30

1.2 ADVIA Centaur® Immunoassay System 32

1.3 IMMULITE® 2000 33

1.4 CLINITEK Atlas® Automated Urine Chemistry Analyzers 34

1.5 UF1000i Sysmex 35

1.6 CAPILLARYS™ 2 FLEX Piercing – Sebia 36

1.7 Cobas e-411 37

2. Parâmetros analíticos e valor semiológico 37

2.1 Metabolismo das proteínas 37

2.2 Metabolismo dos lípidos 40

2.3 Metabolismo dos hidratos de carbono 41

2.4 Metabolismo fosfo-cálcico 43

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2.8 Estudo da função hepática 48

2.9 Estudo da função pancreática 50

2.10 Marcadores bioquímicos da doença cardiovascular 51

2.11 Endocrinologia 52

2.12 Urina e outros líquidos biológicos 55

B- Hematologia Clínica 59

1. Sistemas analíticos, metodologias, parâmetros analíticos e valor

Semiológico 60

1.1 ADVIA® 2120i Hematology System / ADVIA® 2120i

Hematology System With autoslide 60

1.1.1 Hemograma 61

1.1.2 Validação analítica do hemograma 61 1.1.3 Morfologia do sangue periférico 66

1.2 VES-Matic Cube-200 70

1.2.1 Velocidade de sedimentação glomerular 70

1.3 BCS® XP System 71

1.3.1 Testes de rastreio para o estudo da coagulação 71

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Lista de abreviaturas AEQ – Avaliação externa da qualidade

ACTH – Hormona adrenocorticotrópica (adrenocorticotropic hormone) ADH – Hormona antidiurética (antidiuretic hormone)

ALP – Fosfatase alcalina (alkaline phosphatase) ALT – Alanina aminotransferase

APO – Apolipoproteínas

aPTT – Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (activated partial thromboplastin time)

ASCUS – Células escamosas atípicas de significado indeterminado (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance)

AST – Aspartato aminotransferase

BCIP/NBT – 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt/ nitro blue

tetrazolium

BNP – Péptido natriurético tipo B (Brain Natriuretic Peptide) CAR – Clinical Array Reader

CHKS – Programa de Acreditação Internacional para organizações

prestadoras de cuidados de saúde (Caspe Healthcare Knowledge System) CHS – Centro Hospitalar de Setúbal, E.P.E.

CIN – Neoplasia cervical intraepitelial (Cervical intraepithelial neoplasia) CK-MB – Creatina cinase fração MB (creatine kinase-MB)

CMV – Citomegalovírus

Con A – Concanavalina A cp/mL – Cópias por mililitro CPM – Cintilações por minuto

CQI – Controlo de Qualidade Interno

CRH – Hormona de libertação de corticotropinas (Corticotropin-releasing hormone)

CRL – CORE laboratorial

CRP – Proteína C reativa (C reactive protein) cTnT – Troponina T cardíaca

CV – Coeficiente de variação DGS – Direção Geral de Saúde

DNA – Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid) EA – Éster de acridina

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2

EBV – Vírus Epstein Barr (Epstein–Barr vírus) ECZ – Eletroforese capilar de zona

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético (Ethylenediaminetetraacetic acid) EQL – Electroquimioluminescência

Eta – Erro Total admissível

FEIA – Ensaio imunofluorenzimático (Fluoro-Immuno-Enzymatic method) FSH – Hormona folículo estimulante (Follicle-stimulating hormone) GH – Hormona do crescimento (growth hormone)

γGT – Gama-glutamiltransferase

3H – Trítio

HbA1c – Hemoglobina A 1 glicada

HBV – Vírus da hepatite B (hepatitis B virus) HCV – Vírus da hepatite C (hepatitis C virus)

HDL – Lipoproteína de alta densidade (High-density lipoprotein)

HGB – Hemoglobina

HHV – Herpes vírus humano (Human herpesvirus)

HIV – Vírus da imunodeficiência humana (human immunodeficiency vírus) HLA – Antigénio Leucocitário Humano (human leukocyte antigen)

HPV – Vírus do Papiloma Humano (Human Papiloma Virus) HSV – Vírus Herpes Simplex (Herpes simplex vírus)

HCT – Hematócrito

IgA – Imunoglobulina A

IgE – Imunoglobulina E

IGF1 – Fator de crescimento semelhante à insulina 1 (Insulin-like growth factor 1)

IgG – Imunoglobulina G

IgM – Imunoglobulina M

INR – Índice internacional normalizado (International normalized ratio) ISE – Elétrodo seletivo de iões (ion-selective electrode)

ISU – ISAC Standardized Units

ITA – Instruções de Trabalho Analítico

JCLAC – Dr. Joaquim Chaves, laboratório de Análises Clínicas LAS – Liquido ascítico

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LDH – Lactato desidrogenase

LDL – Lipoproteína de baixa densidade (Low-density lipoprotein) LH – Hormona luteinizante (Luteinizing hormone)

LIBM – Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular LIEBG – Lesão intra epiteliais de baixo grau

MCH – Hemoglobina globular média (Mean corpuscular hemoglobina)

MCHC – Concentração de hemoglobina globular média (Mean corpuscular hemoglobin concentration)

MCV – Volume globular médio (Mean corpuscular volume) MN – Mononucleares

MPV – Volume médio das plaquetas (Mean platelet volume)

NADH – Dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzido (Nicotinamide adenine dinucleotide reduced)

NADPH – Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzido (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced)

NK – Natural killer

NT-proBNP – Propéptido natriurético tipo B fração N terminal (N-Terminus Pro Brain Natriuretic Peptide)

QL – Quimioluminescência

QLC – Quimioluminescência competitivo QLNC – Quimioluminescência Não Competitivo QS – Padrão de Quantificação (quantification standart)

PCR – Reação em cadeia da polimerase (Polimerase chain reaction)

PDW – Variação da distribuição do volume plaquetário (Platelet distribution width)

PHA – Fitohemaglutinina (Phytohaemagglutinin)

Plt – Plaquetas

PMN – Polimorfonucleares

PTH – Paratormona (Parathyroid hormone)

PWM – Pokeweed mitogen

RBC – Eritrócitos (Red blood cell)

RDW – Variação da distribuição do volume eritrocitário (Red cell distribution width)

RLU – Unidades relativas de luz (Relative Luminescence Units) RNA – Ácido ribonucleico (Ribonucleic acid)

RT – Transcriptase reversa (reverse transcriptase)

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SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida T3 – Hormona triiodotironina

T4 – Hormona tiroxina

TAB – Teste de ativação de basófilos TCR – Recetor dos linfócitos T (T cell receptor) TFG – Taxa de Filtração Glomerular

TP – Tempo de protrombina

TRH – Hormona libertadora de tirotrofina (Thyrotropin-releasing hormone) TSH – Hormona estimuladora da tiroide (Thyroid-stimulating hormone) TTL – Teste de Transformação Linfoblástica

UI/mL – Unidades internacionais por mililitro UTR – Região não transcrita (Untranslated region) UV – Ultravioleta

VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade (Very Low-density lipoprotein) VSG – Velocidade de sedimentação globular

VZV – Vírus Varicela Zoster (Varicella zoster vírus) WBC – Leucócito (White blood cell)

