1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR DISCIPLINA TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR
MÓDULO DIDÁTICO DE APOIO (MDA 3)
2 1. INTRODUÇÃO
Todas as células têm uma membrana plasmática, uma bicamada lipídica que funciona com uma barreira natural, separando o conteúdo intracelular de ambiente extracelular. Essa membrana é constituída predominantemente por lipídios e proteínas. Associados a esses componentes majoritários, estão os carboidratos, quase sempre em quantidades muito menores e constituindo as glicoproteínas e os glicolipídeos (figura 1).
Figura 1 – Membrana plasmática
Em células animais, a membrana plasmática é a única barreira que separa o conteúdo da célula a partir do ambiente, mas em plantas, bactérias e leveduras membrana plasmática é cercado por uma parede celular rígida. A ausência de parede extracelular em células animais torna relativamente fácil para lisar.
2. Parede celular
A parede celular dos organismos vivos é uma estrutura dinâmica ajustável durante o ciclo celular e em resposta às condições ambientais como nutrientes, disponibilidade de O2, temperatura e pH. A parede celular tem muitas funções, como: proteção física, estabilidade osmótica, suporte de enzimas, adesão célula/célula e barreira de permeabilidade seletiva. Além disso, promove rigidez e transporte de nutrientes para o citoplasma, proporcionando a integridade, o metabolismo e o crescimento celular. Constitui cerca de 15 a 25% da massa seca da célula e não é uma estrutura estática e sim, uma estrutura em constante crescimento e mudança. Os componentes da
3 parede celular são sintetizados e unidos entre si; estruturas especializadas, como os septos são formados em sincronia com o crescimento e divisão celular. Perturbações na parede celular de podem ativar mecanismos de reparo que reorganizam toda a estrutura molecular, para preservar a integridade da célula.
2.1. Parede celular bacteriana
A parede celular bacteriana é uma “superestrutura” complexa composta principalmente por uma rede macromolecular de peptidoglicanos. O peptidoglicano, também denominado de mureína ou mucopeptídeo, é um polímero linear constituído por heteropolissacarídeos e peptídeos (Figura 2).
Figura 2 – Parede celular bacteriana.
A porção polissacarídica (Figura 3) do peptídeoglicano é formada por resíduos alternados de acetilglucosamina (NAG ou GlcNAc) e ácido N-acetilmurâmico (NAM ou Mur2Ac), unidos por ligações glicosídicas β-(1,4). Associado covalentemente ao NAM está um peptídeo (que pode conter de 4 a 5 resíduos de aminoácidos). Em bactérias gram-positivas (como Staphylococcus aureus) esse peptídeo é constituído pelos aminoácidos L-alanina, D-glutamina, L-lisina e D-alanina. Esse peptídeo estabelece uma
4 ligação cruzada com outra cadeia peptídica através de uma ponte pentaglicina (constituída por 5 resíduos de glicina), formando uma malha tridimensional. O estabelecimento destas pontes cruzadas é feito com auxílio de uma transpeptidase. Já em bactérias gram-negativas (como a E. coli), o peptídeo é constituído pelos aminoácidos L-alanina, ácido D-glutâmico, ácido diaminopimélico e D-alanina. Diferentemente das bactérias gram-positivas, as bactérias gram-negativas não têm a pentagliclina, ao invés disto, o resíduo terminal D-alanina é diretamente ligado ao tetrapeptídeo vizinho através do aminoácido derivado da lisina, o ácido diaminopimélico.
Figura 3 – Estrutura dos peptidoglicanos das paredes celulares de bactérias gram-positivas e gram-negativas. NAM: Ácido N-acetilmurâmico (em amarelo); NAG: N-aceltiglucosamina (em amarelo); peptídeos (cículos azuis); pontes de pentaglicina (cilindros lilás)
A principal função do peptidoglicano é conferir rigidez à parede celular de bactérias, determinando a forma bacteriana e as protegendo da lise osmótica, quando em meio hipotônico. O peptidoglicano também está
5 envolvido na fissão binária durante a reprodução da célula bacteriana e atuam como um filtro regulando o trânsito molecular.
A camada de peptidoglicano é substancialmente mais espessa nas bactérias gram-positivas (de 20 a 80 nm) do que nas bactérias gram-negativas, correspondendo a até 90% do peso seco (Figura 4).
Figura 4 – Estrutura da parede celular de bactérias gram-positivas.
Ligados a uma densa camada de peptidoglicanos, as bactérias-Gram positivas possuem ácidos tecóicos que são polímeros de ribitol ou glicerol unidos por ligações fosfodiésteres (Figura 5). Existem duas classes de ácidos teicóicos: a) ácido tecóico que está associado somente ao peptidoglicano; b) ácido lipotecóico que é associado ao peptidoglicano e ligado à membrana plasmática. Os ácidos teicóicos conferem carga negativa à superfície exterior da célula podendo ajudar no transporte de íons positivos para dentro e fora da célula. Essas substâncias em conjunto com proteínas presentes na superfície da parede celular são responsáveis pela determinação antigênica das bactérias gram-positivas por diferirem entre distintas espécies e linhagens, servindo para a classificação sorológica e identificação dessas bactérias. Fragmentos de peptidoglicano e ácido lipoteicóico liberados durante infecções por bactérias gram-positivas são responsáveis por manifestações clínicas tais como
6 inflamação, febre, leucocitose, hipotensão, depressão, perda de apetite, insônia e artrite, reações estas causados por mediadores liberados pelas células do hospedeiro em resposta à exposição às células bacterianas e seus componentes.
