UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
METALOPROTEINASE DE TRIPANOSOMATÍDEOS:
AVALIAÇÃO DE POTENCIAIS INIBIDORES COMO
FERRAMENTA PARA DESENVOLVIMENTO DE FÁRMACOS
NATAL, 2020
METALOPROTEINASE DE TRIPANOSOMATÍDEOS:
AVALIAÇÃO DE POTENCIAIS INIBIDORES COMO
FERRAMENTA PARA DESENVOLVIMENTO DE FÁRMACOS
Defesa apresentado ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Bioquímica (Área de concentração: Bioquímica e Biologia Molecular).
Orientador: Prof. Doutor Marcelo de Sousa da Silva
Coorientadora: Doutora Aline Rimoldi Ribeiro
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Moreno, Cláudia Jassica Gonçalves.
Metaloproteinase de tripanosomatídeos: avaliação de potenciais inibidores como ferramenta para desenvolvimento de fármacos / Cláudia Jassica Gonçalves Moreno. - Natal, 2020.
195 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Sousa da Silva. Coorientadora: Dra. Aline Rimoldi Ribeiro.
1. Tripanosomatídeos - Tese. 2. gp63 - Tese. 3. L1 - Tese. 4. Doxiciclina - Tese. 5. DETC - Tese. 6. MMPs - Tese. I. Silva, Marcelo de Sousa da. II. Ribeiro, Aline Rimoldi. III.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 561.24
Dedico este trabalho
À minha família, em especial à minha bisavó, in memoriam, Ana dos Reis Borges e a minha mãe, Maria Teresa Borges Moreno.
Aos meus amigos, aos meus eternos amigos, Catisa Nadira Almeida e José Luís Correia, in memoriam.
AGRADECIMENTOS
À Deus, meu pai, que me concebeu entendimento, força e sabedoria pra conduzir essa tese.
Ao meu orientador, prof. Dr. Marcelo Silva Sousa, mais que um orientar é um amigo. Em sala de aula, ofereceu-me em 2013 à oportunidade de acreditar na pesquisa e até hoje me inspira. Meu muito obrigado pela oportunidade e pela paciência comigo, tanto acadêmico e pessoal.
À minha coorientadora e minha amiga, Investigadora Doutora Aline Rimoldi Ribeiro por todo o conhecimento passado desde do mestrado até agora. Meu sincero obrigada e minha tão grande admiração por ti.
Muito obrigada ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa que nos cedeu a cepa QMM9 por ele isolada, e as cepas Bolívia e Y de Trypanosoma cruzi.
À prof. Dra. Gabriela Santos-Gomes que nos cedeu as espécies de Leishmania. Agradeço à professora pelos conselhos em relação a elaboração da tese e conhecimentos passados.
À prof. Doutora Maria das Graça responsável do laboratório multiusuário (Labmulti) da UFRN, que nos acolheu e que sempre se mostrou disponível em auxiliar e ajudar.
Aos professores do departamento de Bioquímica e Biologia Molecular e aos meus colegas e amigos no departamento, em especial, à Géssica, Maria, Luíza e Fábio. Não poderia esquecer, à secretária do departamento, Samara, pela cordialidade no atendimento.
Ao Prof. Dr. Daniel Pontes pela colaboração e a disponibilidade em auxiliar na realização desta tese. Aos alunos Francimar e Mayara muito obrigada pelo apoio e todo suporte nos ensaios realizados no Institutlo de Química da UFRN.
Ao grupo da Unidade de biologia celular do Instituto d Pasteur (Montevidéu) em especial aos professores Dr. Carlos Robello, Dra. Adriana Parodi e Dra. Dollores pelos conhecimentos passados e por toda disponibilidade ao longo da estadia. Também, agradecimentos a gentileza do professor Carlos Robello, em doar as estirpes Dm28c e Cl Brener de Trypanosoma cruzi.
Ao pessoal do laboratório Biopolímeros (BIOPOL), principalmente ao prof. Dr Hugo Rocha e aos doutorandos Talita e Jefferson pelo contributo nesta detese.
Aos professores do departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas em especial a profa. Dra. Antônia Claudia, prof. Dr. Matheus Pedrosa e Dr. Arnóbio Silva e seus respectivos alunos do Tecbiofar, em especial à Alaine, Allanny, Alessandra e Adriana e Bruno.
Ao prof. Dr. Nilton Frazão e aos alunos Monalisa e ao Rafael do LABMOL (CES-UFCG) que ajudaram na elaboração dos ensaios in silico, assim expresso meu muito obrigado.
Ao pessoal do laboratório de Imunoparasitologia, meus caros colegas e amigos em especial, aos que auxiliaram no desenvolvimento desta tese, à Sílvia Donato, Yorleydy, Aline, Jessyka, Taffarrel, Jonhy, Brenna, Wendy, Nilton Junior, Saile, Kyvia, Anna, Joice e Jonhatas
Ao pessoal do LabMulti, Renato, Georgia, Karla, Ony, Saulo, Jefferson, Fernanda e à técnica Michelle. Meu agradecimento aos servidores, Everton e Evandro pela amizade.
Agradeço a minha família, meu alicerce e meu porto seguro, que é grande não só pelo número, mas sobretudo pelo amor. Aqui deixo meu muito obrigada à família Borges-Moreno, em especial às minhas tias, Regina e Joana, que na ausência da minha mãe, me educaram e deram todo carinho. Muito obrigada, à minha avó, que suas palavras sempre reconfortam e fortalecem a minha alma.
À minha mãe. Como é grande meu amor e admiração, pela senhora. Agradeço todos os dias por seres a minha referência maior da determinação, força e humildade. À minha irmã Alícia, ao meu irmão Carlos e minha cunhada Daniela pelo melhor presente, em 2019, à minha amada sobrinha Dayane.
As minhas meninas, minhas irmãs que a vida me deu, Umara e Iromisa pelo incessante apoio e carinho.
À minha família de “Natal”, Samira, Celisa, Adilson e meus pequeninos Rafael e Gabriel. Muito obrigada por tudo.
Aos meus amigos, cada um de vós sois importante para mim. Em especial agradeço ao David, Joana, Jusciane, Cláudia, Gilmara, Hélia, José Augusto, Patrick, Bruce, Aléssio e Jerson que acompanham meu trajeto e incentivam-me a todo momento.
Ao meu melhor amigo e companheiro Ailson Medeiro, pela paciência e pelo apoio incondicional. Muito obrigada meu amor.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos.
À Fundação para Ciência e a Tecnologia (FCT) no âmbito dos projetos PTDC/CVT-CVT/28908/2017 e GHTM-UID/multi/04413/2013.
“Por vezes sentimos que aquilo que fizemos não é
senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Metaloproteinase de Tripanosomatídeos: Avaliação de potenciais inibidores como ferramenta para desenvolvimento de fármacos
A terapêutica antiparasitária para o tratamento e controle das doenças tropicais negligenciadas causadas por tripanosomatídeos é limitada devido a elevada toxicidade e baixa eficácia dos fármacos. Atualmente, não existe vacina disponível para o controle das doenças humanas causadas por tripanosomatídeos. Este estudo teve um caráter multidisciplinar e transversal cujo o objetivo principal foi a caracterização biológica e bioquímica de metaloprotease de tripanossomatídeos, com ênfase na pesquisa de potencias novos compostos com atividade inibitória sobre a proteína. Para isso, foram avaliados a atividade enzimática, identificação da metaloprotease e a capacidade hemolítica de diferentes extratos brutos dos tripanosomatídeos. Seguidamente, fez-se análises in silico e in vitro com os potencias novos inibidores da gp63. Através de ensaios de zimografia foi confirmado o perfil proteolítico das proteínas do extrato bruto de Leishmania spp. sobre o substrato gelatina e caseína. Trypanosoma cruzi exibiu um padrão proteolítico condicente com o perfil descrito na literatura para a cruzipaína, a cisteína protease. Em colaboração com o Instituto de Química da UFRN foi desenvolvido um ensaio fluorescente dependente da coordenação com íon Zn2+. Os resultados evidenciaram a forte
coordenação do composto L1 ao do Zn (II) presentes no extrato bruto de L.