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Índice de figuras

Figura 1 – ImmunoCAP250 8

Figura 2 – LuxScan 10K-B microarray scanner 9

Figura 3 – FACSCanto II 13

Figura 4 – SPAIII 13

Figura 5 – Microbeta 1450 Plus 16

Figura 6 – Cell Harvester 16

Figura 7 – COBAS AmpliPrep 19

Figura 8 – COBAS TaqMan 19

Figura 9 – Tecnologia TaqMan 19

Figura 10 – Termociclador Biometra 20

Figura 11 – CAR (Clinical Array Reader) 20

Figura 12 – Tira CLART®CS 20

Figura 13 – Termociclador Biometra 21

Figura 14 – Autoblot 3000 21

Figura 15 – Versant HCV Genotype 21

Figura 16 – Advia®2400 30

Figura 17 – ADVIA Centaur® Immunoassay System 32

Figura 18 – IMMULITE® 2000 33

Figura 19 – CLINITEK Atlas 34

Figura 20 – UF1000i Sysmex 35

Figura 21 – CAPILLARYSTM 2 FLEX 36

Figura 22 – Cobas e-411 37

Figura 23 – ADVIA® 2120i 59

Figura 24 – ADVIA® 2120i autoslide 59

Figura 25 – Diferentes apresentações dos resultados do hemograma

no equipamento ADVIA®2120 61

Figura 26 – Citograma gerado no canal de basófilos 62

Figura 27 – Histograma gerado no canal de basófilos 62

Figura 28 – Histograma gerado no canal da peroxidase 63

Figura 29 – Histograma do volume da célula 64

Figura 30 – Histograma da concentração em hemoglobina 64

Figura 31 – Citograma volume da célula/hemoglobina 65

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Figura 33 – histograma da concentração em hemoglobina 65

Figura 34 – Citograma da maturação/tamanho da célula 66

Figura 35 – VES-Matic 70

Figura 36 – BCP ® XP Cube-200 71

Índice de tabelas

Tabela 1 – Parâmetros instalados no equipamento ImmunoCAP250 9

Tabela 2 – Parâmetros efetuados no Citómetro de Fluxo BD FACSCanto II 14

Tabela 3 – Parâmetros efetuados na subsecção de cultura celular 17

Tabela 4 – Parâmetros efetuados no COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 20

Tabela 5 – Parâmetros efetuados pela tecnologia PCR/RT-PCR e

Clinical Array Technology 21

Tabela 6 – Parâmetros efetuados por RT-PCR/Reverse dot-blot 22

Tabela 7 – Plano de controlo de qualidade do LIBM 28

Tabela 8 – Alguns parâmetros instalados no equipamento ADVIA®2400 31

Tabela 9 – Alguns parâmetros instalados no equipamento ADVIA®Centaur 33

Tabela 10 – Alguns parâmetros instalados no equipamento IMMULITE® 2000 34

Tabela 11 – Princípio das tiras reativas: Multistix 10SG 35

Tabela 12 – Parâmetros instalados no equipamento CAPILLARYS™ 2

FLEX Piercing 36

Tabela 13 – Alguns parâmetros instalados no equipamento Cobas e-411 37

Tabela 14 – Exemplo de critérios de alarmes por parâmetro 66

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PARTE I – Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular Introdução

O Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular (LIBM) faz parte do Serviço de Imunoalergologia do Centro Hospitalar de Setúbal, EPE. e desde 2013 está integrado no Departamento de Medicina.

Este laboratório iniciou a sua atividade em janeiro de 1994, sob a direção do Professor Doutor Filipe Inácio, Diretor de Serviço de Imunoalergologia.

Atualmente está atribuída a responsabilidade técnica do LIBM à Dr.ª Maria João Peres, farmacêutica, técnica superior de saúde e especialista em análises clínicas, tendo sido a orientadora deste estágio.

As áreas de interesse são a Imunoalergologia, na vertente de Imunoquímica e Imunidade Celular, e a Biologia Molecular, dando resposta às necessidades da consulta de Imunoalergologia, Infeciologia, Pneumologia, Pediatria, Gastrenterologia, Dermatologia e Ginecologia, serviços com os quais mantém relações prioritárias. Estabelecendo-se uma colaboração com o Serviço de Patologia Clínica, no sentido de otimização dos recursos dos dois laboratórios na área da autoimunidade.

Em 2008 iniciou o Programa de Acreditação Internacional para organizações prestadoras de cuidados de saúde - CHKS, implementado no CHS tendo desde 2010 obtido o título de Acreditado pelo CHKS- Healthcare Acreditation and Quality Unit assim como a “Certificação pela ISO 9001:2008 - Departamento de Patologia” e que tem mantido nas auditorias de monitorização anuais subsequentes.

Em 2013 integrou a Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnostico da Gripe uma vez que no LIBM se efetua o Diagnostico Molecular Diferencial de Vírus Respiratórios, incluindo o vírus da gripe A, B e C e sua sub-tipagem.

O LIBM está dividido em três áreas distintas: a Imunoquímica, a Imunidade celular (citometria de fluxo e cultura celular) e a biologia molecular.

A – IMUNOQUÍMICA

Esta área está maioritariamente vocacionada para o diagnóstico da doença alérgica mediada por IgE. A maioria dos parâmetros analíticos são efetuados no aparelho automatizado ImmunoCAP250.

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1. Sistemas analíticos e metodologias 1.1 ImmunoCAP250

Auto analisador concebido para efetuar todos os passos, desde a distribuição de amostras, reagentes, poços de diluição; ao processamento de todas as etapas: incubação, lavagem, leitura, cálculo e impressão dos resultados. Permite a realização de cerca de 250 testes por dia.

Fig. 1 – ImmunoCAP250 (www.thermofisher.com)

Princípio do método: (ensaio imunofluorenzimático – FEIA) O método FEIA é um

imunoensaio não competitivo de duplo anticorpo (tipo sandwich) em que o anticorpo monoclonal anti-IgE permite capturar as IgE humanas. A fase sólida do ImmunoCAP consiste numa celulose integrada numa cápsula (CAP). Este polímero hidrofílico, altamente ramificado, promove a base ideal para os alergénios se ligarem de forma irreversível e manter a sua forma nativa. Os alergénios ligados covalentemente à fase sólida reagem com as IgE presentes na amostra biológica. Após lavagens é adicionado à mistura, um anticorpo anti-IgE marcado com β-Galactosidade. É adicionado o substrato-4-metilberil-β-D-Galactosidase (solução de desenvolvimento) e a reação desencadeada é parada pela adição de uma solução de Carbonato de Sódio (solução stop). Forma-se um produto fluorescente que é medido num Fluorímetro, quanto maior a fluorescência, mais elevados são os níveis de IgE específica. A organização mundial de saúde estabeleceu um padrão internacional para a IgE, expresso em unidades internacionais por mililitro (UI/mL).