Figura 5 – Estrutura dos ácidos tecóicos
Já as bactérias gram-negativas apresentam uma camada de peptidoglicano é bem menos espessa (de 7 a 8 nm) correspondendo à apenas 10% do peso seco e situa-se no espaço periplasmático, localizado entre a membrana citoplasmática e a membrana externa (Figura 6).
Figura 6 – Estrutura da parede celular de bactérias gram-negativas.
Entre suas funções, a membrana externa representa uma barreira molecular, prevenindo ou dificultando a perda de proteínas periplasmáticas e o acesso de enzimas hidrolíticas e certos antibióticos ao peptidoglicano; possui receptores para bacteriófagos e bacteriocinas, e participa da nutrição
7 bacteriana. Essa membrana externa é composta por uma bicamada fosfolipídica, lipoproteínas e porinas. As lipoproteínas estão ligadas de modo covalente ao peptidoglicano e não covalente à membrana externa e a principal função dessas proteínas é estabilizar a membrana externa e ancorá-la à camada de peptídeoglicano. Ancorados na porção mais externa dessa membrana, também estão os lipolissacarídeos (LPS). O LPS é uma endotoxina que consiste em três seções estruturais:
1) Lipídeo A – é um glicofosfolipídeo componente básico do LPS e é essencial para a viabilidade bacteriana. O lipídio A é responsável pela atividade de endotoxina do LPS. Ele possui um esqueleto dissacarídeo glicosamina fosforilado contendo ácidos graxos ligados para ancorar a estrutura na membrana externa. O lipídeo A também participa dos mecanismos de patogenicidade bacteriana.
2) Núcleo polissacarídico (core ou região do cerne) – consiste na região nuclear que também é essencial para a estrutura do LPS e para a viabilidade bacteriana. Essa região é fosforilada e constituída basicamente por hexoses, heptoses e por um açúcar incomum, o ácido 2-ceto-3-desoxi-octanoato (KDO)
3) Antígeno-O – está ligado ao núcleo polissacarídeo e se entende para fora da bactéria. É um polissacarídeo longo e linear constituído por 50 a 100 unidades repetidas de manose, abequose, raminose e galactose. (Figura 7).
8 Figura 7 – Estrutura dos lipopolisacarídeos (LPS) presentes na membrana externa de bactérias gram-negativas.
É importante ressaltar que algumas drogas antibacterianas como a penicilina interferem na produção de peptidoglicanos pela ligação às enzimas bacterianas transpeptidases. As proteínas de ligação a penicilina formam as ligações entre oligopeptídeos em ligações cruzadas nos peptidoglicanos. Para uma célula bacteriana reproduzir-se através de fissão binária (divisão celular), mais de um milhão de subunidades de peptidoglicanos precisam ser fixados nas subunidades existentes. Mutações nas transpeptidades que levam a reduzidas interações com o antibiótico, resultando na resistência da bactéria a ação do mesmo.
Estudos recentes têm demonstrado que a disposição estrutural da parede celular bacteriana pode ser muito mais complexa e diversificada do que se imagina. Gan et al. (2008) sugerem três modelos tridimensionais de disposição dos peptidoglicanos nas paredes celulares bacterianas:
a) O primeiro é conhecido como modelo em camadas (Figura 7A)e seria o mais comum, com a camada de dissacarídeos repetidos sendo paralela ao eixo principal da célula.
9 b) O outro modelo é conhecido como “Scaffold” (andaime)(Figura 7B). Nesse caso, a camada heteropolissacarídica seria perpendicular ao eixo principal da célula.
c) Modelo em camadas desordenadas (Figura 7C)
Figura 7- Modelos tridimensionais de disposição dos peptidoglicanos nas paredes celulares bacterianas. A) Camadas; B) Scaffold e C) Camadas desordenadas. As estruturas em verde representam os heteropolissacarídeos e as azuis representam os peptídeos.
2.1.1. Hidrolases mureínas
As hidrolases mureinas bacterianas são diversas (Figura 8), refletindo as diferentes ligações encontradas nos peptidoglicanos. Eles são uma família única de enzimas que clivam especificamente os componentes estruturais dos peptidoglicanos e participam em vários processos biológicos importantes durante o crescimento e divisão celular, incluindo a separação de células filhas, o desenvolvimento da parede celular e na reciclagem e o turnover dos peptidoglicanos.
