Animaux

5.1.1. Rats

Les animaux utilisés sont des rats mâles de souche Long Evans pesant entre 250 et 350 grammes au moment des expériences. Ils ont été quotidiennement manipulés durant les quinze jours précédant la chirurgie.

Les rats sont hébergés dans des cages individuelles (40 x 26 x 16 cm de hauteur), dans une pièce tempérée (20° ± 2°) avec un cycle jour/nuit positif de 12/12h. Les animaux ont accès à l’eau et la nourriture ad libitum.

5.1.2. Souris

Afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent les processus de plasticité et de mémoire, et en particulier afin de comprendre l’implication du gène immédiat précoce zif268 dans ces mécanismes, j’ai réalisé des enregistrements unitaires pour analyser les propriétés de décharge des cellules de lieu de l’hippocampe chez des souris génétiquement modifiées pour le gène zif268.

Avec l’avancée rapide des progrès dans le domaine de la génétique, il est de plus en plus fréquent dans le domaine des neurosciences d’utiliser des animaux génétiquement modifiés, porteurs d’une mutation sur un gène, afin de tester l’implication du gène muté et de ses sous produits dans différents processus fonctionnels. Il existe différents types de souris génétiquement modifiées permettant d’étudier de façon ciblée un gène ou une fonction cellulaire.

Par exemple, les souris « knock-in » (ou souris transgéniques), sont des animaux chez lesquels on insère une ou plusieurs copies d’un gène afin d’en augmenter l’expression. Les produits de ce gène peuvent être activateurs et entraîner par exemple l’augmentation du nombre de sous-unités d’un récepteur (Okabe et al., 1998 ; Tang et al., 1999) ou bien répresseurs pour inactiver un processus cellulaire comme par exemple l’expression d’inhibiteur de la protéine kinase C (PKC) (De Zeeuw et al., 1998). L’insertion de gènes permet aussi de marquer l’expression génique ou protéique. Le plus couramment utilisé est le gène lacZ qui code pour la ß-galactosidase dont la présence est facilement détectable en présence de X-Gal ou d’anticorps fluorescents. Par exemple, inséré en liaison avec des séquences CRE, lacZ permet de marquer les circuits neuronaux où une activation des sites CRE a lieu lors de l’apprentissage (Impey et al., 1996).

Un autre moyen d’étudier la fonction du gène, et certainement le plus utilisé, est de l’invalider par la création de souris « knock-out » (KO). Il existe plusieurs types de souris K.O. Le premier type, standard, consiste à invalider le gène de façon irréversible et de manière non sélective vis à vis d’un organe ou d’un type cellulaire donné. Dans ce cas les animaux naissent par exemple sans que le gène ne soit présent dans aucune région du cerveau (exemple de nos souris KO pour le gène zif268). Un autre type de souris permet d’obtenir une spécificité pour des régions tissulaires. Grâce à l’utilisation de promoteurs spécifiques, on peut invalider un gène dans la partie où le promoteur est sélectivement exprimé (système CRE-LoxP), comme cela a été fait dans l’équipe de Susumu Tonegawa pour invalider le gène codant la sous-unité NR1 des récepteurs NMDA dans la région CA1 spécifique (Tsien et al., 1996) , ou plus récemment dans le gyrus denté de l’hippocampe (McHugh et al., 2007).

Enfin un troisième type de manipulation de gène consiste à contrôler temporellement l’initiation de l’expression du gène d’intérêt (K.O. inductibles).

Dans ce cas, l’invalidation du gène va dépendre de l’administration d’un facteur exogène (par exemple, tétracycline donnée dans la nourriture), qui permettra d’induire la transcription, ce qui permet un contrôle temporel précis (Mills, 2001;

Schonig et Bujard, 2003).

Les techniques de manipulations génétiques conditionnelles, permettant le contrôle du gène d’intérêt spatialement et temporellement, peuvent être combinées, ce qui permet de cibler à la fois la délétion à un endroit précis du cerveau (jusqu’à une sous région comme CA1 ou CA3), et le moment désiré, ce qui permet un degré de précision très important.

Les souris zif268

Les souris mutantes pour le gène zif268 ont été générées par le groupe de Patrick Charnay (Topilko et al., 1998). La construction des souris zif268 a été effectuée par l’injection de cellules zif268^+/+ ES dérivées de la souche 129/SV dans des blastocystes de souche C57Bl/6J pour obtenir des mâles chimères, qui ont ensuite été croisés avec des femelles C57Bl/6J. Le vecteur contenu dans les cellules ES contient le gène codant pour zif268 avec une mutation au niveau du site unique Ndel localisé au début de la séquence codant pour le premier doigt de zinc, ainsi que l’addition d’une neo-LacZ entre le promoteur et la région initiatrice du gène zif268. L’hybridation in situ confirme l’absence complète de zif268 chez les souris mutantes homozygotes (zif268^-/-). En outre, l’expression constitutive et induite par la PLT du gène LacZ est comparable à celle du gène zif268 chez les souris contrôles, ce qui suggère que la cascade de signalisation en amont de la

transcription du gène zif268 n’est pas affectée. Bien qu’ayant un poids normal à la naissance, les animaux homozygotes zif268^-/- présentent une courbe de croissance plus lente que celle des animaux sauvages de la même portée, pour se stabiliser à l’âge adulte à un poids globalement inférieur de 20 % au poids normal. Les souris zif268^-/-, aussi bien mâles que femelles, sont stériles. Les mâles ne montrent pas un comportement sexuel caractéristique comme l’agressivité envers les autres mâles et les femelles n’ont pas d’œstrus. Des études ont montré que l’anatomie générale du système nerveux, la transmission synaptique basale dans l’hippocampe, l’excitabilité cellulaire, le comportement général ainsi que l’activité motrice des souris zif268^-/- ne diffèrent pas des souris contrôles. Lors des expériences, je n’ai utilisé que de souris homozygotes zif268^-/- mâles et leur équivalent sauvage zif268^+/+ élevé dans les mêmes conditions.

Hébergement des souris KO

Les animaux sont nés à l’animalerie transgénique d’élevage d’Orsay (n° agrément A 91-471-104). Les souris sont arrivées déjà adultes, à l’âge de trois mois à Marseille et ont été hébergées dans l’animalerie transgénique du pôle 3C (n°

agrément A 13-055-25). Les souris sont logées dans des cages individuelles (36 x 20 x 14 cm de hauteur) disposées dans des armoires tempérées (20° ± 2°) avec un contrôle de l’hygrométrie et un cycle jour/nuit positif de 12/12h. Les animaux ont accès à l’eau et la nourriture ad libitum.

A leur arrivée au laboratoire, les souris zif268 ont été maintenues dans le nouvel environnement de l’animalerie pendant un mois pour une bonne acclimatation et ont été manipulées régulièrement quinze jours avant le début des expériences.

Toutes les précautions concernant l’hébergement et les manipulations des rats et des souris ont été prises en respect avec le NIH (NIH publication n° 86-23, revised 1987) et avec les directives européennes sur l’éthique dans l’expérimentation animale (European Community Council Directive november 24, 1986, 86/609/EEC) et avec les directives françaises (Conseil n° 87848 de Direction des Services Vétérinaires de la Santé et de la Protection Animale permission n°13.24 du ministère de l’Agriculture et de la Pêche).