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Tabela 1 – Parâmetros instalados no equipamento ImmunoCAP250

Parâmetro Método Amostra

IgE total FEIA Soro/plasma

IgE específica FEIA Soro/plasma

Phadiatop® FEIA Soro/plasma

Phadiatop® infant FEIA Soro/plasma

Triptase FEIA Soro

1.2 Microarray ImmunoCAP ISAC®

Fig.2 LuxScan 10K-B microarray scanner

(www.phadia.com/en-US/Products/Products/ImmunoCAP-ISAC/Test-Principle-ImmunoCAP-ISAC)

Princípio do método: A metodologia baseia-se na imobilização de pequenas

quantidades dos componentes alergénicos purificados numa matriz sólida (biochip). O biochip, no qual as diferentes moléculas nativas e recombinantes estão fixadas numa determinada disposição, forma um array microscópico. Isto permite a monitorização simultânea e em paralelo das interações biológicas com pequenas quantidades amostra e de reagente. Num ensaio de duas fases, os anticorpos do soro do doente ligam-se aos componentes de alergénios imobilizados. A reação é evidenciada pela presença de um fluoróforo ligado ao anticorpo secundário. O laser do scanner vai excitar o fluoróforo que emite radiação luminosa a um determinado comprimento de onda. O sinal é transformado pelo software numa imagem. Atualmente, esta técnica permite avaliar a sensibilização a mais de 100 componentes correspondendo a cerca de 50 alergénios. O ImmunoCAP ISAC é um teste semi-quantitativo e os resultados são reportados em ISU (ISAC Standardized Units), dando indicações dos níveis de IgE específica num intervalo de valores entre 0.3-100 ISU.

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2. Parâmetros analíticos e valor semiológico 2.1 Doseamento IgE total

A IgE é uma classe de anticorpos muito importante na defesa contra infeções provocadas por parasitas, especialmente helmintes e alguns protozoários. No entanto, níveis baixos ou não detetáveis de IgE, não predispõem o individuo às infeções parasitárias graves. Esta imunoglobulina não tem um papel importante nas infeções bacterianas, porque não ativa o sistema do complemento, tendo por isso a sua maior relevância clínica na doença alérgica. A IgE é um monómero que medeia as reações de hipersensibilidade imediata (tipo I). O diagnóstico da doença alérgica tem como finalidade identificar o alergénio implicado e estabelecer uma relação de causa-efeito. A anamnese é fundamental neste processo, assim como os testes de diagnóstico in vitro, principalmente em situações clinicas em que as provas in vivo, nomeadamente, testes cutâneos e prova de provocação, estão contraindicadas.

Valor semiológico: As indicações clínicas para a determinação da IgE total são o

diagnóstico da síndrome de Híper IgE, no seguimento de doentes com Aspergilose broncopulmonar alérgica uma vez que em episódios agudos há um aumento considerável desta imunoglobulina; no estudo de famílias atópicas, e no seguimento de doentes em tratamento com anticorpos monoclonais anti-IgE (Omalizumab).

2.2 Doseamento IgE específica

A determinação da IgE específica permite dar informação sobre o estado de sensibilização de um individuo a um determinado alergénio e que poderá reagir a ele em caso de exposição. Com um teste quantitativo e preciso, a presença de anticorpos IgE pode ser detetada precocemente, permitindo a definição da melhor estratégia de abordagem do doente alérgico. Existe disponível uma elevada variedade de alergénios comerciais: pneumoalergénios (pólen, fungos, animais, ácaros, etc.), alimentos, veneno de himenópteros, ocupacionais e fármacos. Indivíduos com níveis elevados de IgE específica tem maior probabilidade de desenvolver sintomatologia alérgica, do que os indivíduos com níveis de IgE baixos. No entanto, é de salientar que resultados negativos, em histórias clínicas muito sugestivas de alergia, não excluem a doença alérgica.

A introdução da biologia molecular e da proteómica permitiu desenvolver, para alguns alergénios, mais do que uma molécula alergénica dentro de cada extrato alergénico e alergénios recombinantes. O estudo alergológico molecular permite outro nível de compreensão da sensibilização a um determinado alergénio, que varia

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significativamente de indivíduo para indivíduo. Dá informação mais precisa sobre as proteínas alergénicas e o perfil de reconhecimento do doente, que confere diferentes características clínicas. A presença de IgE pode ser detetada em estadios precoces, indicando uma sensibilização antes de se desenvolver sintomatologia clínica. Ajuda a elucidar e acompanhar a marcha alérgica e permite determinar o grau de sensibilização, ou seja, os alergénios que contribuem para os sintomas. Auxilia na orientação e monitorização da terapêutica.

Valor semiológico: A determinação da IgE especifica é indicada em indivíduos com

dermografismo ou dermatite grave; doentes em terapêutica com anti-histamínicos; doentes com níveis de sensibilização extremos, nos quais os testes in vivo poderão desencadear reações anafiláticas e avaliação de sensibilização a alergénios tóxicos. Nunca será uma alternativa à história clínica e aos testes cutâneos, mas poderá acrescentar valor diagnóstico na interpretação de provas cutâneas duvidosas. É importante no diagnóstico de alergia a veneno de himenópteros, alergia alimentar, estudo dos doentes polissensibilizados, no seguimento da evolução clínica e monitorização do tratamento.

2.3 Phadiatop® e phadiatop® infant

Teste de rastreio que permite a diferenciação entre atópicos e não atópicos. É o primeiro passo quando se suspeita de uma etiologia alérgica perante sintomas típicos como problemas gastrointestinais, eczema, rinite ou asma. Phadiatop Inalante é um teste utilizado no rastreio da doença alérgica. Demonstra a presença de anticorpos IgE específicos aos alergénios mais comuns do meio ambiente (ácaros, gato, cão, barata, fungos, gramíneas, árvores, ervas infestantes).

Valor semiológico: Um resultado positivo confirma a presença de alergia, o estudo

deve prosseguir com a identificação específica dos alergénios causais. Um resultado negativo indica que os sintomas não são causados por alergénios comuns e devem ser exploradas outras possibilidades.

2.4 Triptase

Os mastócitos desempenham um papel chave nas reações alérgicas e o seu número aumenta sob condições inflamatórias. Quando ativados, eles libertam uma grande variedade de mediadores que conduzem a sinais e sintomas das reações alérgicas, tais como a anafilaxia. Um desses mediadores é a triptase. A triptase é armazenada nos grânulos dos mastócitos em repouso. Quando o mastócito é ativado, quer seja por mecanismos IgE mediados ou não, a triptase é libertada na corrente sanguínea. O

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aumento transitório da triptase sérica, num paciente que sofreu uma reação anafilática, ajuda a identificar e a perceber a gravidade da reação.

Valor semiológico: Valores basais de triptase persistentemente elevados podem ser

indicativos de mastocitose ou de neoplasias hematológicas. Aumentos transitórios de triptase sérica permitem avaliar o risco de uma reação anafilática num paciente. É particularmente útil nas reações graves aos venenos de himenópteros e nas reações perioperatórias.

2.5 ImmunoCAP ISAC

Permite avaliar simultaneamente anticorpos IgE específicos frente a múltiplos alergénios, utilizando pequenos volumes de amostra de soro. Esta ferramenta diagnóstica oferece um diagnóstico personalizado, porque num só ensaio, se obtém o perfil alergénico do doente.

Valor semiológico: Importante na interpretação dos fenómenos de reatividade

cruzada; doentes com sensibilização a mais de 3 alergénios; quando o volume de amostra é insuficiente para um estudo alergológico mais completo, devido à gravidade da alergia (em crianças principalmente); é preditivo das reações graves, e dá indicações precisas para a decisão da imunoterapia específica, para cada doente.

