As metaloproteases de matriz reconhecem sítios de clivagem da VSG de T bruce

Após a compilação dos dados, foram realizadas sequências de 46 consensos. Foi observado alta conservação de resíduos hidrofóbicos (letras pretas), como valina (V), metionina (M), leucina (L) e isoleucina (I), especificamente na quinta posição, e esta é a localização exata do local de clivagem das MMPs. Além disso, é possível observar alta frequência de resíduos neutros próximos à quinta posição (letras verdes) como mostra a tabela 9 e 10.

Este estudo enfatiza a importância na previsão in silico do local de clivagem da sequência da proteína VGSs por metaloproteases e muitos são locais de clivagem espalhados por toda a sequência. Portanto, foi possível observar que todas as sequências de subespécies do parasito e os dois domínios de VSGs (A e B) mostraram sítios de clivagem para metaloproteases nos primeiros 100 aminoácidos conservados em ordem crescente MMP9> MMP3> MMP2. A predição sugere que pelo menos uma proteína MMP desempenha um papel vital durante a infecção por

Trypanosoma brucei.

Por conseguinte, é possível supor que grande número de sítios de clivagem de proteases pode ser importante para a liberação de VSG e a variação antigênica sofrida por Trypanosoma durante a infecção. Assim, posições conservadas em proteínas em locais de clivagem podem ser uma função significativa nesse mecanismo e tornar acessível a clivagem superficial das VSGs em diferentes tamanhos.

Tabela 7. Sítios de clivagem do domínio A da VSG pela MMPs. Trypanosoma brucei rhodesiense (Tbr),

Trypanosoma brucei gambiense (Tbg) and Trypanosoma brucei brucei (Tbb).

Sequências de VSG – Domínio A Sítios para

MMPs

Consenso dos sítios (WebLogo)

Tbb (85 sequências) MMP2 309 MMP3 372 MMP9 1673 Tbr ( 5 sequências) MMP2 17 MMP3 21 MMP9 98 Tbg (22 sequências) MMP2 58 MMP3 62 MMP9 333

Tabela 8. Sítios de clivagem do domínio B da VSG pela MMPs. Trypanosoma brucei rhodesiense (Tbr),

Trypanosoma brucei gambiense (Tbg) and Trypanosoma brucei brucei (Tbb). Sequencias de VSG – Domínio

B

Sítios para MMPs

Consenso dos sítios de clivagem (WebLogo) Tbb (151 sequências) MMP2 454 MMP3 593 MMP9 2983 Tbr (10 sequências) MMP2 17 MMP3 21 MMP9 98 Tbg (49 sequências) MMP2 145 MMP3 176 MMP9 946

O servidor PROSPER permitiu identificar que as sequências de VSGs têm uma porção conservada e uma posição específica nos locais de clivagem de aminoácidos.

Portanto, a atividade de proteases endógenas parece ser significativa, essencialmente durante a infecção por microrganismos. Estudos anteriores, usando a análise comparativa de sequências VSG, sugerem que, devido a um elemento conservado, a proteína pode ser um alvo adequado contra a tripanossomíase africana (CARRINGTON et al., 1991; SMITH et al., 2004; LUSHER; DE KONING; MARSER, 2007; HORN, 2014).

Cross demonstrou que o revestimento, dos VSGs, pode ser removido uniformemente das células por proteases, como tripsina ou pronase, sem causar alterações na morfologia do parasita. Consequentemente, talvez a atividade proteolítica possa ter um papel no mecanismo de substituição protéica da superfície durante a infecção pelo Trypanosoma brucei (CROSS, 1975).