amazonensis. Além disso, os ensaios biológicos demostraram atividade hemolítica
mediada pelo sistema complemento na presença do extrato de tripanosomatídeos. A pesquisa in silico demostrou a ancoragem molecular com energias favoráveis à interação entre os ligantes testados:L1> DETC>Doxiciclina>4TERP37. Ademais, resultado semelhante foi observado no cálculo, de balanço de energia final quântico. A validação in vitro dos compostos mostrou que L1 diminui significativamente, a viabilidade da forma promastigota de L. amazonensis (IC50 de 1,24 µM). O composto
L1, não descrito na literatura, induziu a morte da forma promastigota pelo processo de necrose, análise estrutural revelou danos na membrana, pequenos orifícios na membrana, bem como o vazamento do conteúdo celular. Por outro lado, L1 apresentou alta índice de seletividade sobre as linhagens de células, 3T3 e RAW. Em conjunto, os resultados mostraram potencial efeito leishmaniocida do L1 contra L.
amazonensis, agente etiológico da Leishmaniose difusa, a única forma clínica que não
existe atualmente o tratamento. Paralelamente a este estudo, foi realizado a análise das proteínas variáveis de superfície (VSG) de Trypanosoma brucei onde verificou-se que as metaloproteases de matriz (MMPs) reconhecem moléculas de VSGs do parasita. Em conjunto, os resultados obtidos contribuem para o desenvolvimento futuro de nova abordagem terapêutica na doença causada por tripanosomatídeos. Contudo, estudos futuros, permitirão atestar os presentes resultados.
Palavras-chave: Tripanosomatídeos, gp63, VSGs, MMps, Leishmania spp.,
Trypanosomatids metalloproteinase: Evaluation of potential inhibitors as a tool for drug discovery
Antiparasitic therapy for the treatment and control of neglected tropical diseases caused by trypanosomatids is limited due to their high toxicity and low drug efficacy. Currently there is no available vaccine for control of human diseases. This study had a multidisciplinary and cross-sectional character whose main objective was the biological and biochemical characterization of trypanosomatids metalloproteases (gp63) with emphasis on the research of news potential compounds capable of inhibition protein activity. Thus, the enzymatic activity, metalloprotease identification and hemolytic capacity of different Trypanosomatids crude extracts were evaluated. After that, in silico and in vitro analyzes were performed with the potential news gp63 inhibitors. Through, zymography assays the proteolytic profile was visualized from
Leishmania spp. crude extract proteins on gelatin and casein substrate. Trypanosoma cruzi exhibited a proteolytic pattern consistent with the profile previous described for
cruzipain, a cysteine protease. In collaboration with the Chemistry Institute of UFRN, a fluorescent assay dependent on Zn2+ ion coordination was developed. The results
showed the strong coordination of compound L1 and Zn (II) present in the crude extract of L. amazonensis. In addition, biological assays demonstrated complement system mediated hemolytic activity in the presence of trypanosomatids extract. In silico approach demonstrated molecular anchoring with favorable energies for the interaction between the ligands tested: L1> DETC> Doxycycline> 4TERP37. Besides, a similar result was observed in the calculation of the quantum final energy balance. In vitro validation of the compounds showed that L1 significantly decreases the viability of the promastigote’s forms of L. amazonensis (IC50 of 1.24 µM). L1 compound, not described
so far, induced promastigotes death by necrosis process and structural analysis, revealed that membrane damage, small holes in the membrane, as well as cell content. Differently, L1 showed a high selectivity index over cell lines, 3T3 and RAW. Together, the results showed a potential leishmaniocidal effect of L1 against L. amazonensis, the etiologic agent of diffuse leishmaniasis, the only clinical form that currently doesn´t exist treatment. In parallel to this study, Trypanosoma brucei surface variable protein (VSG) analysis was performed. It was found that matrix metalloproteases (MMPs) recognize parasite VSGs molecules. Although, both results represent a contribution to the future approach on development therapeutic in diseases caused by Trypanosomatids. However, more further studies will allow to attest the presents results.
Keywords: Trypanosomatids, gp63, VSGs, MMPs Leishmania spp., Trypanosoma
Figura 1. Ciclo de vida dos tripanosomatídeos. ... 15 Figura 2. Prevalência de doenças tropicais negligenciadas (DTNs) por país ... 18 Figura 3. Distribuição da prevalência das DTUs humanas de T. cruzi ... 21 Figura 4. Composição química dos principais compostos utilizados na quimioterapia
das doenças causas por tripanosomatídeos. ... 24
Figura 5. Proteínas presentes na superfície de Trypanosoma e Leishmania spp.
Camadas superficiais dos tripanossomatídeos.. ... 27
Figura 6. Estrutura tridimensional da gp63.. ... 28 Figura 7. Expressão gênica em tripanosomatídeos. ... 31 Figura 8. Influência na regulação e manipulação das vias de sinalização celular por
glicoproteínas de superfície de Leishmania spp (gp63). ... 36
Figura 9. Representação ilustrativa do ensaio de sensibilização de eritrócitos. ... 54 Figura 10. Perfil enzimático em gel de gelatina (A) e caseína (B). Zimograma do gel
de poliacrilamida acoplado de gelatina em extratos de Leishmania spp. ... 56
Figura 11. Perfil proteolítico em gel de gelatina (A) e caseína (B). Perfil enzimático de
extrato bruto de T. cruzi. ... 57
Figura 12. Curva de calibração do Zinco (ZN2+). ... 60 Figura 13. Espetro de emissão do composto L1. ... 61 Figura 14. Ensaio fluorimétrico para a identificação de metaloproteases presente no
Figura 15. Espectro de sobreposição de emissão do ligante L1 coordenado ao Zn (II).
... 62
Figura 16. Espetro de emissão do ligante L1 livre e coordenado ao cobre, Cu (II) e ao
Zn (II). ... 64
Figura 17. Ensaio hemolítico utilizando eritrócitos humanos (Eh). ... 65 Figura 18. Efeito do sistema complemento (Sh) e soro humano inativado (ShI) em
eritrócitos previamente sensibilizados ... 67
Figura 19. Efeito do sistema complemento de 25% soro humano (Sh) e soro humano
inativado (ShI) em eritrócitos sensibilizados ... 68
Figura 20. Visualização da estrutura secundária da proteína Leishmanolisina, gp63.