B – IMUNIDADE CELULAR

Esta área está dividida na subseção de citometria de fluxo e cultura celular. Dá resposta aos pedidos solicitados por vários serviços do CHS, nomeadamente, Infeciologia, Pediatria, Imunoalergologia e Medicina Interna, e também a solicitações de outros hospitais.

1. Subsecção Citometria de Fluxo

Os parâmetros imunológicos determinados nesta secção são efetuados por citometria de fluxo, em plataformas semi-automáticas.

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1.1 Sistemas analíticos e metodologias

1.1.1 Citómetro de Fluxo BD FACSCanto II e BD Sample Preparation Assistent III

Fig.3 FACSCanto II Fig.4 SPAIII

(www.bdbiosciences.com/anz/instruments/facscanto/index.jsp / www.bdbiosciences.com/anz/instruments/spa/index.jsp)

Princípio do método: A citometria de fluxo é um método multiparamétrico que

permite analisar de forma individual e simultânea, os componentes estruturais das células. É composto por 3 sistemas principais: fluidos, ótico e eletrónico. O sistema de fluidos move as células numa suspensão salina, através de uma câmara de fluxo. Cada célula passa individualmente, devido à focagem hidrodinâmica da suspensão de células e é atravessada por um feixe de luz, perpendicularmente ao fluxo. O feixe de luz ao intercetar a célula, sofre dispersão na direção frontal (forward scattering), que se correlaciona com o tamanho das células, e da luz lateral (side scattering), que se correlacionada com a complexidade ou granularidade das células. A luz dispersa é detetada, filtrada e convertida em sinais elétricos pelos detetores.

As populações celulares, marcadas com anticorpos conjugados com corantes fluorescentes (fluorocromos), quando são atravessadas pelo laser, geram diferentes sinais fluorescentes, de acordo com o fluorocromos a que se tenham ligado. Os fluorocromos podem absorver fotões (energia) e passar a um estadio de excitabilidade elétrica, libertando energia, maioritariamente sob a forma de luz (fluorescência). As linhagens celulares são separadas de acordo com os diferentes sinais gerados, possibilitando a determinação do grau de maturação e/ou ativação, pela análise da expressão de diferentes moléculas intracelulares ou da superfície celular, classificados como “cluster of differentiation” (CD). As diferentes linhagens celulares no sangue periférico apresentam antigénios específicos na superfície das membranas que permitem a sua contagem e fenotipagem.

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Tabela 2 – Parâmetros efetuados no Citómetro de Fluxo BD FACSCanto II

Parâmetro Reagentes/Kits Amostra

Imunofenotipagem Linfocitária: TBNK

Multitest 6-color da BD

Lise/sem lavagem Sangue total (EDTA)

Tipagem HLA B27 BD- HLAB27 kit

Teste de Ativação de basófilos kit Flow CAST® da Buhlmann

1.2. Parâmetros analíticos e valor semiológico 1.2.1 Imunofenotipagem Linfocitária

A imunofenotipagem linfocitária constitui um parâmetro de avaliação do sistema imunitário do indivíduo. Os linfócitos humanos podem ser divididos, com base na sua função biológica e na expressão de antigénios de superfície celular, em três populações principais: linfócitos T, linfócitos B e linfócitos Natural killer (NK). Os linfócitos supressores/citotóxicos são um subconjunto de linfócito T (CD3+) que são CD8+. Os linfócitos helper/indutores são um subconjunto de linfócitos T (CD3+) que são CD4+. Os linfócitos B são CD19+ e os linfócitos NK são CD16+ e CD56+.

As percentagens ou as contagens de linfócitosCD3+CD8+ e CD3+CD4+ são utilizadas para caracterizar e monitorizar algumas formas de doenças como imunodeficiência e doenças autoimunes.

Valor semiológico: A determinação das percentagens ou contagens dos linfócitos T

helper/indutores pode ser útil na monitorização de indivíduos infetados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Geralmente, os indivíduos com infeção pelo HIV exibem uma diminuição constante das contagens de linfócitos T helper/indutores, à medida que a infeção progride. A percentagem dos linfócitos supressores/citotóxicos situa-se fora do intervalo de referência normal nalgumas doenças autoimunes. A percentagem relativa do subconjunto CD8+ está aumentada em muitos doentes com deficiências imunitárias congénitas ou adquiridas, tais como a imunodeficiência combinada grave (SCID) ou a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA).

1.2.2 Tipagem HLA B27

A sigla HLA (antigénio leucocitário humano) refere-se a um grupo de genes localizados no cromossoma 6, os quais codificam para a síntese de vários marcadores de superfície celular, moléculas apresentadoras de antigénios e outras proteínas do sistema imunológico. O HLA-B27 é uma molécula apresentadora de antigénio encontrada na superfície de várias células imunitárias. A presença dos alelos que

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codificam o HLA-B27 está fortemente associada ao desenvolvimento de algumas patologias autoimunes.

Valor semiológico: A pesquisa do antigénio HLA-B27 constitui um parâmetro de

rastreio de espondilite anquilosante, já que a sua presença está fortemente associada a esta patologia (90% dos indivíduos com ES e 8% dos indivíduos saudáveis). O antigénio HLA-B27 está também presente noutras patologias: síndrome de Reiter, uveíte anterior aguda, doença inflamatória do intestino e artrite reumatoide juvenil.

1.2.3 Teste de Ativação de Basófilos

O teste de avaliação da ativação de basófilos (TAB) é utilizado para o diagnóstico in vitro de reações alérgicas de tipo imediato e hipersensibilidade a alergénios suspeitos. O teste faz a deteção in vitro da expressão do marcador de superfície CD63 (gp53) em basófilos no sangue total, por citometria de fluxo, após a estimulação antigénica. Podem ser detetadas reações IgE mediadas e não-IgE mediadas.

Valor semiológico: Útil no diagnóstico de reações imediatas a diferentes grupos de

fármacos (ex.: β-lactâmicos, anti-inflamatórios não esteroides). Alternativa aos testes de provocação oral, nomeadamente, nas alergias alimentares nas crianças (ex.: alergia ao amendoim), tendo uma boa sensibilidade e especificidade na discriminação entre tolerância e alergia. Permite ajudar na decisão clinica de quando reintroduzir um determinado alimento num doente alérgico (ex.: reintrodução do leite em crianças alérgicas a este alimento), resultados muito elevados nos TAB correlacionam-se muito bem com a gravidade das reações clinicas. Permite selecionar a imunoterapia nos indivíduos alérgicos a venenos de himenóptero, assim como, monitorizar o sucesso dessa imunoterapia.

2. Subsecção Cultura Celular

Esta secção do laboratório envolve a manipulação de fontes radioativas não seladas, sendo por isso licenciado como laboratório de radioisótopos pela Direção Geral de Saúde.

2.1 Sistemas analíticos

2.1.1 Leitor de radiação Beta Microbeta 1450 Plus e Cell Harvester Wallac

Estes equipamentos permitem executar o teste de Transformação Linfoblástica por incorporação do nucleósido radioativo 3H-Timidina.