No entanto, LaCount e colaboradores descreveram três classes de famílias conservadas de metaloproteases de zinco presentes no Trypanosoma brucei (TbMSP-A, -B e -C) como responsáveis pela liberação de moléculas de VSG expressas na superfície dos tripanossomas procíclicos (GRUSZYNSKI et al., 2003; LACOUNT et al., 2003). Todas essas três famílias são expressas em tripanossomas, no estágio da corrente sanguínea, mas apenas o TbMSP-B é encontrado no estágio procíclico. As sequências dos três TbMSP compartilham cerca de 33% de identidade, e a principal diferença está em seus terminais. O TbMSP-A possui uma região C- terminal estendida, rica em serinas e glutamatos, que não foi vista nos outros dois, e termina em um segmento hidrofóbico curto. TbMSP-B tem uma cauda hidrofóbica no terminal C. O TbMSP-C possui uma região C-terminal altamente hidrofílica, rica em aminoácidos e prolina carregados, o que indica que não está ligada a uma membrana via âncora GPI, diferentemente do TbMSP-A e -B (LACOUNT et al., 2003). Além disso, a hidrólise do PLC resulta na conversão da forma de membrana hidrofóbica do VSG (mfVSG) em um VSG solúvel em água (sVSG), resultando na troca do VSG da membrana do parasita (FERGUSON; LOW; CROSS, 1985).

Foi possível observar locais hidrofóbicos nos VSGs como substrato para pelo menos uma metaloproteinase da matriz, proteína MMP-9. Devido ao maior

número de porções reconhecidas em todas as sequências de subespécies de

Trypanosoma brucei, as metaloproteinase da matriz talvez sejam capazes de liberar

o revestimento de VSGs da superfície do parasita. Além disso, as moléculas de VSGs estão disponíveis para interação com outras moléculas, para além de MSPs e PL-C (BOSSAR; GEIGER; 2013). As MMPs poderiam, hipoteticamente, ser uma dessas proteínas e reconhecem os VGSs de superfície como possíveis substrato.

Nos processos fisiológicos, as MMPs regulam a liberação ou ativação de quimiocinas, citocinas, fatores de crescimento e outras moléculas bioativas (GEURTS

et al., 2012). Como os VSGs são antigenicamente distintos, a estrutura conservada é

provavelmente necessária para sua função. Possivelmente, o alto número de locais de clivagem de proteases identificados pelo servidor PROSPER pode ser importante para a liberação do VSG e variação antigênica durante a infecção pelo Trypanosoma

brucei. Assim, as posições conservadas em proteínas, identificadas nos locais de

clivagem, podem ter uma função significativa e acessível à clivagem de superfície por MMPs, em diferentes tamanhos.

Estes resultados juntos com os descritos na literatura sugerem que o mecanismo de liberação do revestimento do VSG de T. brucei pode ocorrer por ocorrer em combinação proteolítica de protease do parasita, a MSP e a PL-C em sinergismo com as metaloprotease do hospedeiro (MMPs).

Algumas perguntas permanecem sem resposta, como: As MPPs podem clivar o VSG diretamente como o mecanismo de liberação de revestimentos VSG durante o fenômeno de variação antigênica? O aumento da expressão de MPPs durante a infecção por Trypanosoma brucei representa um mecanismo de proteção do hospedeiro e/ou um mecanismo de escape do parasita?

Para responder a essas perguntas, os dados previstos pelo servidor PROSPER foram associados à interação entre o parasita e o hospedeiro mamífero, até agora descrito. Baseado em vários estudos, as MMPs representam uma grande família de endopeptidases secretadas ou ligadas à membrana, importantes em muitas

condições fisiológicas e patológicas, incluindo câncer e doenças parasitárias por protozoários (AGRAWAL; LAU; YONG, 2008; GEURTS et al., 2012).

As MMPs desempenham um papel crucial na penetração de leucócitos em doenças de distúrbios cerebrais (ROSENBERG, 2009). Mas o papel durante a infecção por tripanossomatídeos ainda permanece desconhecida, considerando-se os possíveis agonistas parasitários e/ou moléculas do parasita que influenciam a expressão de MMPs e seus inibidores endógenos.

Consistentemente, camundongos infectados com Trypanosoma brucei têm uma alta expressão do nível de mRNA de MMP-3 e MMP-12, seguidos por aumentos significativos de parasitemia (MASOCHA; ROTTENBERG, 2006; GEURTS et al., 2012). Aparentemente, as proteínas VSG do Trypanosoma brucei brucei têm muitas sequências conservadas, que incluem os domínios A e B, que sofreram clivagem por MMPs (tabela 9 e 10) e nossos resultados mostraram um número significativo de locais de clivagem reconhecidos principalmente por MMP-3.