10 Figura 8 – Hidrolases mureínas
Além disso, estas enzimas contribuem para a patogenicidade das bactérias e são necessárias para a susceptibilidade aos antibióticos. As análises bioquímicas das hidrolases mureínas mostraram que as suas atividades hidrolíticas são específicas para vários componentes estruturais do peptidoglicano. Como exemplo dessas enzimas (Figura 9), podemos citar: N-acetilmuramidase; N-acetilglucosaminidase; N-acetilmuramil-L-alanina amidase; e a endotransglicosidase. Esssas enzima desempenham papéis específicos na biossíntese e processamento da parede celular bacteriana. As hidrolases mureína que conduzem à destruição da parede celular e subsequente lise celular são conhecidas como autolisinas
11 Figura 9 - Sítios de ação das hidrolases mureínas no peptideoglicando de metas dentro de E. coli. Diferentes hidrolases mureínas que clivam as várias ligações dentro do peptidoglicano foram identificadas e incluem β-N-acetilglucosaminidase (vermelho), transglicosilase lítica (azul), N-acetilmuramil-L-alanina-amidase (verde), D, carboxipeptidase (amarelo) e L, D-carboxipeptidase (rosa).
3. Parede celular de leveduras
Já a parede celular de leveduras é formada por uma camada de mananaproteínas que sobrepõe à camada de glucana (Figura 10), o que explicaria a resistência das leveduras á ação das misturas enzimáticas. Normalmente, a parede celular das leveduras (exemplo, a Saccharomyces cerevisiae) é formada por três componentes principais:
a) Glucanas – são polímeros constituídos de β-1,3 e β-1,6 glicose (podem corresponder até 50% da parede celular),
b) Mananaproteínas - compostas por polímero de manose com ligações -1,2, -1,3 e -1,6, que estão covalentemente ligados a peptídeos formando glicopeptídeos. Correspondem a até 40% da parede celular c) Quitina - um polímero de β-1,4 N-acetilglucosamina que corresponde a
12 Figura 10 – Estrutura da parede celular das leveduras composta por: Mananaproteínas; -1,3 glucanas; -1,6 glucanas e quitina.
As mananaproteínas estão localizadas na parte externa da parede e têm função de proteger a célula contra fatores externos e é responsável pela porosidade da parede celular, enquanto que a camada de glucana é responsável pela estrutura da parede celular perante choques mecânicos e desequilíbrios osmóticos. A porção manana das mananaproteínas é bastante ramificada, contendo um ponto de ramificação a cada três unidades de manose, assim, esses polissacarídeos contêm ligação do tipo 1,2, 1,3 e -1,6.
A parede celular de leveduras contém mais de 20 tipos de mananaproteínas que desempenham papéis diferentes na construção, preservação, modificação da estrutura e interação das células com suas adjacências como, por ex., as interações intercelulares durante a aglutinação ou floculação. As mananaproteínas podem ser divididas em três grupos: 1) proteínas unidas por pontes dissulfeto ou ligações não covalentes com polissacarídeos estruturais da parede (a maioria dessas proteínas apresentam atividades enzimáticas e podem ser extraídas por meio de aquecimento com SDS e mercaptoetanol ou pelo ditiotreitol); 2) proteínas ligadas covalentemente principalmente às -glucanas e que podem somente ser extraídas pela lise da parede celular com diferentes preparações de glucanases, como zymolyase ou laminarinase (a função fisiológica dessas proteínas não é conhecida), e, 3)
13 proteínas, provavelmente, ligadas de forma covalente à parede celular e que podem ser extraídas com NaOH.
A principal glucana presente na parede celular das leveduras é a -1,3 glucana (álcali e ácido insolúvel) (Figura 11). Associada a essa glucana existe uma pequena quantidade de quitina. A -1,6 glucana (ácido solúvel) também está presente, mas em pequena proporção.
Figura 11 – Glucanas: -1,3 glucana e -1,6 glucana
As -1,3 glucanas têm tamanho estimado de 1500 resíduos de glicose, enquanto que as -1,6 glucanas são menores, apresentando de 150 a 200 resíduos. Muitos estudos têm mostrado que estes componentes, depois de serem depositados na parede, são rearranjados para formarem um complexo integrado. Os rearranjos podem ocorrer pela ação das enzimas glicosiltransferases, as quais introduzem ramificações nos polissacarídeos lineares. Há evidências de ligações entre mananaproteínas e quitina.
4. Lise Celular
A lise celular, também denominado rompimento celular, é o processo (natural ou induzido) de ruptura da parede celular e membrana plasmática, com a consequente liberação do conteúdo intracelular (organelas, macromoléculas, etc.). A indução desse processo geralmente é destinada a obtenção de extratos celulares ou simplesmente, denominado lisado celular. Constitui a primeira etapa na separação de moléculas intracelulares (DNA, RNA, proteínas, etc.) e é, portanto, crucial no processo Downstream, pois qualquer dano causado a
14 molécula-alvo nessa fase, compromete e invalida todas as etapas subsequentes. Além disso, vale ressaltar que uma lise eficiente resulta num maior rendimento e numa maior flexibilidade nos tratamentos posteriores, dados ao produto (Saboya et al., 2003).