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Fig. 5 Microbeta 1450 Plus Fig. 6 Cell Harvester

Princípio do método: O teste de transformação linfoblástica (TTL) por incorporação

do nucleósido radioativo [3H] – Timidina no DNA celular, permite a deteção de linfócitos sensibilizados a um antigénio, avaliando a sua resposta proliferativa quando em presença desse antigénio. Este teste baseia-se no facto dos linfócitos ativados se dividirem e desta divisão celular requerer síntese de DNA. Aos linfócitos previamente separados por gradiente de densidade, é fornecida uma fonte exógena de nucleósidos marcados com trítio, que irão entrar da célula, sofrer fosforilação e incorporar-se no DNA durante a replicação cromossómica. Após a incubação com os nucleósidos marcados, os linfócitos são fixados numa membrana (cell harvester). Os nucleósidos livres são removidos pelas lavagens, enquanto os que estão incorporados no DNA permanecem no suporte sólido. A quantidade de radionucleósido presente é determinada por contagem de cintilações (Microbeta 1450 Plus), por transformação da radiação beta de baixa emissão em fotões. O resultado do teste é dado por cintilações por minuto (CPM), sendo determinado um índice de estimulação que deve ser comparado com os valores de referência de cada laboratório.

A resposta imune dos linfócitos inicia-se com um processo de proliferação linfocitária induzida por sinais específicos. Os ensaios de proliferação linfocitária são um meio in vitro simples e semi quantitativo que permite medir a capacidade que os linfócitos têm de responder a um ligando particular. É uma variável útil na imunologia clinica, porque os resultados se correlacionam com a imunidade mediada por células, ou seja, reações de hipersensibilidade do tipo IV.

No LIBM este teste está aferido para medir a proliferação linfocitária em resposta a fármacos, mitogénios e antigénios de memória.

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Tabela 3 – Parâmetros efetuados na subsecção de cultura celular

Parâmetro Reagentes Amostra

TTL – Fármacos Fármacos com formulações solúveis ou suspensões homogéneas

Sangue total (heparinato sódio) TTL – Antigénio de memória Extrato de Candida albicans

TTL – Mitogénios Fitohemaglutinina

Concanavalina A Pokweed

2.2 Parâmetros analíticos e valor semiológico 2.2.1 TTL - fármacos

As reações alérgicas representam um terço das reações adversas a fármacos (RAF). São consideradas eventos raros, mas com elevada morbilidade e mortalidade. Na prática clínica, é muito difícil a correlação de sinais e sintomas das reações alérgicas a fármacos com o mecanismo imunológico envolvido, sem o auxílio de testes laboratoriais. Alguns fármacos podem afetar diretamente o sistema imunitário inato e/ou células efetoras tais como os basófilos (reações pseudoalérgicas ou de hipersensibilidade não-imunomediada), sem envolvimento demonstrado do sistema imunitário especifico. Os sintomas são muito semelhantes. A reação pode ocorrer por mecanismos diferentes (anticorpos ou células T mediada), criando dificuldade na interpretação. Diferentes fármacos podem induzir sintomas muito diferentes. Algumas vezes é o metabolito ou algum componente (excipiente) do fármaco que induz a reação. É praticamente impossível haver testes validados e padronizados disponíveis para todos os fármacos existentes no mercado. A vantagem principal dos sistemas in vitro, que medem as reações celulares T mediadas, é o potencial de detetar o fármaco, mas também comprovar o envolvimento do sistema imunitário. O TTL mede a proliferação dos linfócitos T de memória frente a um fármaco particular, ao qual o doente tenha sido exposto, dando informação sobre o mecanismo patofisiológico subjacente à reação adversa. Tem uma especificidade elevada para vários grupos farmacológicos, incluindo, β-lactâmicos, sulfonamidas e anticonvulsivantes.

Valor semiológico: Particularmente útil nas reações não imediatas graves, nas quais

os testes in vivo estão contra indicados (testes cutâneos e a prova de provocação oral), nomeadamente, necrólise epidérmica tóxica, síndrome Stevens-Johnson, exantema generalizado agudo pustuloso, síndrome de hipersensibilidade a fármacos com eosinofilia e sintomas sistémicos, vasculite e hepatite). Útil no diagnóstico da síndrome de alergia múltipla a fármacos e nos doentes polimedicados.

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2.2.2 TTL - antigénios de memória e mitogénios

Os antigénios, tais como, a Candida albicans e a toxina tetânica, têm sido frequentemente utilizados, como forma de avaliar a resposta celular T específica a antigénios de memória. Os antigénios que são selecionados para avaliar a resposta imunitária, são os mais representativos da maioria da população, quer pela exposição natural (ex.: Candida albicans) quer pela vacinação (ex.: Toxina tetânica). O estímulo com antigénios de memória parece ser mais revelador do grau de comprometimento da resposta imunológica mediada por células, do que o estimulo com mitogénios. Uma vez que os mitogénios conseguem induzir uma resposta proliferativa T, mesmo em linfócitos incapazes de responder adequadamente a estímulos antigénicos (resposta fisiológica). Uma resposta celular T anormal a antigénios, é considerada mais sensível, mas menos específica, no diagnóstico de alterações na função dos linfócitos T. O TTL efetuado tendo como estímulo antigénico a Candida albicans, mede a capacidade das células T de responder, quando o recetor dos linfócitos T (TCR) reconhece esse antigénio, após ser processado e apresentado pelas células apresentadoras de antigénio. Linfócitos T ativados in vitro após exposição a antigénios específicos, confirma que existe um estadio de sensibilização a esse antigénio e que a capacidade de reconhecimento específico de antigénio está intacta.

Os mitogénios são potentes estimuladores da ativação e proliferação dos linfócitos T, independentemente da especificidade antigénica dos linfócitos. Os mitogénios ativam os linfócitos T de forma policlonal, por isso a resposta proliferativa induzida por mitogénios é considerada menos sensível mas mais especifica no diagnóstico de alterações na resposta celular T. Foi demonstrado que as lectinas são mitogénios que se ligam ao TCR, que é glicosilado na sua porção carbohidrato, ativando os linfócitos T quiescentes. Foi demostrado que o estimulo com mitogénios aumentam o cálcio intracelular nos linfócitos T, que é essencial para a proliferação destas células. A fitohemaglutinina (PHA) e a concanavalina A (Con A) são fortes estimuladores dos linfócitos T, e o Pokeweed (PWM) é um mitogénios fraco para os linfócitos T mas induz também a ativação e proliferação dos linfócitos B.

Valor semiológico: É útil na avaliação da função dos linfócitos T em doentes em

terapia imunossupressora, incluindo doentes transplantados e em doentes com suspeita de alterações na imunidade celular. Na avaliação da função dos linfócitos T em doentes com suspeita de imunodeficiências primárias, quer de linfócitos T (Ex.: Síndrome DiGeorge, SCID) ou imunodeficiências combinadas de linfócitos T e B (Ex.: sindrome Wiskott Aldrich, Imunodeficiência comum variável) em que a função dos

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linfócitos T pode estar alterada. Na avaliação da função dos linfócitos em doentes com imunodeficiência secundária, de causa conhecida (Ex.: Infeção por HIV) ou iatrogénica. Avaliação da recuperação da função dos linfócitos T e a sua competência após transplante de medula óssea ou de células estaminais hematopoiéticas.

