CAPÍTULO I. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E INTERAÇÃO COM SISTEMA COMPLEMENTO DA
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização bioquímica de metaloproteinase presente no extrato bruto
5.1.1. Perfil proteico e zimograma de extrato bruto de tripanosomatídeos
Os tripanosomatídeos integram os protozoários Leishmania spp., T. brucei e T. cruzi na mesma família taxonômica sendo por isso, esperado que apresentem proteínas em comum. Após a manutenção dos parasitas em cultura axénica, durante a fase estacionária, realizou-se a preparação do extrato total de todas as estirpes dos parasitas (Tabela 1). Seguidamente, procedeu-se a caracterização proteica e avaliação da atividade proteolítica utilizando zimografia. O primeiro passo foi a quantificação proteica dos extratos utilizando como a curva padrão (figura S1, em apêndice), a proteína Albumina Sérica Bovina (Bovine Serum Albumin- BSA).
O resultado do perfil proteico do extrato bruto, em gel de poliacrilamida a 10%, corado com nitrato de prata e azul de coomassie (figura S2, apêndice). Os resultados obtidos demostraram a presença da proteína, cujo peso molecular foi de 63 kDa, assim como uma proteína de aproximadamente 50 kDA correspondente à tubulina de Leishmania spp. e T cruzi. Aparentemente, a expressão da proteína gp63, pelo tamanho da banda observada, foi quantitativamente maior nas espécies de
Leishmania spp. (figura S2, apêndice). A partir dos resultados do perfil protéico, foi
feito o ensaio proteolítico dos extratos brutos através do ensaio de zimografia acoplado aos substratos de gelatina e caseína.
Os resultados obtidos pela zimografia demostraram atividade gelatinolítica e caseinolítica em extratos brutos de tripanosomatídeos. As quatro espécies de
Leishmania apresentaram atividade proteolítica mediada por uma enzima de peso
molecular situado entre os 50 kDa e 75 kDa (figura 10A) e entre 75 e 63 kDa (figura 10B). Embora, não nítida foi observada uma banda de atividade proteolítica de aproximadamente 120 kDa, expressa por todas as espécies de Leishmania (na figura 10B).
O estudo prévio realizado por Monteiro, 2015 demostrou a mesma banda correspondente a atividade proteolítica das mesmas espécies de Leishmania, presente no gel de gelatina, colágeno e caseína. Sendo atribuída à forma inativada da gp63, apresentando o pró-peptídeo. Por isso, apresenta maior peso molecular comparativamente, à forma ativa da enzima.
Figura 10. Perfil enzimático em gel de gelatina (A) e caseína (B). Zimograma do gel de poliacrilamida acoplado de gelatina em extratos de Leishmania spp. M – Marcador de peso moleculare; 1- L. shawi, 2 - L. guyanensis, 3 - L. infantum e 4 - L. amazonensis.
Ainda em relação ao extrato bruto de Leishmania foi possível a observação da atividade proteolítica de diferentes espécies do parasita, sugerindo assim, o papel desempenhado por estas proteases, ao longo do ciclo biológico de Leishmania e abundância na forma promastigota metacíclica, a sua presença em todas as espécies demostrando ser uma proteína muito conservada. A espécie L. shawi apresentou uma proteína com atividade de peso molecular de 45 kDa para além da glicoproteína de 63 kDa. Este resultado foi de acordo com observado por MONTEIRO (2015).
É conhecido o papel desempenhado pelas peptidases de parasitas em muitos eventos, incluindo interação com ambos os hospedeiros mamíferos e vetores insetos (ISNARD et al., 2012; MURASE et al., 2018; SIQUEIRA-NETO et al., 2018).
A gp63 sendo a principal proteína de superfície de Leishmania spp. torna- se provável que a atividade gelatinolítica observada entre 50 a 80 kDa, no estudo, corresponda à metaloproteinase, assim como descrito (SCHLAGENHAUF et al., 1998; CUEVAS et al., 2003). Por outro lado, os resultados do perfil eletroforético por meio de SDS-PAGE (figura S2A) corroboram com os resultados proteolíticos do ensaio de zimografia. demostrando uma banda intensa, correspondente a expressão proteica, com peso molecular de 63 kDa.
Em relação ao protozoário T. cruzi, verificou-se atividade proteolítica para as estirpes QMM9, Bolívia, Y, Dm28c e CL Brener no extrato total entre 25 e 45 kDa em gel de gelatina (figura 11A). Em relação as cepas Y, Dm28c e CL Brener observou- se atividade hidrolítica sobre a gelatina sendo a proteína do tamanho de aproximadamente 63 kDa. Atividade proteolítica de semelhante ao peso molecular já foi observada sobre a gelatina e imunoglobulina para as mesmas estirpes de T. cruzi (LOWNDES et al., 1996).
Figura 11. Perfil proteolítico em gel de gelatina (A) e caseína (B). Perfil enzimático de extrato bruto de
T. cruzi para as cepas 1- Y, 2- Bolívia, 3-QMM9, 4-Dm28c e 5- Cl Brener. M – Marcador de peso
molecular (kDa).