A lise celular é relativamente fácil de realizar em células animais, em comparação a leveduras, bactérias, esporos e células vegetais, que possuem paredes celulares rígidas. No entanto, o método lise deve ser apropriado para não haver degradação das moléculas analisadas. A forma de realizar o rompimento celular depende do tipo celular e ocorre após a etapa de separação e clareamento (lavagem) das células obtidas. Os critérios para a seleção da técnica empregada devem considerar vários fatores como: tipo célula (tamanho e composição); tolerância molecular (as tensões; variações de temperatura e pH; reagentes, etc); necessidade de controle de parâmetros ( (temperatura, tempo de operação, rendimento do processo, método de purificação da molécula-alvo, custo e capital de investimento (Marinello, 2011).
Células envolvidas somente por membranas celulares são frágeis e facilmente rompidas sob baixas tensões de cisalhamento ou por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultrassom de baixa intensidade e requerem pouca energia para sua realização. Por outro lado, células que apresentam a estrutura das paredes celulares mais complexas são de difícil rompimento. Como exemplo, temos as células de origem vegetal, que geralmente são mais difíceis de serem rompidas do que as células animais, pois suas paredes celulares são compostas por celulose.
Após o rompimento celular obtém-se homogeneizado celular constituído por molécula–alvo, biomoléculas contaminantes e fragmentos celulares. Os compostos indesejáveis devem ser removidos por processos de filtração, centrifugação, precipitação ou extração líquido-líquido.
Os principais métodos de rompimento celular são divididos em enzimático, químicos e físicos (Quadro 1).
15 QUADRO COMPARATIVO ENTRE OS PRINCIPAIS MÉTODS DE LISE
CELULAR (QUÍMICOS , ENZIMÁTICOS B E FÍSICOS )
Método Cond. Típica Fonte de extração Comentários
4.1. MÉTODOS FÍSICOS DE LISE CELULAR
Os métodos físicos são frequentemente favoráveis devido às limitações econômicas e operacionais das outras duas classes de métodos. Eles são subdivididos em método mecânicos e não mecânicos. Uma característica dos métodos mecânicos é a necessidade de utilizar equipamentos específicos para promover o rompimento celular, como exemplos: o homogeneizador de alta pressão, moinho de bolas, prensa francesa e ultrassom. Já os métodos não mecânicos, como o congelamento e descongelamento (choque térmico) das células, não necessitam de equipamentos complexos.
16 Os métodos físicos apresentam como vantagens os seguintes aspectos: i) Geralmente não requerem a adição de agentes químicos que muitas vezes podem promover efeitos indesejáveis à amostra,
ii) Podem ser aplicados para diferentes organismos;
iii) São adequados ao escalonamento do processo, pois geralmente são mais econômicos que os métodos enzimáticos e químicos;
iv) Alguns desses métodos utilizam equipamentos de fácil manipulação;
v) Alguns desses métodos podem ser utilizados em conjunto com métodos enzimáticos ou químicos, como é o caso do ultrassom;
Por outro lado, os métodos físicos apresentam as seguintes desvantagens:
i) Podem geram calor e devem ser usados com cuidado para não promover a desnaturação de proteínas e ácidos nucleicos;
ii) Podem formar espuma que interfere no processo de separação das moléculas;
iii) A maioria desses métodos utiliza algum tipo de equipamento, que por sua vez consome energia, aumentando o custo do processo;
iv) Os equipamentos utilizados nesses métodos precisam ser regulamente vistoriados e validados, para evitar contaminações e perdas na eficiência do processo.
4.1.1. MÉTODOS FÍSICOS MECÂNICOS DE LISE CELULAR:
a) Lise em homogeneizador de alta pressão
É o método mais utilizado para o rompimento celular em larga escala. Esse tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio. O calor gerado no processo pode aumentar a temperatura da suspensão em 1,5 °C para cada 1000psi na pressão de operação.
O homogeneizador de alta pressão é constituído por pistões projetados para aplicar altas pressões, forçando a passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguido de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada (Figura 11). A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. O
17 rompimento das células ocorre de acordo com fatores que atuam simultaneamente sobre as células, como cavitação, turbulência e cisalhamento.
Figura 11 – Homogeneizador a alta pressão (Modelo Nano DeBEE)
Os seguintes fatores afetam o desempenho de um homogeneizador: pressão de operação, velocidade de alimentação, temperatura, estado fisiológico do microrganismo, condições de cultivo, tipo de célula e sua concentração. A quantidade de células rompidas é proporcional à pressão na alimentação.
O homogeneizador a alta pressão possibilita a recirculação do material, o que melhora a eficiência do rompimento. Esse procedimento apresenta as seguintes desvantagens: elevação do custo do processo, possibilidade e degradação a molécula-alvo e geração de fragmentos celulares muito pequenos.
A prensa francesa é outro tipo de homogeneizador que utiliza alta pressão para lisar células. Neste equipamento, as células também são forçadas a passarem, sob alta pressão, através de um pequeno orifício, sofrendo em seguida, uma forte descompressão, suficiente para romper a parede celular (Figura 12).