C – BIOLOGIA MOLECULAR

A aplicação da biologia molecular ao diagnóstico clínico, na área da infeciologia, desenvolveu-se a partir da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), que é baseada na estabilidade térmica da enzima Taq polimerase e em 3 ciclos de temperatura sequenciais, para desnaturar e amplificar sequencias especificas de ácidos nucleicos. É um método simples e rápido, que permite criar um número ilimitado de cópias de DNA, a partir de uma cadeia original. O DNA amplificado pode posteriormente ser utilizado numa série de aplicações, desde o rastreio, diagnóstico e monitorização de doenças. Permite avaliar as decisões clinicas e a terapêutica implementada e aceder às taxas de cura de determinadas patologias.

1. Sistemas analíticos e metodologias 1.1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan

Fig.7 COBAS AmpliPrep Fig. 8 COBAS TaqMan Fig.9 Tecnologia TaqMan

(https://molecular.roche.com/assays/cobas-ampliprep-cobas-taqman-hiv-1-test-v2/)

Princípio do método: tecnologia de PCR em tempo real, num ensaio multiplexado,

através do Instrumento COBAS AmpliPrep, para processamento automatizado das amostras, e do Analisador COBAS TaqMan 48, para amplificação e deteção automatizadas. Permite a amplificação e deteção simultânea do RNA/DNA em tempo real. Fornece resultados quantitativos, de forma rápida, com elevada exatidão e sensibilidade, numa gama alargada de valores. A quantificação ocorre na fase exponencial da amplificação. Na deteção são utilizadas sondas marcadas com flourocromos (sondas TaqMan/ 5’ Nuclease). A redução do número de manipulações permite reduzir os riscos de contaminação. Para uma quantificação mais rigorosa é

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usado um Padrão de Quantificação Interno (QS), que compensa os efeitos de inibição e controla o processo de extração do RNA e de amplificação.

Tabela 4 – Parâmetros efetuados no COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan

Parâmetro Amostra Limite de deteção Intervalo de linearidade

Carga viral HIV-1 Plasma, LCR 20 cp/mL 20 - 10.000.000 cp/mL

Carga viral HCV Plasma, soro 11 UI/mL 15 - 100.000.000 UI/mL

Carga viral HBV Plasma 20 UI/mL 20 – 170.000.000 UI/mL

1.2 PCR/RT-PCR e CLART® – Clinical Array Technology

Fig.10 Termociclador Biometra Fig.11 CAR (Clinical Array Reader) Fig.12 Tira CLART®CS (http://www.biometra.de/index.php/home.html / http://genomica.es/en/in_vitro_diagnostics_products_clart.cfm)

Princípio do método: tecnologia que permite a amplificação de DNA/RNA por PCR

multiplex, qualitativo. Esta tecnologia permite a deteção simultânea de marcadores moleculares múltiplos incluindo a presença de controlos que garantem a fiabilidade dos resultados. O sistema de deteção CLART baseia-se na precipitação de um produto insolúvel naquelas zonas da Tira CLART CS nas quais se produz a hibridização dos produtos amplificados por sondas específicas. Durante a RT-PCR/PCR, os produtos amplificados são marcados com biotina. Após a amplificação, hibridizam-se com as respetivas sondas específicas que estão imobilizadas em locais conhecidos e concretos da Tira CS, após o qual são incubadas com conjugado estreptavidina-peroxidase. O conjugado liga-se através da estreptavidina com a biotina presente nos produtos amplificados (que também se encontram ligados às suas sondas específicas) e a atividade da peroxidase provoca o aparecimento de um produto insolúvel na presença do substrato o-dianisidina, que precipita no local de hibridização da tira CS. A análise do material amplificado é efetuada pela leitura no CAR, dos microarray de baixa densidade, que permite capturar, processar a imagem e interpretar automaticamente cada amostra. Elabora um relatório único para cada amostra analisada.

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Tabela 5 – Parâmetros efetuados pela tecnologia PCR/RT-PCR e Clinical Array

Technology

Parâmetro Método Controlo interno Produto biológico

CLART® Papillomavirus

Humano 2

PCR multiplex DNA amostra (gene CFTR)

reação de amplificação Controlo de deteção

Citobrush do colo do útero, anais e

faríngeos

Suspensões celulares Biopsias e tecidos parafinados

CLART® Entherpex RT-PCR e PCR multiplex reação de amplificação reação de deteção LCR Soro/plasma Zaragatoas Biopsias CLART® PeunomoVir RT-PCR e PCR multiplex reação de amplificação reação de deteção Exsudados nasofaríngeos Lavados Bronco-alveolares Lavados Nasais 1.3 RT-PCR e Autoblot 3000

Fig.13 Termociclador Biometra Fig.14 Autoblot 3000 Fig.15 Versant HCV Genotype (http://www.biometra.de/index.php/home.html / https://www.healthcare.siemens.pt/molecular.../versant-HCV-genotype-2-assay-lipa)

Princípio do método: RT-PCR /Reverse dot-blot. O RNA viral é isolado a partir do

soro ou plasma por lise de partículas virais com um agente caotrópico, ao que se segue a precipitação do RNA com álcool. O RNA extraído é ressuspendido em diluente da amostra. O RNA extraído é submetido à transcrição reversa e amplificação do cDNA por PCR, sequencialmente num único tubo (RT-PCR, Reverse Transcriptase-Polimerase Chain Reaction). A incubação à temperatura ambiente antes da etapa de transcrição reversa, remove as bases uracilo de eventuais produtos de amplificação contaminantes, que possam existir na mistura de reação. A identificação dos genótipos é conseguida por hibridização reversa do amplificado biotinilado com sondas de oligonucleotidos imobilizadas em tiras, especificas das regiões 5’UTR e Core. Após a etapa da hibridação, o produto da PCR não ligado é removido da tira por lavagem e a estreptavidina marcada com fosfatase alcalina (conjugado) liga-se ao híbrido biotinilado. O cromogéneo BCIP/NBT (substrato) reage com o complexo de

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estreptavidina-fosfatase alcalina formando um precipitado de cor púrpura/ castanha, que produz um padrão de bandas visível na tira.

Tabela 6 – Parâmetros efetuados por RT-PCR/Reverse dot-blot

Parâmetro Método Produto biológico

Genotipagem HCV RT-PCR /Reverse dot-blot Soro

Plasma EDTA

2. Parâmetros analíticos e valor semiológico 2.1 Carga Viral do HIV-1

Este teste destina-se a ser utilizado em conjunto com a apresentação clínica e com outros marcadores laboratoriais indicadores da progressão da doença, para o acompanhamento clínico de doentes infetados pelo HIV-1 grupo M (subtipos A-H) e HIV-1 grupo O. Os genes alvo selecionados neste teste são o gag e LTR, porque não são alvos terapêuticos, aumenta a inclusividade dos genótipos, deteta variantes do HIV-1, cria redundâncias no teste e diminui a subquantificação.