... 80
Figura 21. Ilustração do método de fracionamento molecular com caps conjugados
(MFCC).. ... 84
Figura 22.Visualização 2D do composto DETC e os resíduos de aminoácidos da gp63
de maior interação.. ... 86
Figura 23. Análise da interação do DETC com gp63 ... 87 Figura 24. Visualização 2D do composto Doxiciclina e os resíduos de aminoácidos da
gp63 de maior interação ... 88
Figura 25. Análise de interação da DOXI (doxiciclina) com a gp63 ... 89 Figura 26. Visualização 2D do composto 4- terpineol e os resíduos de aminoácidos
da gp63 de maior interação. ... 90
Figura 27. Análise de interação do TERP (4- terpineol) com a gp63. ... 91 Figura 28.Visualização 2D do composto L1 e os resíduos de aminoácidos da gp63 de
Figura 29. Análise de interação do composto L1 com a gp63 ... 93 Figura 30. Resíduos relevantes que contribuem para a ligação entre a metaloprotease
(gp63) e o DETC.. ... 97
Figura 31. Resíduos relevantes que contribuem para a ligação entre a metaloprotease
(gp63) e Doxiciclina (DOXI) ... 98
Figura 32. Resíduos relevantes que contribuem para a ligação entre a metaloprotease
(gp63) e 4 Terpineol. ... 99
Figura 33. Resíduos relevantes que contribuem para a ligação entre a metaloprotease
(gp63) e L1. ... 100
Figura 34. Representação da Energia total (eV) dos ligantes ancorados a proteína
gp63. ... 101
Figura 35. A percentagem de inibição do composto L1 (à esquerda) e inibição do
composto DOXI ... 117
Figura 36. Percentagem de sobrevivência de Leishmania amazonensis após 24 horas
de incubação ao composto L1. ... 119
Figura 37. Análise de citometria de fluxo de formas promastigotas de L. amazonensis
após incubação de 24 horas com Anfotericina B (Anf. B); DETC; DOXI e L1. ... 121
Figura 38. Microscopia eletrônica de varredura da forma promastigota de Leishmania
amazonensis. ... 122
Figura 39. Microscopia eletrônica de varredura da forma promastigota de Leishmania
amazonensis. ... 123
Figura 40. Microscopia eletrônica de varredura de formas promastigotas de
Leishmania amazonensis. ... 124
Figura 41. O diagrama mostra os resultados da análise por espectroscopia de raios
Figura 42. O diagrama mostra os resultados da análise por espectroscopia de raios
X (EDS) de promastigotas de L. amazonensis ... 127
Figura 43. Avaliação da viabilidade celular em culturas de células de mamíferos pelo
método do MTT. ... 128
Figura 44.Viabilidade das células 3T3 após 48 horas de incubação com o composto
L1.. ... 129
Figura 45. Atividade enzimática de proteases (gp63) em gel copolimerizado com
Tabela 1. Interação do DETC e gp63 estimada pelo programa AutoDock4. ... 85
Tabela 2. Interação de doxiclina com a gp63 estimada pelo programa AutoDock4. 87 Tabela 3. A interação entre 4TRP e a gp63 estimada pelo programa AutoDock4. .. 90
Tabela 4. A interação entre L1 e gp63 estimada pelo programa AutoDock4. ... 92
Tabela 5. Atividade antiparasitária ... 118
Tabela 6. Valor de Índice de seletividade (IS). ... 129
Tabela 9. Sítios de clivagem do domínio A da VSG ... 140
Tabela 10. Sítios de clivagem do domínio B da VSG ... 141
LISTA DE QUADRO
Quadro 1. Tripanosomatídeos utilizados durante o estudo. ... 46LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aa Aminoácidos
AP-1 Proteína-1 ativada
BSA Albumina sérica bovina (do inglês, Bovine Serum
Albumin)
C3b Componente 3b do sistema complemento
Cdna DNA complementar
CMI Concentração mínima inibitória
CR1 Recetor do complemento 1
CR3 Recetor do complemento 3
D.O. Densidade ótica
DETC Dietilditiocarbomato
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DOXI Doxiciclina
DTN Doenças Tropicais Negligenciadas
DTU Unidade discreta de tipagem
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ERK1/2 Cinases reguladas por sinais extracelulares 1/2
FnR Receptores de fibronectina
GVBS++ Gelatin Veronal Buffer solution
gGAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal
gp63 glicoproteína de 63 kDa
GPI Glicosilfosfatidilinositol
His Histidina
IC50 Concentração inibitória de 50% do crescimento celular
iC3b C3b inativado
IFN-𝛾 Interferão gama
IL-12 Interleucina-12
IRAK-1 Cinase 1 associada ao recetor de interleucina-1
JAK-2 Cinase janus-2
JNK Cinase N-terminal de c-Jun
kDa KiloDalton (103Da.)
L1 4-({bis[(piridin-2-il)metil]amino}metil)-7-hidroxi-2H-1-benzopiran-2-ona
LIT Meio lit (do inglês, Liver Infusion Tryptose)
LPG Lipofosfoglicano
MAPK Cinase ativada por mitogénios
MARCKS Substrato de proteinase C rico em alanina miristoilada
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MFCC Fracionamento Molecular Com Caps Conjugados
MMPs Metaloprotease de matriz
mRNA ácido ribonucléico mensageiro
mRNA RNA mensageiro
MRP Proteínas relacionadas com MARCKS
MSP Principal protease de superfície
mTOR Alvo da rapamicina dos mamíferos
MTT 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5difeniltetrazolium brometo tetrazol
NF-kβ Fator nuclear kβ
NK Natural Killer
NO Óxido nítrico
OMS Organização Mundial de Saúde
Pbs Tampão fosfato salino
PDB Protein Data Bank
pH potencial hidrogênico
PKC Substrato da proteína cinase C
PLC Fosfolipase C
PTP Proteína tirosina fosfatase
RGDS Sequência de arginina (R), glicina (G) e aspartato (D)
RNA Ácido ribonucleico
RNA Ácido ribonucleico
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SDS- PAGE Sodium dodecil sulphate polyacrilamide gel electrophoresis (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio)
Sh Soro humano
ShI Soro humano inativado
SL Spliced leader
SRYD Serina, arginina, glicina e aspartato
STAT-1 Transdutor de sinal e ativador de transcrição-1
TEMED Tetrametiletilenodiamina
Th T helper
TLR Recetores toll-like
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO ... 11 INTRODUÇÃO GERAL ... 12
1. TRIPANOSOMATÍDEOS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA ... 13
2.CICLO BIOLÓGICO E PRINCIPAIS FORMAS EVOLUTIVAS DE TRIPANOSOMATÍDEOS .... 14
3.ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E CLÍNICOS ... 18
4.TERAPÊUTICA ATUAL DAS DOENÇAS CAUSADAS POR TRIPANOSOMATÍDEOS ... 23
5.PRINCIPAL PROTEASE DE SUPERFÍCIE EM TRIPANOSOMATÍDEOS... 26
6.EXPRESSÃO GÊNICA DE GP63 EM TRIPANOSOMATÍDEOS ... 30
7.gp63 COMO FACTOR DE VIRULÊNCIA: INTERAÇÃO PARASITA-HOSPEDEIRO... 35
CAPÍTULO I. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E INTERAÇÃO COM SISTEMA COMPLEMENTO DAS METALOPROTEINASES PRESENTES NO EXTRATO BRUTO DOS TRIPANOSOMATÍDEOS ... 40
1.RESUMO ... 41
2.ABSTRACT ... 42
3.INTRODUÇÃO ... 43
4.MATERIAIS E MÉTODOS ... 44
4.1.Parasitas ... 44
4.2.Cultura axênica e preparação do extrato proteico bruto ... 47
4.3.Caracterização do perfil eletroforético dos extratos protéicos por SDS-PAGE ... 48
4.4.Determinação da atividade proteolítica por zimografia ... 49
4.5.Determinação da atividade proteolítica por Zimografia 2D ... 50
4.7. Ensaios de atividade biológica das metaloproteinases de parasitas sobre células
humanas... 52
4.7.1.Obtenção de eritrócitos e soro humanos ... 52
4.7.2.Optimização do ensaio de sensibilização dos Eh ... 52
4.7.3.Estudo da ativação do sistema complemento ... 53
5.RESULTADOS S E DISCUSSÃO ... 55
5.1.Caracterização bioquímica de metaloproteinase presente no extrato bruto ... 55
5.1.1.Perfil proteico e zimograma de extrato bruto de tripanosomatídeos ... 55
5.2. Identificação da metaloprotease por comprimento de onda de excitação da proteína
dependente de zinco ... 60
5.3.Interação das metaloproteinases presentes no extrato total de diferentes tripanosomatídeos
com eritrócitos humanos ... 65
5.3.1.Ativação do sistema complemento após a sensibilização de Eh utilizando extrato
protéico total de tripanosomatídeos ... 66
6.CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS ... 70
CAPÍTULO II. INTERAÇÃO IN SILICO DA METALOPROTEASE (GP63) COM POTENCIAS NOVOS INIBIDORES ... 72
1.RESUMO ... 73
2.ABSTRACT ... 74
3.INTRODUÇÃO ... 75
3.1.Bioquímica computacional ... 75
3.2.Método atracamento molecular (Docking) ... 76
3.3.Métodos ab initio (ou métodos dos primeiros princípios) ... 77
3.4.Teoria do Funcional de densidade ... 78
3.5.Fracionamento Molecular com Caps Conjugados (MFCC) ... 79
4.1.Metodologia docking molecular ... 80
4.1.1.Estrutura da GP63 ... 80
4.2.Estrutura dos ligantes ... 81
4.3.Docking Molecular ... 82
4.4.Determinação Energética dos Complexos Proteína-Ligante através do MFCC ... 83
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 85
5.1.Análise das interações dos ligantes com gp63 ... 85
5.1.1. Composto Dietilditiocarbomato (DETC) ... 85
5.1.2. Composto Doxiciclina ... 87
5.1.3. Terpineol (ZINC03861537) ... 89
5.1. 4. Composto L1 ... 91
5.2.Análise energética quântica dos aminoácidos proteína-ligante ... 96
5.2.1. MFCC para o composto DETC ... 96
5.2.2. MFCC para o Composto Doxiclina (DOXI) ... 98
5.2.3. MFCC para o composto 4 Terpeniol ... 99
5.2.4. MFCC para o composto L1 ... 100
6.CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS ... 103
CAPÍTULO III. AVALIAÇÃO IN VITRO DE POTENCIAS INBIDORES DE METALOPROTEASE COM ATIVIDADE IN SÍLICO ... 106
1.RESUMO ... 107
2.ABSTRACT ... 108
3.INTRODUÇÃO ... 109
4.MATERIAIS E MÉTODOS... 111
4.1.Compostos ... 111
4.2.1.Parasitas ... 111
4.3.Ensaio de viabilidade celular ... 112
4.4.Ensaio de citotoxicidade sobre as linhagens 3T3 e Raw ... 113
4.5.Análise de apoptose e/ou necrose ... 114
4.6.Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e Espectroscopia de Energia Dispersa-EDS 115
4.7.Avalição da inibição da ativade proteolítica dos potenciais inibodres ... 116