18 Figura 12 – Prensa francesa (French press)
b) Lise em homogeneizador com partículas de moagem (Moinho de bolas ou esferas)
É utilizado para romper células microbianas, fungos filamentosos e microalgas. Esse equipamento é constituído por uma câmara cilíndrica fechada, horizontal ou vertical, um sistema de refrigeração e um eixo que gira em alta rotação (Figura 13). Nessa câmara são adicionados tubos ou microtubos contendo esferas (de vidro ou aço inox) e células em suspensão. Ao longo do eixo de rotação estão distribuídos um ou mais discos ou hastes que giram em alta velocidade e provocam atrito entre as esferas e as células intactas e causam rompimento celular. O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células. As condições de rompimento nesse equipamento são facilmente
19 controláveis e a eficiência do processo depende da geometria da câmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga de esferas e da concentração celular, da velocidade de alimentação e da temperatura.
Figura 13 – Moinho de esferas (modelo Bead Ruptor 24)
As câmaras horizontais são mais eficientes porque comportam maiores cargas de esferas e abrigam mais esferas de diâmetros reduzidos. Nas câmaras verticais a vazão de fluido é na direção ascendente e ocorre a fluidização das esferas. As esferas devem ocupar entre 80 e 85% do volume da câmara horizontal e entre 50 e 60% se a câmara for vertical. A velocidade do agitador influencia o número de contatos entre as células e as esferas e quanto maior a velocidade e rotação, mais rápida é a lise celular. O tipo de agitador também influencia a eficiência de rompimento. Os agitadores podem estar dispostos no eixo central ou fora ele, perpendicular ou obliquo. Para auxiliar na agitação eles podem conter sulcos, pequenos cortes ou furos.
O material mais utilizado nas esferas é o vidro, mas também são usados materiais como o aço, o inox e a cerâmica. Quanto menor o diâmetro da esfera, mais eficiente é o rompimento.
A fração de células rompidas diminui com o aumento do fluxo de alimentação do moinho, pois diminui o tempo de residência no rompedor. O
20 fluxo ótimo de alimentação depende da velocidade do agitador, da carga de esferas, da geometria do equipamento e das propriedades do microrganismo.
As temperaturas de operação em processos de rompimento celular devem ser controladas para prevenir a destruição da biomolécula-alvo. Neste processo é liberada grande quantidade de calor.
Na ampliação de escala do rompimento com moinho de bolas devem se manter constantes os seguintes parâmetros: tamanho das esferas, proporção em volume entre a suspensão celular e as esferas de vidro e velocidade de rotação do eixo ou velocidade periférica das pás do agitador.
c) Lise por homogeneização ou maceração (blender ou potter)
Esta técnica consiste na utilização de um homogeneizador para provocar a lise celular de forma mecânica. O homogeneizador potter (Figura 14) é composto por um pistão que ao ser inserido em um tubo de vidro fica muito próximo da parede desse tubo, de modo que, pelo processo de fricção do tecido, as células são obrigadas a passar pelo espaço entre o pistão e o vidro, sendo maceradas e tendo suas membranas plasmáticas rompidas.
21 4.1.2. MÉTODOS FÍSICOS NÃO MECÂNICOS DE LISE CELULAR:
a) Lise por sonicação
A lise por sonicação consiste na aplicação de ultrassons cujas vibrações, com uma frequência de 20 a 30 kHz, geram tensões mecânicas no fluido (suspensão celular) suficientes para a ruptura das células. Esse processo baseia-se no fenômeno de cavitação acústica, que é o processo de nucleação, crescimento e colapso de bolhas transientes em líquidos expostos a ondas ultrassônicas de baixa frequência (< 1 MHz). As ondas ultrassônicas se propagam através de um líquido em ciclos alternados de compressão e expansão (rarefação). Durante a compressão, as moléculas presentes no meio são forçadas a aproximarem-se, enquanto durante a expansão a afastarem-se. Se em um meio líquido a pressão de expansão for maior que as forças coesivas (tensão superficial) entre as moléculas, ocorre a formação de bolhas de cavitação que vão crescendo durantes os ciclos de expansão e colapsando durante os ciclos de compressão (Figura 15). O colapso das bolhas provoca uma grande liberação de energia, gerando temperaturas locais elevadas e altas pressões.
22 O sonicador (Figura 16) é constituído por um gerador (oscilador), um transdutor e uma ponteira ou sonda (que em geral é composta de titânio). A sonda transmite as vibrações (produzidas no transdutor) ao líquido em que se encontra mergulhada, originando por sua vez, ciclos rápidos de altas e baixas pressões.
Figura 16 – Modelos de sonicadores
Os parâmetros que influenciam a ruptura das células por sonicação são vários, destacando-se entre eles, fatores característicos da cultura e das condições do seu crescimento, tais como:
A composição do meio de crescimento;
A fase de crescimento em que as células foram obtidas; A taxa específica de crescimento durante a fermentação;
A tensão superficial da membrana celular (característica do microrganismo);
O tamanho das células;
Outros fatores associados ao processo também influenciam a ruptura das células por sonicação, que são:
23 Tamanho e forma da ponteira de sonicação (sonda);
Concentração celular;
Volume da suspensão celular;
Valores de pH, temperatura e viscosidade da suspensão celular.
O fator temperatura, além de influenciar a cinética de ruptura, também é crítico em termos da preservação da atividade biológica das proteínas libertadas. Deste modo, os processos de sonicação são habitualmente realizados na presença de dispositivos que promovam o arrefecimento.