Além disso, no contexto de infecção humana, alguns pacientes no segundo estágio do HAT (estágio neurológico) apresentam aumento na expressão de MMP-2 e MMP-9, correlacionados com a presença de parasitas e leucócitos (GEURTS et al., 2012; MOGK et al., 2014; 2017). No estudo, verificou-se que MMP-2 e MMP-9 reconhecem vários locais de clivagem dos domínios VSG A e B, presentes nas sequências de subespécies de Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma

brucei rhodesiense. De acordo com esse achado, acreditamos que as MMPs possam

estar envolvidas nos mecanismos de troca de VSG e na liberação de VSGs solúveis durante a infecção causada pelo Trypanosoma brucei. Esses dados, juntamente com descritos anteriores.

Aparentemente o T. b. brucei têm muitas sequências que podem sofrer a clivagem por MMPs. tanto no domínio A como domínio B da proteína, como vistos na tabela 9 e 10. As MMPs desempenham um papel crucial para a penetração de leucócitos no cérebro através da clivagem da proteína âncora transmembranar β- distroglicana (AGRAWAL et al., 2008). Durante a infecção em camundongos alta expressão mRNA de MMP 3 e MMP 12 aumenta significativamente a parasitemia (MASOCHA; ROTTENBERG, 2006). Assim, vale ressaltar que o T. b. brucei infeta apenas os animais e os resultados mostraram número significativos de sítios de

clivagem reconhecidos por MMP3, de acordo com a literatura. No entanto a inibição de MMP utilizando antibióticos como as tetraciclinas, minociclina, que inibem tanto a expressão do gene MMP quanto a atividade enzimática, prolongou a sobrevivência dos animais e reduziu o influxo de parasitos e leucócitos no cérebro (MASOCHA; ROTTENBERG, 2006; OLIVERA et al., 2016).

Por outro lado, alguns pacientes no segundo estágio da HAT-encefalopatia os níveis MMP-2 e MMP-9 foram significativamente induzidos (GEURTS et al., 2012; MOGK et al., 2014, 2017). Ambas as gelatinases, MMP-2 e MMP-9 foram identificadas para clivagem do domínio VSG A e B (tabela 9 e 10).

A identificação de sítios de clivagem de VSG poderá auxiliar e desencadear novos estudos de interação entre a proteína do parasita e a do hospedeiro. Deste modo, contribuir no desenho de novos inibidores que afetam principalmente a liberação do VSG. Contudo, é necessário ver com cautela este resultado de modo, a melhorar o desenho de inibidores de proteases.

6.

CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS

O mecanismo de variação antigênica é um fenômeno sofisticado que contribui para a cronicidade de infecções causadas por Trypanosoma brucei. Os tripanossomas manipulam seus hospedeiros pela remodelação da glicoproteína de superfície como uma estratégia para iludir com sucesso o sistema imunológico. As proteínas MSP e PL-C agem sinergicamente como responsáveis pela liberação de VSGs solúveis. Neste estudo, através da análise de toda a sequência de VSGs, as metaloproteinases da matriz reconheceram várias sequências de VSGs de diferentes subespécies de T. brucei. O interesse das MMPs resultou da observação de que, além de seu papel central de manutenção e organização celular, participam nos aspectos patológicos, incluindo infecção por protozoários. Além de sua atividade de degradação de proteínas.

Da mesma forma, o mecanismo de troca de VSGs pela protease do parasita não está totalmente esclarecido. Assim, pretendeu-se analisar as sequências de VSGs e identificar os respetivos sítios de clivagem. Este estudo demonstrou que todas as sequências de VSGs analisadas apresentam locais de clivagem conservados, que poderiam ser substratos para metaloprotease de matriz, como MMP-2, MMP-3 e MMP-9. Trypanosoma brucei apresenta milhares de VSGs de superfície, que hipoteticamente poderiam interagir com a metaloproteinase da matriz. Deste modo, o hospedeiro mamífero pode contribuir na dinâmica da infecção pelo aumento da expressão de MMPs. Contudo, mais estudos biológicos responderão às funções das MMPs no contexto da infecção por T. brucei.