A proteína visualizada, cujo tamanho varia entre 25-45 kDa, pode ser a cisteína-protease (MCKERROW et al., 2006) conhecida também por cruzipaína, assim como moléculas semelhantes à calpaína e glicoproteína (72 kDa) que parecem estar envolvidas na interação de T. cruzi e o hospedeiro vertebrado e invertebrado (LOWNDES et al., 1996; CAZZULO, 2002; SIQUEIRA-NETO et al., 2018).
A cisteína protease é a principal protease do protozoário T. cruzi, sendo expressa em todas as etapas do ciclo de vida do parasita. Esta proteína permite a sobrevivência do parasita no interior do hospedeiro e participa na evasão e penetração na célula hospedeira, assim como na digestão de imunoglobulinas (CHOE et al., 2005).
As metalopeptidases de T. cruzi foram as menos estudadas e somente na última década os homólogos, ortólogos e pseudogenes da gp63 foram descritos (REBELLO et al., 2019). A heterogeneidade de T. cruzi representa um desafio para o estudo desta família de genes-gp63. Em 2003, CUEVAS e colaboradores identificaram vários grupos de genes e pseudogenes com múltiplos membros em cada, onde agruparam em Tcgp63-I a III (CUEVAS et al., 2003). O grupo Tcgp63-I existe pelo menos quatro RNAm de gp63 com regulação nas diferentes fases de desenvolvimento do parasita, mais abundante em amastigotas, do que em epimastigotas ou tripomastigotas (GRANDGENETT et al., 2000).
O número de genes não necessariamente implica detecção a nível proteico. Embora, menos abundante Tcgp63-I é detectável a nível proteico e apresenta níveis expressivos de RNAm, em todos os estágios de desenvolvimento da linhagem CL Brener. Neste estudo, foi possível observar a expressão de gp63 através da atividade do extrato Y (TcII) e CL-Brener (TcVI) demostrada no gel de gelatina (63kDa). Entretanto, existem relatos na literatura que mostram que diferenças no estado de glicosilação da proteína são responsáveis pelos diferentes pesos moleculares em gel de poliacrilamida (GONZÁLEZ-ASEGUINOLAZA et al., 1997).
Neste estudo, não foi possível observar a atividade proteolítica de T. cruzi sobre caseína (figura 11B) e também não verificamos a atividade correspondente a gp63 no extrato bruto da cepa Dm28c, contrariamente ao observado por MONTEIRO (2015); LOWNDES et al., (1996) e REBELLO et al., (2019). Entretanto a metodologia utilizada não foi semelhante, tendo sido utilizado gel de caseína comercial, no estudo de Monteiro (2015).
Em relação a cepa Dm28c, as condições favoráveis para as metalopeptidases foram em pH ácido ( SANTOS et al., 2006; REBELLO et al., 2019). O extrato bruto de Dm28c que apresentou um perfil protéico em pH básico e o gel de caseína foi preparado utilizando protocolo caseiro, e como tal, encontra-se em fase
de otimização. Assim, espera-se futuramente obter os resultados em concordância ou não com aos descritos até então na literatura.
Contrariamente do protozoário T. cruzi, a gp63 é bem descrita em
Leishmania spp. ( YAO, 2010; SHAPIRA; ZINOVIEV, 2011; MURASE et al., 2018). A
proteína foi identificada como uma metaloproteinase neutra e com atividade em uma ampla faixa de pH, variando entre 6-9 ( SCHLAGENHAUF et al., 1998; BIANCHINI et
al., 2006). Diante disso, foi realizado a zimografia de duas dimensões (2D) do extrato
bruto das espécies L. amazonensis, L. infantum e L. sawi, e T. cruzi (Y), no Instituto de Pasteur de Montevideo. Foi foi observado mesmo perfil proteolítico para o extrato bruto de L. infantum, L. amazonensis e T. cruzi (Y). Entretanto, apenas o gel referente ao extrato de L. infantum, apresentou a focagem do ponto isoelétrico na faixa de pH ácido. Por outro lado, a espécie L. shawi demostrou perfil proteolítico (2D) no pH básico.
No que concerne à atividade enzimática de extratos de T. b. brucei, não foi possível concluir os dados. Contudo, o protozoário apresenta uma proteína com atividade proteolítica de aproximadamente 25 kDa descrita pelo nosso grupo de investigação (DE SOUSA et al., 2010). O ensaio de zimografia confirmou a atividade proteolítica do extrato bruto dos tripanosomatídeos e um padrão complexo de expressão de protease, com considerável variabilidade entre as estirpes e formas epimastigotas de T. cruzi, assim como observado em promastigotas de Leishmania. Uma vez que os resultados dos extratos de Leishmania corroboram com os dados da literatura, pode supor-se que trata-se da protease principal, a gp63. A identificação da protease a partir do zimograma não foi possível utilizando métodos clássicos como MALDI-TOF, sendo assim, procurou-se alternativas para auxiliar a identificação da principal protease, presente no extrato bruto.