Valor semiológico: útil no diagnóstico da infeção por HIV-1 para esclarecimento de

resultados ambíguos e nas infeções agudas (detetável após 10 dias de contacto). No prognóstico da progressão da doença, cargas virais elevadas na infeção aguda, correlacionam-se com uma progressão mais rápida para SIDA. Na prevenção da transmissão da doença, cargas virais mais baixas correlacionam-se com menor risco de transmissão. Na decisão terapêutica, cargas virais inferiores a 100000cp/mL em doentes naive, podem ter regimes terapêuticos variados, enquanto CV superiores limitam os regimes terapêuticos disponíveis. Na monitorização terapêutica: determinar o valor basal (antes do inicio da terapêutica); avaliar a sua eficácia; monitorizar as alterações que possam estar associadas com resistências aos antirretrovirais (blips transientes, virémias baixas persistentes ou cargas virais superiores a 200 cp/mL persistentes)

2.2 Carga Viral do HCV

O teste destina-se a ser utilizado juntamente com a apresentação clínica e com outros marcadores laboratoriais indicadores da infeção por HCV, no seguimento clínico de pacientes com infeção crónica pelo HCV. O teste foi desenvolvido para dar uma resposta equivalente para os genótipos 1 a 6 do HCV. A região alvo selecionada é a 5' não traduzida do genoma do HCV (5’-NTR) e é utilizada a tecnologia dual-probe.

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Valor semiológico: Útil no rastreio da infeção por HCV, confirmando a infeção nos

doentes com anticorpos anti-HCV positivos. No diagnóstico das infeções agudas, no período janela (menor ou igual a 2 semanas) e nas infeções crónicas (mais de 6 meses com anti-HCV positivos). Na decisão terapêutica, pela determinação do valor basal da carga viral, avaliação da eficácia da terapêutica posteriormente instituída e na avaliação da clearance espontânea do vírus nas infeções agudas. Na monitorização durante a terapêutica (adesão, cinética de resposta e pós-terapêutica). Este teste permite avaliar se ocorreu a cura pós terapêutica e monitorizar os doentes com comportamentos de risco (possíveis reinfeções).

2.3 Carga Viral do HBV

Os resultados do teste deverão ser interpretados, tendo em consideração todos os achados clínicos e laboratoriais. O teste produz resultados equivalentes para os oito genótipos do HBV de A a H, e para o HBV com mutações mais comuns do pré-core. Os genes alvo são na região altamente conservada do pré-core e core. Não se destina a ser utilizado como um teste de rastreio para a presença do HBV no sangue ou em produtos derivados do sangue, nem como um teste de diagnóstico visando confirmar a presença de infeção pelo HBV.

Valor semiológico: A monitorização dos níveis de DNA do HBV pode predizer o

desenvolvimento de resistência aos fármacos. Uma descida rápida e mantida dos níveis de DNA do HBV, em doentes submetidos a tratamento, correlaciona-se com uma resposta favorável ao tratamento. A quantificação do DNA do HBV tem valor prognóstico da progressão da hepatite aguda ou crónica por HBV, assim como é o marcador mais fiável da replicação viral. Útil na decisão terapêutica, com base nos valores da carga viral e outros marcadores (presença de antigénio HBe, níveis de ALT e grau de fibrose), de iniciar ou não os antivirais. Determinar o valor basal e monitorizar a resposta mantida à terapêutica.

2.4 Pesquisa e Tipagem do DNA do Vírus do Papiloma Humano (HPV)

A infeção persistente pelo HPV é a principal causa de cancro do colo do útero e da neoplasia cervical intraepitelial (CIN) e, em menor frequência, do cancro anal, particularmente nos imunodeprimidos. Os genótipos do HPV associados ao cancro cervical são designados por alto risco, enquanto os genótipos de baixo risco estão geralmente associados a lesões intraepiteliais de baixo grau (LIEBG) ou condilomas benignos. O teste destina-se a ser aplicado a diferentes produtos biológicos sem

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necessidade de extração, devido à sua elevada sensibilidade que permite a deteção de quantidades mínimas de DNA viral. No entanto, amostras de biopsias e cortes histológicos nos quais há suspeita clínica da presença do HPV são submetidas a extração prévia.

Valor semiológico: As aplicações clínicas do teste de tipagem do HPV incluem a

avaliação da aquisição e o desaparecimento de tipos específicos de HPV; monitorização da persistência de genótipos específicos de tipos associado a risco oncogénico; esclarecimento de citologias ambíguas (ASCUS); avaliação da eficácia excisional, radioterapia, quimioterapia para lesões associadas ao HPV (comprovação de cura) e fornece dados importantes na investigação epidemiológica sobre a história natural das infeções pelo HPV.

2.5 Pesquisa de vírus Herpes e Neurotrópicos

Identificação molecular qualitativa de vírus Herpes e Enterovirus responsáveis por infeções em diferentes órgãos, com particular relevância ao nível do sistema nervoso central. O dispositivo CLART® ENTHERPEX é capaz de identificar em amostras clinicas os 8 vírus Herpes humanos: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7 e HHV-8. São também detetados os três Enterovirus humanos clinicamente mais relevantes: Poliovirus, Echovirus e Coxsackievirus. Tem como vantagens uma elevada sensibilidade e especificidade, e a deteção simultânea de múltiplos vírus.

Valor semiológico: útil no diagnóstico da etiologia viral de doenças ou alterações do

sistema nervoso central, nomeadamente, encefalites, meningites e estados confusionais. Em lesões cutâneas e mucocutâneas sugestivas de uma possível etiologia viral, por uma primoinfeção ou reativação por vírus Herpes.

2.6 Pesquisa de Vírus Respiratórios

Caracterização de vírus que causam infeções respiratórias humanas, através da identificação genómica para diagnóstico in vitro. Os vírus pesquisados são: Vírus Influenza A (Subtipos H1N1sazonal, H1N1 2009 e H3N2), B e C; Vírus Parainfluenza 1, 2, 3 e 4 (subtipo A e B); Vírus Sincicial Respiratório tipo A e B; Rinovirus (deteta os subtipos 1 (A e B), 2-4, 6, 7, 9, 10, 11, 15, 16, 18, 19-25, 28-31, 33, 34, 36, 38-40, 43, 44-46, 47, 49, 50, 51, 53-60, 62, 63, 65, 67, 68, 71, 74-76, 80-82, 85, 88-90, 93, 95, 98, 99); Metapneumovirus (subtipos A e B); Enterovirus (Enterovirus 68-71; Coxackievirus A: 2-10, 12, 14; Coxackievirus B:1-6; Echovirus: 1-9, 11-21, 24-27, 29-33); Adenovírus; Coronavirus 229E e Bocavirus.

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Valor semiológico: útil no diagnóstico diferencial da etiologia das infeções

respiratórias nas crianças e nos adultos, nomeadamente, bronquiolites, pneumonias e síndrome de dificuldade respiratória. Fornece dados epidemiológicos nos surtos de gripe em meio hospitalar e na comunidade. Permite implementar medidas preventivas de transmissão em meio hospitalar.

2.7 Genotipagem do Vírus da Hepatite C

Este teste é utilizado para determinar o genótipo do vírus HCV em amostras com carga viral do HCV detetável. Permite determinar os genótipos do HCV 1-6 e quinze subtipos incluindo o 1a e 1b. Este ensaio não se destina a ser utilizado como um teste de rastreio para o HCV, nem como teste para confirmar a presença do HCV.

Valor semiológico: Clinicamente é pedido antes do início da terapêutica da infeção

crónica pelo HCV e utiliza-se como marcador de prognóstico de resposta e do tempo de duração da mesma, uma vez que os diferentes genótipos apresentam respostas diferentes às terapêuticas antivirais disponíveis.