A escolha do tipo de equipamento e de sonda a ser acoplada neste equipamento de laboratório depende do volume da amostra, de sua faixa de viscosidade e da intensidade de energia ultrassônica necessária para a homogeneização da mistura.
O uso do ultrassom para o rompimento em larga escala tem um alto custo, pois é necessário utilizar grande quantidade de sondas dispostas em serie e instalar um eficiente sistema de refrigeração.
b) Lise por congelamento ou descongelamento
Neste método, as células são submetidas a repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, resultado na formação intracelular de grandes cristais de gelo cristais de gelo que podem perfurar a célula e provocar seu total rompimento ou lesioná-la formando poros permeáveis à biomolécula-alvo. Os fatores de influencia nesse processo são o tipo e a idade da célula, temperatura e velocidade dos ciclos de congelamento/descongelamento. Apesar de ser um método bem simples, ele apresenta algumas desvantagens, como: o tempo relativamente grande para que ocorra o rompimento celular; difícil implantação em larga escala; consumo de energia para o congelamento e/ou descongelamento; moléculas sensíveis ao descongelamento podem ser inativadas. Em contrapartida, esse método possui vantagens como: boa eficiência na ruptura celular, reprodutibilidade, utilização de equipamentos de fácil manipulação e a praticidade.
c) Lise através da termólise
Esse método é baseado na elevação da temperatura para induzir o rompimento celular. Porém, os resultados dependem do tipo do microrganismo,
24 da fase de crescimento e ainda, da temperatura de armazenamento, que se for muito baixa (0 a –5ºC) pode aumentar a resistência térmica.
O rompimento total de células de uma suspensão de E. coli ocorre com aquecimento a 90 ºC por 15 minutos, com a total liberação de biomoléculas.
A suspensão celular pode ser aquecida em banho termostatizado, com injeção de vapor direto, em tambor rotativo ou em spray-drier. Método utilizado no rompimento de algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à produção de proteína microbiana. Este método gera fragmentos celulares com maiores dimensões e facilmente removíveis por filtração ou centrifugação.
4.2. MÉTODOS QUÍMICOS DE LISE CELULAR
Os métodos químicos de lise são divididos em: álcalis, solventes, detergentes e ácidos. Os álcalis mais utilizados são amônia e hidróxido de sódio, porque causam inativação de patógenos ou microrganismos geneticamente modificados durante o rompimento. A geração de poluentes é a principal desvantagem no uso de álcalis em rompimento celular. Os detergentes têm a propriedade de dissociar proteínas integrais e lipoproteínas das paredes celulares, provocar a formação de poros e liberar a molécula-alvo. Já as proteínas periféricas podem ser dissociadas da membrana na presença de soluções hipersalinas ou soluções de pH extremos. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentado por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos que iniciam e estimulam a autólise. Os solventes (como o etanol) podem ser utilizados como desidratantes químicos das células. Esse procedimento é indicado só para biomoléculas que não sejam desnaturadas na presença do solvente empregado.
Os agentes caotrópicos como a uréia ou a guanidina, também são comumente utilizados nos métodos químicos de lise. Eles desorganizam a estrutura da água, diminuindo sua hidrofilicidade, enfraquecendo as interações soluto-soluto. Normalmente, espécies hidrofóbicas como as proteínas da membrana podem ser solubilizadas em concentração suficiente, tornando efetivo este método. O etanol é muitas vezes classificado como solvente orgânico, porém também é efetivo como solvente caotrópico rompendo as bandas de hidrogênio na água
25 4.2.1. PRINCIPAIS MÉTODOS QUÍMICOS DE LISE CELULAR
a) Lise osmótica
O processo de osmose envolve a passagem de moléculas do solvente (água, em sistemas biológicos) por uma membrana semipermeável. Sendo assim, se colocarmos células em uma solução hipotônica a tendência é que elas absorvam água. A pressão gerada pela entrada de solvente no interior da célula provoca então o seu rompimento. Na lise osmótica, as células geralmente são incubadas em um meio de alta pressão osmótica (por exemplo, sacarose 1 M), que em seguida, é diluído de forma repentina. A água entra rapidamente na célula, aumentando a pressão interna e causando uma permeabilidade seletiva ou a lise celular (Figuras 17 e 18). Porém, esta técnica só é indicada para células enfraquecidas, pois é incapaz de romper integralmente células que possuem parede celular.
26 Figura 18 – Esquema comparativo entre o rompimento total e a permeabilidade seletiva
Por este método, geralmente as células são mantidas por 30 minutos em meio com concentração de sacarose de 1 M ou ~20% (m/v). Em seguida elas são separadas por centrifugação e ressuspensas em água destilada a 4 ºC. Este método mais indicado para bactérias gram-negativas, pois possuem parede celular mais sensível que as gram-positivas.
b) Lise com Detergentes
Os detergentes, por possuírem a capacidade de solubilizar lipídeos de membrana e dissociar as proteínas integrais e lipoproteínas da parede celular, podendo provocar a formação de poros na membrana plasmática e a lise celular. Estes podem ser agrupados em aniônicos (por exemplo, o dodecil sulfato de sódio - SDS) e sais de ácidos graxos, catiônicos (por exemplo, sais de tetra alquilamônio) e não-iônicos (por exemplo, Triton X). Uma consideração importante é que a seleção do detergente está diretamente ligada ao produto. Muitas proteínas são desnaturadas por SDS, mas não por Triton X-100, pois os detergentes não iônicos geralmente solubilizam a membrana integral e proteínas sem a perda da atividade.