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 117
5.1.Determinação da actividade antiparasitária ... 117
5.2.Análise de mecanismo de morte celular por apoptose e/ou necrose ... 120
5.3. Visualização estrutural de Leishmania amazonensis em presença dos potenciais
inibidores... . 122
5.4. Análise de espectroscopia de Energia Dispersa-EDS... 125
5.5. A Viabilidade as células 3T3 e RAW ... 128
5.6. Compostos com capacidade inibitória da Atividade proteolítica do extrato bruto de L.
amazonensis ... 130
6. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ... 131
CAPÍTULO IV. IDENTIFICAÇÃO DO SÍTIO DE CLIVAGEM DA PROTEÍNA VARIÁVEL DE SUPERFÍCIE DE Trypanosoma brucei ... 133
1.RESUMO ... 134
2.ABSTRACT ... 135
3.INTRODUÇÃO ... 136
4.MATERIAIS E MÉTODOS... 138
4.1.Predição do local de clivagem de sequências VSG de T. brucei ... 138
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 139
5.1.As metaloproteases de matriz reconhecem sítios de clivagem da VSG de T. brucei ... 139
REFERÊNCIAS ... 147 APÊNDICE ... 166
Publicações ... 169
Manuscritos em preparação: ... 172
APRESENTAÇÃO
A terapêutica antiparasitária para o tratamento e controle das doenças tropicais negligenciadas causadas por tripanosomatídeos é limitada devido a elevada toxicidade e baixa eficácia dos fármacos. Atualmente, não existe vacina disponível para o controle para casos humanos das doenças causadas pelos tripanosomatídeos. Diante deste fato, este projeto tem um caráter multidisciplinar e transversal dentro da grande área das ciências biológicas. Sendo assim, o objetivo principal do trabalho foi a caracterização biológica e bioquímica de metaloproteases de tripanossomatídeos com ênfase na busca de potenciais novos compostos com atividade inibitória de metaloprotease.A organização da tese segue a seguinte sequência com a Introdução Geral e a Justificativa. Em seguida, são apresentados capítulos referentes à cada conjunto de experimentos associados aos objetivos específicos, nos itens:
1. Caracterização de metaloproteases pelo zimograma e avaliação da ativação do sistema complemento de metaloproteinases presentes nos extratos proteicos de Leishmania spp, Trypanosoma cruzi e
Trypanosoma brucei.
2. Seleção da capacidade inibitória in sílico de compostos utilizando como modelo enzimático a metaloprotease;
3. Avaliação de inibidores sintéticos como ferramenta para o bloqueio dos prováveis processos biológicos gerados em modelos in vitro;
4. Identificação in sílico de sítios de clivagem para proteína variável de superfície pela metaloprotease de Trypanosoma brucei.
Na estrutura de todos os capítulos citados contém a discussão geral dos resultados, a conclusão e perspectivas. No final da tese, no apêndice, encontra-se os manuscritos em fase de preparação e/ou os que foram publicados, em revistas científicas internacionais durante o desenvolvimento da tese.
1.
TRIPANOSOMATÍDEOS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA
A ordem Kinetoplastida inclui protozoários que pertencem à família Trypanosomatidae e ao gênero Leishmania e Trypanosoma (HONIGBERG, 1963). A designação de Kinetoplastida advém do fato de possuírem junto ao corpo basal do flagelo, ácido desoxirribonucleico (DNA, Deoxyribo Nucleic Acid) mitocondrial (kDNA) altamente condensado, designado por cinetoplasto. Sendo que este, varia de acordo com a forma e a organização estrutural de cada estágio do desenvolvimento do protozoário (LUKEŠ et al., 2014; DE SOUZA et al., 2017). Os protozoários pertencentes a esta ordem, possuem uma única e ramificada mitocôndria, um sistema complexo de edição de ácido ribonucleico (RNA, RiboNucleic Acid), transcrição policistrônica, com trans-splicing de todos os transcritos de RNA mensageiro (mRNA, messenger RNA) e uma via glicolítica inerente aos glicossomas (TEIXEIRA et al., 2012; LUKEŠ et al., 2014). As principais diferenças entre os gêneros podem ser estabelecidas com base nas características morfológicas e no ciclo de vida desses parasitas. No entanto, a análise de marcadores genéticos que envolvem sequências gênicas altamente conservadas tais como a subunidade menor do RNA ribossomal (5S rRNA), genes que codificam para o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal (gGAPDH, glycossomal Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) e repetições gênicas do spliced-leader RNA permite a classificação filogenética (ZINGALES, 1993; ZINGALES, et al., 2009; DE SOUZA et al., 2017).
Os gêneros Trypanosoma e Leishmania são obrigatoriamente dixenos, possuem ciclo de vida zoonótico e antroponótico e são transmitidos por vetores invertebrados hematófagos (LECLERC et al., 2002; KAUFER et al., 2017). O gênero
Trypanosoma agrupa duas espécies causador as de doenças humanas, Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei; em contraste o gênero Leishmania possui mais de vinte
espécies que afetam a saúde humana (KAUFER et al., 2017). No contexto da infeção animal, pode-se enfatizar as espécies de Leishmania e T. evansi, T. vivax e T.
congolense (STUART et al., 2008; FRANCO et al., 2014; AKHOUNDI et al., 2016;
2.
CICLO BIOLÓGICO E PRINCIPAIS FORMAS EVOLUTIVAS DE
TRIPANOSOMATÍDEOS
A família Trypanosomatidae compreende protistas flagelados que vivem em ampla associação com outros organismos, alternando do mutualismo ao parasitismo (MARCHESE et al., 2018). Todos os patógenos, pertencentes a esta família, apresentam um ciclo de vida heteroxênico envolvendo várias espécies de mamíferos e insetos (vector) responsáveis pelo mecanismo principal de transmissão (LUKEŠ et al., 2014). A figura 1, mostra o ciclo de vida dos tripanosomatídeos
Leishmania spp., T. brucei e T. cruzi e as respectivas formas evolutivas, envolvidas
no estabelecimento da infecção e sobrevivência do parasita em diferentes hospedeiros.
As formas promastigotas metacíclicas de Leishmania spp. são transmitidas pela picada da fêmea de flebotomíneo (ordem Diptera, família Psychodidae e subfamília Phlebotominae) dos gêneros Lutzomyia (no Novo Mundo) ou Phlebotomus (no Velho Mundo), durante o repasto do vetor infectado (BATES, 2007). A inoculação das formas promastigotas metacíclicas (flagelados) na pele, iniciam o processo de fagocitose e disseminação no hospedeiro (ISNARD e colab., 2012; GHORBANI; FARHOUDI, 2018). Componentes presentes na saliva do vetor atraem as células dendríticas residentes nos tecidos periféricos e os macrófagos para que iniciem a fagocitose dos parasitas de Leishmania (AWASTHI et al., 2004).
Uma vez, no interior do vacúolo parasitóforo, promastigotas metacíclicos podem se diferenciar em amastigotas replicativas. As formas amastigotas secretam um conjunto de proteínas que podem modular, ou até subverter o papel de enzimas líticas derivadas do lisossomo de modo a permitir a permanência no vacúolo como um nicho adequado para a replicação e o estabelecimento da infecção do protozoário em macrófagos (PODINOVSKAIA; DESCOTEAUX, 2015). A infecção pode se espalhar para outras células fagocíticas diretamente através da liberação de amastigotas infecciosas dos macrófagos ou pode ocorrer a disseminação via fagocitose de células infectadas, permitindo que, amastigotas infectam uma nova célula (PODINOVSKAIA;
DESCOTEAUX, 2015). As células infectadas com Leishmania spp. podem ser ingeridas por flebotomíneos (não infectados) como se pode observar na figura 1.