D – Controlo de Qualidade

A seleção e organização dos programas de Controlo de Qualidade Interno (CQI) e avaliação externa da qualidade (AEQ) são efetuadas pelos responsáveis das secções. A seleção dos programas de controlo de qualidade é feita segundo critérios como: experiência anterior do laboratório, experiência de outros laboratórios, disponibilidade dos programas ou a referência em revistas técnico-científicas, e depende de fatores que incluem:

- Tipo de ensaio (qualitativo, quantitativo ou semi-quantitativo); - Grau de automatização do método;

- Frequência de utilização (rotineiro ou esporádico); - Recomendações do fornecedor;

- Disponibilidade de materiais de controlo interno ou de programas de AEQ; - Características do método.

Os programas de CQI e de AEQ aplicados a cada um dos testes são descritos em cada uma das Instruções de Trabalho Analítico (ITA), no ponto Controlo de Qualidade no qual se define a periodicidade de cada tipo de controlo, quais os níveis de controlo, quais os critérios de aceitação, análise e validação, registo e medidas a tomar quando os resultados de controlo são não conformes. Quando não há programas de controlo

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adequados são estabelecidos mecanismos para decidir da aceitabilidade de procedimentos não avaliados doutro modo. Quando não for efetuado controlo de qualidade aos resultados de um exame laboratorial, na respetiva ITA tal é também mencionado e justificado.

As amostras controlo são analisadas como amostras biológicas e não têm qualquer tratamento especial, para que os seus resultados possam ser avaliados como controlo do processo analítico. Sempre que possível, são utilizadas amostras controlo com uma matriz idêntica à da amostra biológica e são selecionadas em número e concentração que permita monitorizar os níveis de decisão médica e o intervalo de linearidade do método, no que se refere ao CQI.

Controlo de qualidade interno

O CQI é efetuado com base nos resultados das amostras controlo e construção das cartas de controlo. Cada secção definiu limites de controlo ou regras de controlo e os critérios de aceitação, com base nas características de desempenho do método. A analise do CQI permite efetuar uma avaliação periódica da imprecisão através do cálculo do coeficiente de variação CV% pela fórmula:

Os resultados acumulados do CV% de períodos definidos de acordo com o nº de amostras controlo ensaiadas, são colocados em gráfico e utilizados como indicadores de imprecisão e avaliados com metas retiradas de referências ou definidos pelos responsáveis da qualidade e de sector.

Controlo de qualidade externo

A participação em AEQ é um requisito essencial para controlar e evidenciar a qualidade dos resultados. O LIBM participa regularmente, em programas de Avaliação Externa da Qualidade, organizados por entidades idóneas, para os parâmetros disponíveis, sendo uma ferramenta considerada essencial como garantia da exatidão e validade dos métodos aplicados pelo laboratório. O desempenho de um ensaio pode ser analisado pelos índices fornecidos pelos relatórios da AEQ de acordo com os

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critérios definidos pela entidade promotora. O relatório cumulativo do laboratório poderá ser um meio útil de evidenciar o seu desempenho ao longo do tempo.

Os relatórios da AEQ devem ser devidamente analisados de forma a detetar situações não conformes ou tendências de resultados, sendo a análise comprovada pela assinatura do responsável da secção.

Para cada programa é avaliado o desempenho do laboratório pelo score obtido em cada distribuição e calculada a inexatidão (Bias %) através da AEQ em cada distribuição:

O desempenho do LIBM em relação aos objetivos definidos pelo promotor do AEQ nos vários parâmetros é avaliado como indicador de Inexatidão, sendo definida uma meta anual de % de adequação, como objetivo a atingir pelo LIBM.

Erro total e avaliação de desempenho

Para os ensaios qualitativos que dispõem de dados de CQI e AEQ, são efetuados estudos de forma a avaliar o desempenho em confronto com especificações da qualidade analítica, nacionais ou internacionais, ou baseadas no estado da arte para parâmetros para os quais não existam dados publicados. A especificação da qualidade Erro Total admissível (ETa) de um ensaio define a variação máxima aceitável, num determinado resultado laboratorial, gerada a partir dos efeitos combinados dos erros aleatórios (imprecisão/CV%) e sistemáticos (inexatidão/Bias). A análise da estimativa do erro com base no CQI (imprecisão-CV%) e na AEQ (inexatidão/Bias) permite determinar o desempenho real do processo e avaliar a sua estabilidade ao longo do tempo. O ET associado a um método de ensaio é determinado de acordo com a equação:

Bias%- medida da inexatidão do método (calculado a partir da AEQ, valor médio do período em analise, se possível n≥5).

CV% – estimativa da imprecisão do método (calculado a partir do CQI, valor médio do período em analise).

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z-factor multiplicativo da imprecisão que depende do nível de confiança desejado para o ET (1.96, 95%).

O laboratório considera o desempenho do método conforme, quando o ET≤ ETa. Os valores de ETa são estabelecidos com base em recomendações nacionais ou internacionais. Quando não disponíveis, estes são estabelecidos pelo responsável da qualidade e da secção, com base no seu julgamento profissional ou desempenho do método em AEQ. Os resultados obtidos também possibilitam a construção de gráficos de avaliação de método que permite classificar o desempenho do método analítico, anualmente, frente às características de inexatidão e imprecisão obtidas e a especificação da qualidade a ser atendida e classificá-lo em excelente, bom, conforme ou não conforme.

Tabela 7 – Plano de controlo de qualidade do LIBM

Teste Equipamento CQI Critério AEQ

Doseamento de IgE total e específica

ImmunoCAP250 Controlo UniCAP IgE Regras de westgard Quality Club Phadia

Imunofenotipagem linfocitária

FACSCanto Sangue total

estabilizado (immune-trol/low cells)

Regras de westgard UK NEQAS Immune Monitoring Scheme

CV HIV-1 COBAS Ampliprep

COBAS TaqMan

Controlo positivo baixo - ACC

Objectivos/InterQC UK NEQAS for Microbiology – HIV-1 RNA Quantification CV HCV COBAS Ampliprep COBAS TaqMan Controlo positivo baixo - ACC

Objectivos/InterQC UK NEQAS for Microbiology – HCV RNA Detection CVHBV COBAS Ampliprep COBAS TaqMan Controlo positivo baixo - ACC Regras de westgard/InterQC UK NEQAS for Microbiology – HBV DNA Quantification Genotipagem HCV Biometra T professional Thermocycler Autoblot 3000

Não efetuado UK NEQAS for

Microbiology- HCV RNA Detection Tipagem do HPV Biometra T professional Thermocycler Leitor CAR Controlo negativo Controlo positivo (amostra testada anteriormente) Não detetável HPV positivo (tipo testado anteriormente) UK NEQAS for Microbiology- assessment for Molecular Detection of Papillomaviruses Diagnóstico Molecular de vírus respiratórios Biometra T professional Thermocycler Leitor CAR Controlo negativo Controlo positivo (amostra testada anteriormente) Ausência de amplificado Positivo (vírus detetádo anteriormente) Programa de controlo de qualidade INSA

Imagem

Fig. 1 – ImmunoCAP250  (www.thermofisher.com)
Tabela 1 – Parâmetros instalados no equipamento ImmunoCAP250
Tabela 2 – Parâmetros efetuados no Citómetro de Fluxo BD FACSCanto II
Tabela 3 – Parâmetros efetuados na subsecção de cultura celular
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Referências

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