Interação das metaloproteinases presentes no extrato total de diferentes tripanosomatídeos com eritrócitos humanos

Primeiramente, os eritrócitos humanos foram incubados em concentrações crescentes de 2,5; 5 e 10 % (diluído em tampão GVB++) _{com diferentes volumes de}

tampão de lise (0-20 µl). Este experimento foi utilizado para otimização do volume ideal de tampão de lise a ser utilizado posteriormente no ensaio e definir a concentração de hemácias (Eh) para o prosseguimento do ensaio biológico. Como pode ser observado na figura 17, não houve diferenças estatisticamente significativas em relação a quantidade do tampão de lise entre as diferentes concentrações do Eh testados. Assim, foi possível concluir que a concentração de 2,5% pode ser utilizada no estudo da sensibilização.

Figura 17. Ensaio hemolítico utilizando eritrócitos humanos (Eh). As concentrações de eritrócitos

humanos (Eh) foram de 2%, 2,5% e 5% em tampão VBS++ _{e incubados com diferentes volumes de}

tampão de lise (0 - 20μL). Os valores foram expressos em média e ±. desvios padrão.

D O ( 4 1 5 n m ) 20 10 5 ₂,5 0 0 1 2 3 4 5 1 0 % E h 5 % E h 2 , 5 % E h  L

5.3.1. Ativação do sistema complemento após a sensibilização de Eh utilizando extrato protéico total de tripanosomatídeos

A partir do resultado anterior (figura 17) foi estabelecido a concentração de 2,5% para a avaliação da ativação do sistema complemento frente aos eritrócitos previamente sensibilizados com o extrato bruto. A sensibilização de eritrócitos pelos parasitas pode ocorrer através do reconhecimento e interação direta com antígenos expressos à superfície da célula ou pode ser mediada pelo sistema complemento.

Como descrito anteriormente, as proteases principais de superfície de

Leishmania spp. e glicoproteínas de T. cruzi possuem a capacidade para interagir e

ativar várias vias de sinalização na célula, incluindo o sistema complemento. Este último, consiste em aproximadamente 40 proteínas que circulam no sangue/plasma ou ancoradas na superfície celular. Assim sendo, é um componente importante da resposta imune inata que reconhece patógenos microbianos, promovendo a opsonização, inflamação, eliminação de complexos imunes e lise celular (RAMÍREZ- TOLOZA; FERREIRA, 2017)

Os ensaios de sensibilização de eritrócitos (Eh) foram utilizados para avaliar o efeito da interação de metaloproteases presentes no extrato bruto. Sendo assim, os eritrócitos sensibilizados com os diferentes extratos foram posteriormente incubados com soro autólogo contendo o sistema complemento ativo e inativado, de modo aferir se este efetivamente desencadeia a lise eritrocitária. A figura 18, mostra a ação do sistema complemento ativado (Sh) e inativado (ShI) sobre os Eh previamente sensibilizados com 100 μg.ml-1 de extrato de Leishmania spp. Os Eh sensibilizados em contato com o sistema complemento inativado (ShI) apresentaram menor percentagem de lise eritrocitária comparativamente aos eritrócitos incubados com soro contendo o sistema complemento ativo (figura 18) apresentando diferenças significativas, exceto para a espécie de L. infantum. A comparação entre as diferentes espécies demostrou diferenças estatística significativas entre L. infantum, L.

Figura 18. Efeito do sistema complemento (Sh) e soro humano inativado (ShI) em eritrócitos

previamente sensibilizados com 100 μg/mL de extratos brutos de Leishmania spp. Eritrócitos não

sensibilizados, controle negativo (CN) e controle positivo, 100% de lise celular (CP). Os resultados estão representados em média± desvio padrão. Os resultados foram considerados estatisticamente significativo (*) para p value < 0,05 utilizando o teste de múltipla comparação (Teste anova-oneway) e teste de Normalidade (Shapiro-wilk).

Ainda na figura 18, foi observado maior percentagem de hemólise nos eritrócitos previamente sensibilizados com os extratos de L. amazonensis e L.

guyanensis na presença do sistema complemento ativo.

No decorrer do ciclo de vida, T. cruzi apresenta múltiplas modificações fisiológicas e morfológicas que são reguladas para sobreviver no interior de triatomíneos e em células hospedeiras de mamíferos. Assim, epimastigotas, que são formas não infectantes e não infeciosa do parasita são altamente suscetíveis à lise mediada pelo complemento e à destruição celular. O sistema complemento pode causar lise pela ativação da cascata ou facilitar a destruição do parasita por células fagocíticas (RAMÍREZ-TOLOZA; FERREIRA, 2017).

Figura 19. Efeito do sistema complemento de 25% soro humano (Sh) e soro humano inativado (ShI) em eritrócitos sensibilizados com 12.5 μg/mL do extrato bruto de T. cruzi. Controle Negativo (CN) e controle positivo (CP). Os resultados estão representados em média±desvio padrão, e os resultados estatisticamente significativa (**) cujo p value < 0,05 para teste de múltipla comparação (Teste anova-

oneway) e teste de Normalidade (Shapiro-wilk).

Em relação aos extratos brutos das formas epimastigotas de T. cruzi, não houve diferenças significativas na percentagem de hemólise dos eritrócitos previamente sensibilizados e incubados com o sistema complemento ativo e inativado (figura 19). A exceção foi a cepa Dm28c que mostrou diferenças na percentagem de hemólise e presença do sistema complemento ativo. A análise estatística de diferentes cepas mostrou que cepa Y apresenta diferença estatística (p<0,05) em relação a cepa CL Brener e Dm28c. Contudo observou-se semelhança estatística com a cepa Bolívia (figura 19). Os Eh previamente tratados com extratos de Leishmania foram os únicos que sofreram aparentemente a hemólise mediada pelo sistema complemento.

Trypanosoma cruzi desenvolveu diferentes estratégias adaptativas para

evitar a destruição pelo sistema imune do hospedeiro, em particular pelo complemento. No entanto, recentemente, foi demonstrado que esta resistência varia entre as cepas. A formas infeciosas expressam em suas superfícies diferentes proteínas reguladoras do complemento ou capturam-nas do plasma hospedeiro para inibir o sistema do complemento. A maioria dessas proteínas, caso da glicoproteína 58/68 (gp58/68) que têm como objetivo acelerar a aceleração do ciclo, inibindo a formação de C3 convertase. Infelizmente, até o momento não foi possível concluir o papel da ativação do sistema complemento pelo extrato bruto de T. cruzi para as formas epimastigotas do parasito.

A melhor compreensão da biologia e interação parasita-hospedeiro facilitam o desenho de drogas mais eficazes contra a infecção por Leishmania spp. (DE MENEZES et al., 2015) e Trypanosoma (SILVA-JARDIM et al., 2014). Diante disso, estudos futuros poderão contribuir para a busca de novos alvos terapêuticos objetivando a eliminação desses parasitos por meio de pesquisa de novos compostos com potencial inibitório sobre metaloproteases.