Após a ingestão, células infectadas sofrem lise por enzimas hidrolíticas presentes no tubo digestivo do inseto, e consequentemente ocorre a liberação de amastigotas que se diferenciam em promastigotas proliferativas no intestino médio. Depois de inúmeros ciclos de replicação por fissão binária e depleção de nutrientes, o ambiente de baixo pH, permite a diferenciação de promastigotas em promastigotas metacíclicas infecciosas (figura 1), formas não replicativas, que se acumulam principalmente na válvula estomodeal do inseto. No próximo repasto sanguíneo, as formas metacíclicas serão então inoculadas no hospedeiro mamífero, através da picada do vetor (LESTINOVA et al., 2017).
Figura 1. Ciclo de vida dos tripanosomatídeos: Leishmania spp, Trypanosoma. cruzi e Trypanosoma
brucei no inseto vetor (F- Flebotomíneo, T-Triatomíneo e G-Glossina) e no hospedeiro vertebrado (ex.
humanos). Os nomes das formas evolutivas de células estão abreviados como A: amastigota, BSF-tripomastigota da corrente sanguínea (slender e stumpy), E- epimastigota, M - forma metacíclico, P- promastigota, PCF- forma procíclica e T- tripomastigota. Fonte: Própria Autoria, utilizando o aplicativo
Ainda, conforme mostrado na figura 1, Trypanosoma cruzi infecta o intestino médio do inseto vetor, principalmente do gênero Panstrongylus, Rhodnius e
Triatoma (popularmente, conhecido como triatomíneo ou barbeiro) com as formas
evolutivas tripomastigotas sanguíneas - não replicativas (T), após repasto sanguíneo (CHAGAS, 1909).
No triatomíneo, essas formas não replicativas diferenciam-se em formas epimastigotas replicativas (não infecciosas para mamíferos), que são capazes de colonizar o intestino médio do inseto. Na região posterior do tubo digestivo, ocorre posteriormente a diferenciação em formas tripomastigotas metacíclicos infecciosos e não replicativo (RIMOLDI et al., 2012). O triatomíneo quando realizar o próximo repasto sanguíneo, sendo que simultâneo ocorre a defecação, libera tripomastigotas metacíclicos presentes nas fezes e na urina, que entram em contato com a pele lesada ou a mucosa exposta do mamífero (RASSI JR et al., 2010).
Os parasitas internalizam-se no novo hospedeiro vertebrado, e se diferenciam em formas replicativas denominadas amastigotas (DE SOUZA, et al., 2010). Após vários ciclos de divisão celular, amastigotas se diferenciam em um estágio intracelular replicativo transiente denominado epimastigotas intracelulares (ALMEIDA-DE-FARIA et al., 1999) e, finalmente, essas formas diferenciam-se em tripomastigotas infecciosos que rompem as células infectadas para o ambiente extracelular (RASSI et al., 2010).
Os tripomastigotas podem ter dois destinos, infectar células adjacentes ou alcançar a corrente sanguínea. Uma vez na corrente sanguínea, podem infectar outras células, assim como tripomastigotas circulantes podem ser ingeridos por um novo inseto que os transmitirá a outros mamíferos (DE SOUZA, 1984; DE SOUZA et al., 2010).
A doença do sono, restrita ao continente Africano, também designada de Tripanossomose Humana Africana (THA) é causada por duas subespécies do parasita; Trypanosoma brucei rhodesiense e Trypanosoma brucei gambiense. As formas evolutivas tripomastigotas metacíclicas infecciosas são transmitidas aos mamíferos durante o repasto sanguíneo através da picada da mosca hematófaga do gênero Glossina, conhecida como mosca tsé-tsé (MOGK et al., 2014, 2017).
A figura 1 mostra a transmissão vetorial na doença do sono (ilustrada em roxo). Após a entrada no hospedeiro vertebrado, os parasitas inicialmente localizados no tecido dérmico migram através do sistema linfático para a corrente sanguínea onde se transformam em tripomastigotas sanguíneos longos e finos (designados por formas, BSF - slender). Estes dividem-se e multiplicam-se dispersando-se por outros fluídos corporais como a linfa e o líquido cefalorraquidiano, ascednendo ao sistema nervoso central do hospedeiro. Dependendo da carga parasitária, as formas slender evoluem para formas não proliferativas, mais curtas e largas denominadas por formas BSF - stumpy (PONTE-SUCRE, 2016). Estas últimas formas de BSF são as únicas que são capazes de se diferenciar nas formas procíclica replicativas (PCF) no interior do vetor e sobreviver nas condições presentes no intestino médio do inseto (RUDENKO, 2011; PONTE-SUCRE, 2016). A mosca tsé-tsé adquire formas sanguíneas de T. brucei durante repasto sanguíneo no hospedeiro mamífero infectado. As formas PCF replicam-se e iniciam a migração para a glândula salivar. Durante este processo, diferenciam-se em epimastigotas pró-cíclicas, um processo que é completado na glândula salivar (figura 1). Depois de colonizar a glândula salivar, diferenciam-se em formas metacíclicas infecciosas e não-replicativas, que serão inoculadas em um novo hospedeiro mamífero no próximo repasto sanguíneo do inseto-vetor (ROTUREAU;VAN DEN ABBEELE, 2013; PONTE-SUCRE, 2016).
A tripanossomíase Africana animal ou nagana é uma forma complexa da doença do sono causada pela infecção com a subespécie e espécies, T. brucei brucei,
T. congolense e T. vivax respectivamente, nos animais domésticos e selvagens na
África central e austral. Estes protozoários também são transmitidos por moscas
tsé-tsé, apresentando o mesmo ciclo biológico que a infeção humana (COX et al., 2010;
PEACOCK et al., 2012; PONTE-SUCRE, 2016).
A família Trypanosomatidae agrupa protozoários cujo o ciclo biológico e as formas evolutivas são complexos, sendo obrigatoriamente intracelulares ou exclusivamente extracelular. O sucesso da infeção por estes protozoários depende da suscetibilidade do hospedeiro vertebrado e da virulência do parasita. Em alguns casos o hospedeiro permanece assintomático por longo período de tempo, favorecendo a transmissão e a manutenção do ciclo biológico do parasita.
3.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E CLÍNICOS
A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera as Leishmanioses, a doença de Chagas e a doença do Sono como principais doenças tropicais negligenciadas (DNTs). Por conseguinte, como pode ser observado na figura 2, DNTs representam importante problema de saúde pública com contribuição significativa nas desigualdades da saúde, como causa significativa da morbidade e mortalidade nas áreas endêmicas e globalmente (MITRA; MAWSON, 2017; WHO, 2017). Afetam mais de um bilhão de pessoas e custam bilhões de dólares às economias em desenvolvimento (MITRA; MAWSON, 2017).
Figura 2. Prevalência de doenças tropicais negligenciadas (DTNs) por país. A carga das DTNs em diferentes países é expressa como número de DTN prevalentes (variando de 1 a 7 ou mais). Imagem extraída de MITRA; MAWSON (2017).
As leishmanioses agrupam-se em complexos de enfermidades causadas por de mais de 20 espécies de Leishmania nos humanos (DESJEUX, 1996; STUART
et al., 2008; WHO, 2017). A doença é endêmica em dezenas de países e
aproximadamente 350 milhões de pessoas são suscetíveis a doença (DE VRIES et
Estima-se a ocorrência de 1,3 milhões de novos casos anuais de leishmanioses e morte de 20.000 a 30.000 indivíduos em regiões predominantemente pobres (WHO, 2017). A doença pode apresentar-se na forma clínica cutânea (difusa ou localizada), muco cutânea ou visceral. As manifestações clínicas variam de acordo com a espécie infectante e o sistema inume do hospedeiro (STUART et al., 2008; MATHERS et al., 2007; LESTINOVA et al., 2017). A importância da leishmaniose tegumentar ou cutânea advém da elevada incidência e ampla distribuição geográfica, bem como na capacidade de assumir formas que podem determinar lesões destrutivas, desfigurantes e incapacitante (READY, 2010; STOCKDALE; NEWTON, 2013; MITRA; MAWSON, 2017; TORRES-GUERRERO et al., 2017).
