Validação analítica do hemograma

Na validação analítica do hemograma é importante observar os resultados numéricos, os histogramas (nº de eventos) e os citogramas (distribuição do nº de eventos nas diferentes áreas), para esclarecer as possíveis causas dos alertas gerados pelo equipamento e aferir a necessidade de avaliar a morfologia do sangue periférico. Para interpretar as informações dadas pelo equipamento é necessário compreender as especificações das reações citoquímicas, nos diferentes canais de reação, e os parâmetros determinados e calculados em cada um.

Canal basófilos

As reações citoquímicas neste canal compreendem, numa primeira fase, a lise dos eritrócitos e das plaquetas, e numa segunda fase a lise do citoplasma de todos os leucócitos com exceção dos basófilos. Podemos observar no citograma a distribuição dos basófilos e dos núcleos dos restantes leucócitos, numa combinação do seu tamanho e complexidade, e classificar os leucócitos como mononucleares (MN) ou polimorfonucleares (PMN) baseado no tamanho, forma e complexidade dos núcleos (fig.2). Os basófilos intactos podem distinguir-se facilmente dos núcleos pequenos. (4)

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Fig. 26 Citograma gerado no canal de basófilos.

Os eritroblastos podem aparecer misturados na população de PMN, mas como vão ser identificados no método da peroxidase, o equipamento gera um alarme e corrige a contagem dos leucócitos totais (WBC).

Fig. 27 Histograma gerado no canal de basófilos.

A partir deste histograma o equipamento calcula o índice de lobularidade que nos dá uma indicação da normalidade da amostra. É calculado pelo valor do pico das PMN no eixo do x (2) a dividir por 14, valores inferiores a 1.9 são normalmente indicativos de situações anómalas.

Canal peroxidase

A reação citoquímica neste canal ocorre em 3 passos sequenciais: os eritrócitos são lisados (dodecil sulfato de sódio e Brij-35 e temperatura 58°C -72.1°C), os leucócitos são fixados (formaldeído) e posteriormente corados (4-cloro-1-naftol é o substrato e juntamente com o peroxido de hidrogénio formam um precipitado escuro pela ação da peroxidase existente nas granulações dos leucócitos).

Os leucócitos são identificados com base no seu tamanho e intensidade da reação de coloração. Os neutrófilos, eosinófilos e monócitos são corados de acordo com a atividade da peroxidase no citoplasma. Os linfócitos e basófilos não coram porque não tem atividade da peroxidase.

1 restos celulares 2 núcleos de blastos

3 leucócitos mononucleares MN (núcleos de linfócitos e monócitos)

4 basófilos

5 basófilos suspeitos 6 saturação (artefactos)

7 leucócitos polimorfonucleares PMN (núcleos de neutrófilos e eosinófilos)

1 mononucleares 2 polimorfonucleares

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Fig. 28 Histograma gerado no canal da peroxidase.

Os eritroblastos (2) são de pequenas dimensões e não têm peroxidase, a sua contagem neste canal, juntamente com o obtido no canal baso, é subtraída ao total de leucócitos. Os agregados plaquetários (3) não entram nas contagens celulares, mas geram um alerta pelo sistema informático. Os linfócitos e basófilos aparecem na mesma região (4) porque têm o mesmo tamanho e não têm peroxidase. As células de grandes dimensões não coradas (5), classificadas como LUC (large unstained cells), correspondem a linfócitos atípicos, blastos ou outras células anormais, e geram um alerta quando o seu número é elevado. Os monócitos, neutrófilos e eosinófilos ficam em regiões separadas devido ao diferente tamanho e conteúdo em peroxidase. Os eosinófilos têm dimensão semelhante aos neutrófilos, mas com maior conteúdo em peroxidase, no entanto aparecem no citograma separados dos neutrófilos pelo tamanho, como se fossem mais pequenos, porque coram tão intensamente que absorvem a luz que deveria ser refletida. Neste canal são gerados alertas referentes aos valores absolutos dos leucócitos totais ou das diferentes linhagens, inferiores ou superiores ao valor de referência; presença de eritroblastos (> 1%); presença de agregados plaquetários; bastonetes (≥10%), linfócitos atípicos (>10%); presença de blastos (>1%) e presença de granulócitos imaturos (>1).