27 c) Lise alcalina
Essa técnica muito aplicada para extrair DNA (genômico e plasmidial) de bactérias. Esse método implica no uso de três soluções:
Solução 1 - contém glicose, Tris-HCL, EDTA e RNAses. A glicose cria uma alta concentração de soluto fora das bactérias, de modo que elas se tornam um pouco flácidas facilitando o processo de lise. O EDTA e o tris-HCl funcionam como agentes quelante e tamponante, respectivamente, enquanto o RNAse mastigará qualquer RNA dentro da célula para tirá-la do caminho.
Solução 2 - promove efetivamente a lise celular. Ela contém o detergente SDS e NaOH, que eleva o pH para 11, ou acima, desnaturando as proteínas dentro da célula e fazendo com que o DNA se separe em filamentos simples.
Solução 3 - contém acetato de potássio para restaurar o pH para um nível mais neutro, de forma que os filamentos de DNA possam se unir. Enquanto isso, as proteínas desnaturadas se reúnem e precipitam-se, enquanto os íons de dodecil sulfato se unem aos íons de potássio para formarem um composto insolúvel, que também pode se precipitar da solução.
A lise alcalina é um processo difícil de controlar, apresenta falta de reprodutividade e pode implicar perdas significativas de DNA (PRAZERES et al., 1999).
Esses métodos químicos apesar de promoverem a ruptura eficiente do envoltório celular geralmente conferem ao sistema condições drásticas (por exemplo, altos valores de pH) que podem levar à desnaturação das moléculas de interesse (por exemplo, enzimas) e comprometer os resultados. Quando for necessária a sua utilização deve ser feita com cuidado para que sejam minimizados os efeitos adversos.
4.3. MÉTODOS ENZIMÁTICOS DE LISE
Esses métodos baseiam-se na utilização de enzimas específicas para catalisar a degradação da parede celular da célula-alvo. A grande vantagem da utilização de enzimas para a lise celular baseia-se na seletividade de ação e consequentemente, na eficiência no processo de rompimento.
28 Uma enzima lítica amplamente utilizada no rompimento de células bacterianas, incluindo operações em larga escala, é a lisozima. Essa enzima pode ser encontrada nas células e nas secreções (lágrima, saliva, muco e leite) dos vertebrados, onde provavelmente atua como agente bactericida ou auxilia no descarte bacteriano após a morte das bactérias por outros meios.
A lisozima mais estuda e utilizada é a obtida da clara do ovo de galinha. Essa lisozima é uma proteína monomérica pequena (14,3 KDa) composta por uma cadeia polipeptídica de 129 resíduos de aminoácidos e internamente ligada por quatro resíduos de aminoácidos. Esta enzima promove hidrólise das ligações glicosídicas β-1,4 do peptidoglicano da parede celular bacteriana, mais precisamente entre os resíduos do ácido N-acetilmurâmico (Mur2Ac) e N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) (Figura 19). Essa atividade resulta na alteração da pressão osmótica interna e no rompimento celular.
Figura 19 – Sitio de clivagem da lisozima no peptidoglicano da parede celular bacteriana.
Resumidamente, o mecanismo de ação da lisozima sobre o peptidoglicano da parede celular bacteriana (Figura 20) ocorre da seguinte maneira:
29 1) Primeiro, a lisozima adere-se ao peptidoglicano da parede celular pela ligação a uma unidade do heterossacarídeo (neste caso, o resíduo de N-acetilglicosamina), alterando sua conformação para meia cadeira;
2) O resíduo de ácido glutâmico 35 (Glu 35) presente no sítio ativo da enzima, transfere um hidrogênio (próton) para o átomo de oxigênio que liga o NAC ao NAM, promovendo a clivagem da ligação entre o carbono 1 e o oxigênio da ligação -1,4;
3) Nesta etapa, uma molécula de água atua tanto doando um hidrogênio para substituir o que foi perdido pela cadeia lateral do Glu 35 quanto doando um grupo OH para o carbono 1 do NAC
4) Durante todo esse processo o grupo carboxila do ácido aspártico 52 (também presente no sítio ativo) atua estabilizando a reação através da interação com o hidrogênio do carbono 1 do NAC.
5) A enzima então libera o produto da clivagem completando seu ciclo.
Figura 20 - Mecanismo de ação da lisozima sobre o peptidoglicano da parede celular bacteriana.
As bactérias Gram-positivas são mais sensíveis ao ataque da lisozima do que as Gram-negativas devido à composição da parede celular.