A forma visceral registra cerca de 200.000 a 400.000 novos casos/ano, sendo altamente endêmica na Índia e África oriental, no entanto a leishmaniose cutânea é a mais frequente com incidência estimada de aproximadamente 1,2 milhões de casos (DE VRIES et al., 2015). Relativamente, à leishmaniose muco cutânea, quase 90% dos casos ocorrem na Bolívia, Perú e Brasil (WHO, 2015, 2017). Embora menos frequente, a leishmaniose visceral, também conhecida como kala-azar, é fatal em mais de 95% dos casos, se não tratada. A doença provoca crises de febre, perda de peso, aumento do baço e do fígado e supressão imunológica (MONZOTE, 2009; MITRA; DE MENEZES et al., 2015; MAWSON, 2017).
A doença de chagas foi descrita, em 1909 por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas, por meio da visualização microscópica do protozoário hemoflagelado denominado de Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909). A presença do parasita na natureza é antiga, cerca de milhares de anos, sendo inicialmente zoonose depois transformou-se em antropozoonose (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010). Atualmente, a distribuição geográfica da infeção chagásica, incluindo os seus reservatórios e os seus vectores, estende-se desde o sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina e Chile (PERÉZ-MOLINA; MOLINA, 2018). Assim, cerca de 90 milhões de pessoas encontram-se em área de risco e aproximadamente 8 milhões estão infectadas (COURA; BORGES-PEREIRA, 2012; MONCAYO; SILVEIRA, 2017; WHO, 2017).
Nas últimas décadas, o aumento do fluxo migratório de latino-americanos portadores da doença para áreas urbanas da América Latina e países não endêmicos conduziram a aparição da doença de Chagas como problema de saúde pública global de carácter epidemiológico (SCHMUNIS, 2007; CHATELAIN, 2017; LINDANI et al., 2019). Na Europa, em particular, estima-se que aproximadamente 250.000 pessoas encontram-se infetadas por T. cruzi (SCHMUNIS, 2007; ALBAJAR-VIÑAS; JANNIN, 2011; PÉREZ-MOLINA et al., 2012).
A infecção chagásica humana é caracterizada por uma fase aguda sucedida de uma fase crônica, que tipicamente, prolonga por toda a vida do hospedeiro (RASSI JR et al., 2010; Peréz-Molina; Molina, 2018). A penetração do parasita pela conjuntiva ocular provoca inflamação no localizada, que conduz a edema bipalpebral unilateral, denominado sinal de Romaña. Quando ocorre a penetração em outros locais da superfície corporal, a lesão é designada por chagoma de inoculação (TEIXEIRA, et al., 2006). Na fase inicial da infecção, T. cruzi encontra-se no sangue periférico do hospedeiro por quatro a oito semanas (PRATA, 2001) e geralmente assintomática (TEIXEIRA et al., 2006). Após 2 a 3 meses de infecção, 40 a 50% dos pacientes progridem para a fase crônica subdivida em duas formas, assintomática e sintomática com cardiomiopatia progressiva e/ou distúrbios gastrointestinais (RASSI JR et al., 2010). A miocardite e a maior taxa de letalidade parecem estar associadas às infecções por via oral, por alimentos ou bebidas contaminados (MITRA; MAWSON, 2017). Contudo, a gravidade da infeção depende de vários fatores, como a virulência da cepa do parasita, multiplicidade de genótipos e fenótipos e a suscetibilidade do hospedeiro vertebrado (TEIXEIRA et al., 2006).
Trypanosoma cruzi apresenta alto grau de variabilidade intra-específica,
detectada por marcadores biológicos, bioquímicos, genéticos e clínicos. Esta diversidade pode estar associada a sua adaptação e sobrevivência em diferentes hospedeiros (BRISSE et al., 2000). Sendo assim, T. cruzi pertence a seis unidades discretas de tipagem (DTU, Discrete Typing Units – do inglês), designadas de TcI a TcVI (ZINGALES, et al., 2009; ZINGALES et al., 2012) que apresentam distribuição geográfica distinta nos países endêmicos (figura 3). As características epidemiológicas dos grupos TcI e TcII permitiram a associação do grupo T. cruzi I ao ciclo silvestre e geralmente apresentação clínica como doença aguda, com o
desenvolvimento de lesões cardíacas e meningoencefalite grave. O grupo TcII está associado ao ciclo doméstico, sendo frequentemente encontrado na população humana (BRISSE et al., 2000). O grupo TcIV causa manifestações cardíacas e digestivas na população.
As infeções por TcIII são raras na população humana e TcV mais comum na transmissão congênita da doença de Chagas humana (ZINGALES et al., 2012). No entanto, todas as DTUs causam a doença de Chagas (ZINGALES, 2018).
Figura 3.Distribuição da prevalência das DTUs humanas de T. cruzi nas zonas endêmicas e as formas clínica da doença de Chagas. O mapa separa as regiões geográficas de acordo com a patologia prevalente para a doença de Chagas: Cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) e a forma crônica digestiva (DIG). Adaptado de ZINGALES (2018).
A OMS estima aproximadamente 20.000/ano casos da doença do sono ou Tripanossomíase Africana. Aproximadamente 65 milhões das pessoas vivem em áreas de risco nos 36 países endêmicos na África sub-saariana (SQUARRE et al., 2016; WHO, 2017). As subespécies de T. brucei que causam a infeção humana, são morfológicas indistinguíveis, mas apresentam diferenças epidemiológicas e clínicas consideráveis (KENNEDY, 2013). T. b. rhodesiense, causa a forma mais grave e fulminante da doença na África oriental. Em contrapartida, contribui com menos de 2% para o número total de casos da doença do sono. Por outro lado T. b. gambiense é responsável pela maioria dos casos de doença do sono na região ocidental e central do continente (mais de 98%) e apresenta a forma clínica menos grave e crônica ( RODGERS, 2010; KENNEDY, 2013; SIMARRO et al., 2014).
Independentemente da etiologia da doença, ambas as formas clínicas apresentam duas fases; uma no início, a fase hemolinfática e a mais tardia, a meningoencefálica (KENNEDY, 2013). Esta última fase da doença coincide com a invasão do sistema nervoso central (SNC) pelo parasita desencadeando sintomatologia de extrema fadiga, também provocada pela desregulação do ciclo circadiano (RIJO-FERREIRA et al., 2018) e culminando em morte na ausência do tratamento (MOGK et al., 2014). A infeção causada por T. b. gambiense apresenta progressão lenta para a fase neurológica podendo demorar meses e ou prolongar-se por anos. Contrariamente, a infeção por T. b. rhodesiense a passagem à fase meningencefálica ocorre em semanas e, uma vez alcançada o SNC culmina com morte em aproximadamente três meses na ausência do tratamento (KENNEDY, 2013; MOGK et al., 2017). A doença do sono animal, causada principalmente pela subespécie T. brucei brucei, provoca perdas econômicas significativas nos países endêmicos (RUDENKO, 2011; PONTE-SUCRE, 2016).
Atualmente, devido a vários fatores incluindo a complexidade do mecanismo de interação parasita-hospedeiro, não existe uma vacina e terapêutica eficaz para o controle e tratamento dessas doenças (MATHERS et al., 2007; SILVA-JARDIM et al., 2014; MOGK et al., 2017; GHORBANI; FARHOUDI, 2018).
4.
TERAPÊUTICA ATUAL DAS DOENÇAS CAUSADAS POR
TRIPANOSOMATÍDEOS
A terapêutica atual antiparasitária para o tratamento e controle da doença de Chagas, Leishmanioses e tripanossomose Africana é limitada e pouco satisfatória. Ainda não existe uma vacina disponível para estas doenças humanas, embora diferentes grupos de pesquisas tenham se esforçado para caracterizar preços acessíveis e vacinas seguras. Assim, a quimioterapia continua sendo o único método possível que pode ser usado para eliminar os parasitas. A figura 4 ilustra os principais compostos utilizados atuamente, na quiomioterapia das doenças causadas por tripanosomatíedeos.
Os medicamentos padrões para a terapia humana das Leishmanioses são antimoniais pentavalentes e anfotericina B (CROFT et al., 2006). Os antimoniais pentavalentes foram usados há várias décadas e, atualmente, continuam sendo utilizado como primeira escolha de tratamento para todas as formas clínicas de leishmaniose. Apesar da eficácia, os pacientes tratados apresentam efeitos colaterais locais e sistêmicos significativos (MCGWIRE et al., 2014). Além disso, alguns relatos sugerem a resistência a medicamentos antimoniais (DE MOURA et al., 2016; TORRES-GUERRERO et al., 2017; MAGALHÃES, 2018). A anfotericina B e mitelfosina são utilizados como segunda linha sendo muito eficaz contra as formas amastigotas, no entanto, vários efeitos colaterais incluindo nefrotoxicidade e cardiotoxicidade são reportados bem como o surgimento de resistências em várias espécies de Leishmania (CROFT et al., 2006; CHATTOPADHYAY; JAFURULLA, 2010).