Canal hemoglobina

A reação citoquímica inicia-se com a lise dos eritrócitos com a consequente libertação da hemoglobina, o ferro do grupo heme da hemoglobina é oxidado (ião ferroso para ião férrico) e conjugando-se com um ião hidróxido e uma molécula de água formam o monoaquomonohudroxiferri-porfirina como produto final, que é lido no fotocolorímetro a 546nm. O cálculo da hemoglobina pode ser efetuado usando os índices HCM e o MCHC, ambos representam a concentração globular média da hemoglobina na amostra. O HCM é um parâmetro medido diretamente pela análise célula a célula, enquanto o MCHC é um parâmetro calculado com base na concentração de hemoglobina, volume globular médio e número de eritrócitos. Se estes dois índices

1 restos celulares, plaquetas 2 eritroblastos

3 agregados plaquetários 4 linfócitos e basófilos 5 grandes células não coradas 6 monócitos

7 neutrófilos 8 eosinófilos

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diferirem mais de 1,9 g/dL, o aparelho emite um alerta. Uma das possíveis causas para essa diferença pode ser a lipémia que interfere com o doseamento da hemoglobina, levando a resultados falsamente elevados nos métodos colorimétricos.

Canal eritrócitos/plaquetas

A reação citoquímica ocorre em dois passos distintos: primeiro os eritrócitos e as plaquetas vão adquirir a forma isovolumetricamente esférica pela ação dos reagentes dodecil sulfato de sódio (SDS) e glutaraldeido, eliminando a forma como fator de variação, e posteriormente são fixados.

O método de contagem dos eritrócitos e das plaquetas baseia-se na teoria de Mie sobre a dispersão da luz em esferas homogéneas. Células esféricas ao passarem individualmente num fluxo contínuo são atravessadas por dois feixes de luz com ângulos diferentes. Nos eritrócitos, a dispersão da luz correspondente ao ângulo menor (2º-3º) correlaciona-se com o volume da célula e a dispersão da luz do ângulo maior (5º a 15º) correlaciona-se com o conteúdo em hemoglobina. Os mesmos ângulos são usados para analisar as plaquetas, mas os sinais são ampliados (30 x no ângulo menor e 12 x no ângulo maior).

Fig. 29 Histograma do volume da célula.

A partir deste histograma é calculado o volume globular médio (MCV) e o coeficiente de variação da distribuição do volume eritrocitário (RDW). O MCV permite classificar a população de eritrócitos numa amostra como microcítica, normocítica ou macrocítica (fig.5), pela percentagem de células em cada região. O RDW dá informação sobre o grau de anisocitose e o equipamento emite um alerta quando a percentagem excede os 16%.

Fig. 30 Histograma da concentração em hemoglobina.

1 região microcítica 2 região normocítica 3 região macrocítica 4 linha 60fL 5 linha 120fL 1 região hipocrómica 2 região normocrómica 3 região hipercrómica 4 linha 28g/dL 5 linha 41g/dL

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A partir deste histograma obtém-se o valor da concentração de hemoglobina média e a classificação da amostra como hipocrómica, normocrómica ou “hipercrómica” (fig.6). Valores de hemoglobina média superiores a 3,4 g/dL emitem um sinal de alerta.

Fig.31 Citograma volume da célula/hemoglobina.

As linhas no citograma separam morfologicamente os eritrócitos em 9 áreas distintas. O eixo do x corresponde à concentração de hemoglobina e o eixo do y corresponde ao volume dos eritrócitos. É possível avaliar simultaneamente a cor e o tamanho dos eritrócitos na amostra (fig.7).

Fig.32 Citograma do volume de plaquetas/ índice de refração.

Este citograma permite distinguir 5 áreas, morfologicamente diferentes, com base no volume e índice de refração (fig.8). O índice de refração depende do conteúdo interno das plaquetas (granulação). É calculado o coeficiente de variação da distribuição do volume plaquetário (PDW).

Canal de reticulócitos

A reação citoquímica neste canal inicia-se pela esferificação isovolumétrica dos eritrócitos e plaquetas (detergente zwitterionic) e posteriormente os reticulócitos são caracterizados (fig.9) pela marcação do seu conteúdo em RNA (corante Oxazina 750).

Fig. 33 histograma da concentração em hemoglobina. 1 linha 60fL 2 linha 120fL 3 linha 28g/dL 4 linha 41g/dL 1 plaquetas 2 plaquetas gigantes 3 eritrócitos 4 fragmentos de eritrócitos 5 sombras de eritrócitos Eritrócitos (vermelho) Reticulócitos (azul)

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Fig.34 Citograma da maturação/tamanho da célula.

As células passam individualmente num fluxo contínuo e são atravessadas pela luz, em dois ângulos diferentes. A dispersão da luz do ângulo menor e do ângulo maior são proporcionais ao tamanho e concentração em hemoglobina, respetivamente. A absorção da luz é proporcional ao conteúdo de RNA da célula. Os reticulócitos absorvem mais luz do que os eritrócitos maduros.