30 Já as enzimas envolvidas na lise de leveduras são: 1,3 glucanases, β-1,6 glucanases, mananases, proteases e quitinases. Essas enzimas agem sinergicamente na lise da parede celular, mas somente duas são essenciais para o rompimento da célula: a protease lítica específica, que degrada a camada externa de mananaproteína e a β-1,3 glucanase lítica, que degrada a camada interna de glucana.
As β-1,3 glucanases, proteases e quitinases estão agrupadas na classe das hidrolases. A β-1,3 glucanase (E.C. 3.2.1.39) (1,3-β-D-glucana glucanohidrolase), também denominada de glucana-endo-1,3- β-D-glicosidase, catalisa a reação de hidrólise das ligações -D-glicosídicas da β-1,3 glucana. (Figura 21).
Figura 21 – Hidrólise da -1,3 glucana pela -1,3 glucanse
A quitinase (3.2.1.14) {Poli[1,4-(N-acetil-b-D-glicosamina)] glucanoidrolase} catalisa reações de hidrólise das ligações β-1,4 de N-acetil--D-glicosamina da quitina (Figura 22).
31 Figura 22 – Hidrólise da quitina pela quitinase
A protease lítica (3.4.21.12) também denominada de -endopeptidase lítica, catalisa a reação de hidrólise de proteínas. Atua preferencialmente sobre a porção proteíca e em Ala+ e Val+ da parede celular (Figura 23).
32 Figura 23 – Hidrólise da mananaproteína pela -endopeptidase lítica
Vários de produtos podem ser isolados e purificados das células microbianas, com auxílio da lise enzimática, como por exemplo: peptídeos, polissacarídeos, proteínas recombinantes, ácidos nucleicos, pigmentos, enzimas, lipídeos, entre outros.
Além do potencial de aplicação na preparação de protoplastos, fusão celular e transformação de microrganismos, pode-se ressaltar sua aplicação na produção de enzimas intracelulares, preparação do polissacarídeo glucana, extração alcalina de proteínas, pré-tratamento para lise mecânica de células, produção de extrato de levedura e extração de pigmentos. A lise de células com enzimas permite seletividade na liberação de produtos, independe da escala e pode ser realizada em condições de pH e temperatura que não implicam na desnaturação de produtos celulares de interesse.
Os métodos enzimáticos possuem as seguintes vantagens: a) são eficientes devido a especificidade da ação enzimática para degradação da parede celular; b) rápido; c) baixa complexidade; d) não necessita de equipamentos complexos; e) podem ser utilizados em associação com métodos físicos de lise (por exemplo: sonicação); f) fácil controle do pH e da temperatura do meio. Desvantagens: a) alto custo para processos de escalonamento (scale-up); b) necessitam de controle das condições ideais de pH e temperatura para ação enzimática eficiente; c) não podem ser utilizados em associação com alguns métodos químicos de lise; d) podem sofrer ação de inibidores enzimáticos; e) podem necessitar de uma etapa cromatográfica para separar a enzima do produto-alvo.Em função da forma mais ou menos vigorosa
33 de lise celular, os métodos podem ver divididos em métodos: suaves, moderados e vigorosos.
5. PRINCIPAIS COMPONENTES UTILIZADOS NA FORMULAÇÃO DOS TAMPÕES DE LISE
A composição do tampão de lise celular varia dependendo do tipo de metodologia utilizada e da molécula-alvo, contudo a maioria possui alguns componentes em comum:
5.1. Sais
As soluções tampão estabilizam o pH, enquanto as células passam pelo processo de lise. A solução de Tris-HCL é o tampão mais comum para o tamponamento em pH 8, caso o pH seja desejado. HEPES é outra solução tampão comum nesses experimentos. O cloreto de sódio também pode ser adicionado para aumentar a força iônica, a concentração total de solutos fora das células. Esse último é importante já que a água pode se difundir em todas as membranas da célula, de regiões de baixa concentração de soluto para as de alta concentração.
5.2. Detergentes
O detergente é o principal ingrediente que dissolve a membrana celular para que o conteúdo possa sair. Os detergentes são moléculas anfipáticas, ou seja, com uma extremidade que facilmente interage com as moléculas de água enquanto a outra extremidade hidrofóbica, ou "que tem medo de água", não faz essa interação. Eles podem dissolver as gorduras ao formar micelas, pequenos grupos, nos quais as caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente apontam para dentro, para as moléculas de gordura. Os detergentes comuns são o dodecilsulfato de sódio (SDS), Tween, NP-40 e Triton X-100.
5.3. Agentes quelantes e inibidores
Os tampões de lise normalmente também contêm agentes quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou o ácido retileno glicol tetra-acético (EGTA). Essas substâncias químicas se ligam aos íons de metal com
34 uma carga +2 (por exemplo, o magnésio e o cálcio), os tornando, dessa forma, indisponíveis para outras reações. Muitas DNAses, assim como algumas precisam desses íons para funcionarem. Ao privá-las desses cofatores, o EDTA e o EGTA, ajudam a inibir a atividade de dessas proteases e DNAses. Entretanto, eles podem não inibir a ação de algumas protesases não metalo-dependentes. Neste caso, é recomendado adicionar aos tampões de lise, os inibidores de proteases (Quadro 2).
35 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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