Atualmente, a terapia conta tripanossomose americana ou doença de Chagas envolve o uso de dois medicamentos, nifurtimox e benzonidazol. No entanto, esses medicamentos têm várias limitações que incluem incerteza sobre sua eficácia, baixa tolerância e efeitos adversos graves (URBINA, 2010; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018).
A maioria das reações adversas aparecem precocemente durante o curso do tratamento conduzindo à descontinuação do mesmo em mais de 10% dos pacientes chagásicos, principalmente adultos. Além disso, ambos apresentam baixa efetividade na fase crônica da doença (MOLINA et al., 2012; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018).
Figura 4. Composição química dos principais compostos utilizados na quimioterapia das doenças causas por tripanosomatídeos. Imagem adaptada de (NOGUEIRA et al., 2011) e (BAKER et al., 2013).
O tratamento da doença do sono é feito baseado no estágio da doença e nas subespécies de parasitas envolvidas na infeção (KENNEDY, 2013). A doença causada por T. b. gambiense no estágio hemolinfático é tratado efetivamente com pentamidina intramuscular e a suramina por via intravenosa para o estágio inicial na infeção causada por T. b. rhodesiense. No segundo estágio, existe apenas um medicamento eficaz, o melarsoprol, para a infecção por T. b. rhodesiense e a eflornitina para e T. b. gambiense. Entretanto, à via de administração dos medicamentos (injeções) e os relatos de falhas no tratamento com melarsoprol - o único tratamento eficaz na forma mais grave da doença, assim como a toxicidade representam os principais desafios atuais do tratamento da doença do sono (MORENO, 2019).
Tendo em consideração os efeitos colaterais graves dos medicamentos comumente usados na quimioterapia das doenças causada por tripanosomatídeos e o surgimento de parasitas resistentes a medicamentos, torna-se urgente novos compostos que requerem poucos ciclos de administração e que são mais eficazes e menos tóxico para pacientes (KENNEDY, 2013; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018; GHOBANI; FARHOUDI, 2018).
O desenvolvimento e os avanços na era pós-genômica aumentaram a identificação de novos tipos de alvos de drogas para o tratamento de doenças, incluindo os causados por protozoários. Por outro lado, o reaproveitamento de medicamentos é uma estratégia que utiliza medicamentos ou classes de compostos existentes e os utiliza como ponto de partida para a descoberta de drogas (LUSCHER
et al., 2007). Essa abordagem deve incluir moléculas que são conhecidas por estarem
ativas contra o alvo pretendido ou um alvo relacionado. Neste sentido, um alvo de droga é definido como uma proteína essencial para o parasita e que não apresenta homólogos no hospedeiro (NKEMNGU et al., 2003; LUSCHER et al., 2007;CULLEN; MOCERINO, 2017).
A identificação de todas as proteínas essenciais e exclusivas do parasita, pode permitir triagem de inibidores, como exemplo, inibidores de proteases dos protozoários.
5.
PRINCIPAL
PROTEASE
DE
SUPERFÍCIE
EM
TRIPANOSOMATÍDEOS
Proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas. Existem pelo menos 6 classes de proteases classificadas de acordo com os grupos nucleofílicos responsáveis pelo primeiro passo na proteólise: serina, aspartato, glutamato, treonina, cisteína e metalo – proteases (SIQUEIRA-NETO et al., 2018).
As metaloproteases zinco-dependentes, ou seja, aquelas que utilizam o íon metálico para sua atividade catalítica, são classificadas em quatro grupos distintos: (i) zincinas, que contêm a sequência conservada HEXXH como motivo de ligação ao zinco; (ii) inverzincinas, que possuem o domínio zincina de ligação ao zinco invertido (HXXEH); (iii) carboxipeptidase, que possuem o motivo de ligação ao zinco, HXXE e (iv) DDcarboxipeptidase, que apresenta o motivo de ligação ao zinco HXH. O X presente nos motivos representa um aminoácido (aa) qualquer (HOOPER, 1994; ROSENBERG, 2009).
Para ligação ao metal, todos os grupos possuem como primeiro e segundo ligantes resíduos de histidina, que atuam como uma base ou ácido durante o processo catalítico, exceto nas carboxipeptidases. Exceto nas inverzincinas, o terceiro ligante pode ser um resíduo de histidina ou um ácido glutâmico (inverzincinas e zincinas). O grupo zincinas é subdividido em gluzincinas sendo o ácido glutâmico como o terceiro ligante do zinco e metzincinas cujo terceiro ligante do zinco é uma histidina (MOORE
et al., 1993; HOOPER, 1994). Deste último, se destacam as metaloproteases de
matriz (MMPs).
As famílias das MMPs foram descritas inicialmente em vertebrados, com diferentes funções essenciais na mediação da remodelação e adaptação dos tecidos, regulação durante o processo do desenvolvimento e na associação com diversas patologias (PAGE-MCCAW et al., 2007; LÖFFEK et al., 2011; MURPHY, 2015), incluindo as causadas por microrganismos como os protozoários (YONG et al., 1998; ROSENBERG, 2009; GEURTS et al., 2012).
Os tripanossomatídeos possuem um tipo particular de endopeptidases, as metaloproteases, que para além de serem parte integrante do parasita desempenham funções importantes na virulência e patogenia das infeções.
Durante o processo infeccioso, T. brucei expressa proteínas que permitem a sobrevivência no meio extracelular enquanto que os parasitas intracelulares,
Leishmania e T. cruzi, utilizam vários tipos de proteínas para interagir na
internalização e garantir eficácia da infecção (YAO, 2010). A figura 5, mostra as principais proteínas envolvidas no processo de interação do parasita-hospedeiro (T.
brucei) e a internalização de Leishmania spp. e T. cruzi. Este processo, inclui várias
moléculas como o lipofosfoglicano (GLP) e a glicoproteína de 63 kDa (gp63) ancoradas à glicofosfatidilinositol (GPI).
Figura 5. Proteínas presentes na superfície de Trypanosoma e Leishmania spp. Camadas superficiais dos tripanossomatídeos. A presença da proteína variável de superfície (VSG) glicosilinositolfosfolipídeo (GIPL) lipofosfoglicano (LPG) e a glicoproteína gp63 (PSP), ancoradas no glicofosfatidilinositol (GPI).
A leishmanolisina conhecida por gp63, também denominada de Major
Surface Protease- MSP, é uma metaloprotease abundante (0,5-1% da proteína celular
total) presente na superfície de promastigotas, incluindo o flagelo e a bolsa flagelar (figura 5). Descrita nos anos 80, é considerada o principal antígeno de superfície expresso em promastigotas (PSP, Promastigote Surface Protease) de Leishmania spp. (ISNARD et al., 2012; D’AVILA-LEVY et al., 2014). A metaloproteína homóloga já foi reconhecida em T. cruzi e T. brucei (GRANDGENETT et al., 2000; ISNARD et
al., 2012).
A glicoproteína (gp63) é uma molécula compacta contendo predominantemente a estrutura secundária da folha β. As dimensões globais da molécula são 45 × 50 × 70 Å. Como ilustrada na figura 6, a proteína consiste em três domínios: os domínios N-terminal, central e C-terminal (SCHLAGENHAUF et al., 1998).
Figura 6. Estrutura tridimensional da gp63. À esquerda, a estrutura tridimensional do esqueleto proteico da gp63. Em tons de azul localiza-se o domínio N-terminal, em tons de verde o domínio central e em tons de amarelo e vermelho o domínio C-terminal. O centro catalítico encontra-se identificado por um
círculo preto e amplificado na imagem à direita. A bola azul representa o Zn2+ e a ligação as moléculas
de histidina e água (H2O) A imagem foi construída no UCSF Chimera 1.10 com base na sequência da
gp63 de Leishmania major obtida no Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/structure/1LML), utilizando o código de acesso 1LML.
No domínio N-terminal encontra-se uma sequência conservada que contém um resíduo de cisteína ligado ao Zn2+ (íon zinco) que constitui o centro catalítico e que
contribui para o mecanismo cystein switch (BIANCHINI et al., 2006). Este mecanismo impede a degradação dos componentes intracelulares do parasita pela enzima recém-sintetizada (ISNARD et al., 2012). Os resíduos catalíticos His264 e His268 da assinatura HisGluXxxXxxHis se localiza também neste domínio (BIANCHINI e colab., 2006) destacado na figura 6. Consiste em duas -hélices projetadas contra uma folha- composta por quatro fitas- entrelaçadas (SCHLAGENHAUF et al., 1998).
O domínio central é constituído por -hélices e folhas- antiparalelas e uma ponte de dissulfeto que estabelece a ligação ao subdomínio C-terminal. O terceiro resíduo de histidina (His334) é projetado para o interior do sítio catalítico, contendo resíduo, Met-turn, única à todas enzimas da classe metzincina. Ainda na figura 6, adjacente à primeira histidina se encontra um resíduo de glutamina (Glu) responsável por atrair átomos de hidrogênio, das moléculas de água (H2O) até ao Zn2+
coordenando assim, o átomo de zinco catalítico (BIANCHINI et al., 2006).
O domínio C-terminal possui seis das nove pontes de dissulfeto, o que indica que é uma estrutura extremamente rígida. A âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) é adicionada aos últimos resíduos deste domínio e possui uma conformação similar a uma -hélice (SCHLAGENHAUF et al., 1998). A sua adição depende do reconhecimento de um peptídeo-sinal.
Promastigotas de todas as espécies do gênero Leishmania expressam gp63, assim acredita-se ser um ligante envolvido na interação do parasita com sistemas defensivos do hospedeiro, incluindo componentes do sistema complemento e da superfície de macrófagos (representado sob coloração verde na figura 4).
Relativamente ao gênero Trypanosoma foi descrito múltiplos genes homólogos à metaloprotease no genoma, tendo aproximadamente 33% de identidade (CUEVAS et al., 2003; LACOUNT et al., 2003).
6.
EXPRESSÃO GÊNICA DE GP63 EM TRIPANOSOMATÍDEOS
Desde 2005, as sequências genômicas de tripanosomatídeos encontram-se disponíveis em baencontram-se de dados Tri-Tryp (https://tritrypdb.org/tritrypdb). O genoma de T. cruzi contêm o maior repertório gênico (55 Mb e ~12.000 genes) comparado com 26 Mb e 9068 genes de T. brucei. Por outro lado, o genoma de Leishmania possui 32,8 Mb e 8311 genes (DE GAUDENZI et al., 2011). A análise destas sequências contribui para a compreensão da biologia dos parasitas e interação com os hospedeiros (EL-SAYED et al., 2005; ALVAREZ et al., 2012; TEIXEIRA et al., 2012; BERNÁ et al., 2017).
Contudo, os mecanismos envolvidos na iniciação da transcrição em tripanossomas continua sendo uma questão intrigante (TEIXEIRA et al., 2012). Sabe-se que a transcrição dos genes não ocorre de forma individual (figura 7), mas em grupos, na forma policistrônica (10 a 100 genes). Sendo que, à semelhança do que ocorre nas bactérias e ao contrário do que se verifica nos procariotos, os genes transcritos não estão funcionalmente relacionados (DE GAUDENZI et al., 2011; TEIXEIRA et al., 2012). Os genes transcritos podem ter origem nas duas cadeias de DNA, o que significa que a transcrição pode ocorrer simultaneamente em direções opostas (CLAYTON; SHAPIRA, 2007; KRAMER, 2012). Permitindo assim, a ocorrência de múltiplas cópias do mesmo gene, o que justifica a redundância de genes que codificam para as proteínas de superfície conservadas.
Após transcrição gênica, e como ilustrado na figura 7, as múltiplas sequências codificantes que compõem o pré-mRNA policistrônico são individualizadas por trans-splicing, processo durante o qual é adicionada à extremidade 5´ uma sequência designada de spliced leader (SL) e à extremidade 3´ é adicionada uma cauda com múltiplas adeninas (poli-A), originando numerosas sequências de mRNA (CLAYTON, 2002; YAO et al., 2003; CLAYTON; SHAPIRA, 2007; TEIXEIRA et al., 2012;).
Figura 7. Expressão gênica em tripanosomatídeos. Grandes grupos de genes não relacionados (caixas de seta) são organizados como unidades de transcrição policistrônicas separados por regiões divergentes ou convergentes. Os RNAs policistrônicos (pré-mRNAs) são individualizados em mRNAs monocistrônicos seguido de adição do RNA splice leader através de uma reação de trans-splicing acoplada a poliadenilação e processamento de RNA alternativo que pode resultar em mudanças no códon iniciador alterando assim a tradução de proteína (A), segmentação e/ou função (B). O splicing
alternativo e a poliadenilação também podem resultar na inclusão/exclusão de elementos reguladores
presentes nos 5 ' UTRs (C) ou 3 'UTRs (D), alterando assim a expressão gênica. Fonte: Adaptado de (TEIXEIRA et al., 2012).
Os pré-mRNAs policistrônicos podem sofrer processamento de RNA alternativo que resulta em mudanças do códon iniciador alternando a tradução proteica (TEIXEIRA et al., 2012). Tendo em conta este mecanismo genético incomum, a expressão depende de mecanismos pós-transcricionais e eficiência da tradução (BUTTON; MCMASTER, 1988; GRANDGENETT et al., 2000; LACOUNT et al., 2003; YAO et al., 2003; HUTCHINSON et al., 2007; DE GAUDENZI et al., 2011).
O nível de expressão de cada classe gênica de gp63 é modulado em função da fase de crescimento do parasita em cultura e do respetivo estádio, no decorrer do ciclo de vida (CLAYTON; SHAPIRA, 2007; HUTCHINSON et al., 2007; LI et al., 2016; PONTE-SUCRE, 2016). Os transcritos de mRNA maduro compreendem, tanto a jusante como a montante das cadeias, regiões não codificantes (UTR, untranslated
As diferenças nucleotídicas nas 3´UTR representam um fator chave nos processos de regulação pós-transcricional, uma vez que, encontra-se relacionadas a estabilidade do mRNA e, consequentemente com o controle da tradução proteica, regulando desta forma a expressão de gp63 (YAO et al., 2003; SIEGEL et al., 2011).
As primeiras modificações, pós-tradução da proteína, ocorrem após a síntese no retículo endoplasmático e N-glicosilação. Posteriormente, ocorre a incorporação de uma âncora glicofosfatidilinositol (GPI) mediante o reconhecimento do peptídeo-sinal localizado no C-terminal seguido de clivagem (FERGUSON et al., 1985; YAO, Chaoqun et al., 2003; GRUSZYNSKI et al., 2006; PINGER et al., 2017;). Seguidamente, ocorre a translocação para o complexo de golgi e deste para a bolsa flagelar, o único local no parasita para a endocitose e exocitose (ILGOUTZ et al., 1999; MCCONVILLE; FERGUSON, 1993; GRUSZYNSKI et al., 2006; MCGWIRE et al., 2003; YAO, et al., 2003).
As formas insolúveis da glicoproteína (gp63) presentes na membrana, as que contêm a âncora GPI, são exportadas para a superfície da membrana externa onde poderão ser libertadas por auto-protólise (MCGWIRE et al., 2002). Enquanto que, as formas solúveis no citosol, são mantidas na bolsa flagelar onde lentamente são segregadas para o meio externo ou são reencaminhadas para o lisossomo para a degradação através do mecanismo de regulação da expressão da proteína (WALLER; MCCONVILLE, 2002).
A existência de múltiplos genes que codificam para gp63 demostra que a expansão gênica difere consideravelmente entre os parasitas da mesma família. O genoma de T. cruzi contêm mais de 700 genes e pseudogenes de gp63. Em contraste,
L. infantum e T. brucei possui 7 e 14 genes, respetivamente (LACOUNT et al., 2003;
YAO 2009; YAO, 2010; BERNÁ et al., 2017, 2018). Além disso, a composição gênica no gênero Leishmania é distinta entre os diferentes subgêneros. As espécies pertencentes ao Subgênero Viannia dispõem de maior variedade de genes MSP comparativamente ao subgênero Leishmania (PEACOCK et al., 2007). A gp63 de
Leishmania spp. é expressa abundantemente em promastigotas, principalmente na
forma evolutiva promastigotas metacíclicos infeciosos e a expressão é reduzida nas formas amastigotas intracelulares (D'AVILA-LEVY et al., 2013).
