Effet de PM25 sur la dormance - Phénotypage physiologique des mutants pm25

Partie 3: Analyses physiologiques de mutants d’insertion tnt1 de

3.2 Phénotypage physiologique des mutants pm25

3.2.2 Effet de PM25 sur la dormance

Les graines de Medicago truncatula sur lesquelles nous travaillons appartiennent au génotype R108. Or, les graines issues de ce génotype présentent une dormance. La dormance se définit par l’incapacité de la graine à germer même lorsque celle-ci se trouve dans des conditions favorables (Bewley, 1997; Finch-Savage et Leubner- Metzger, 2006). Chez M.truncatula, celle-ci s’acquière à partir d’environ 30 JAP (Gallardo et al., 2006) et est déjà visible dans la figure 3.3. En effet, les graines non dormantes sont connues pour germer après 20 h d’imbibition (Julie Boudet, thèse, 2006) alors qu’il faut attendre cinq jours ici avant de voir les premières graines germer (Figure 3.3). La dormance va être progressivement levée au cours de la post- maturation à sec (after-ripening). Cette levée de dormance est obtenue en quelques mois pour le génotype R108 (Julia Buitink, communication personnelle). Il a été supposé que certaines protéines LEA pourraient être impliquées dans le maintien de la dormance, leur taux étant corrélé au maintien ou à la disparition de celle-ci (Li et Foley, 1995; Bailey et al., 1996). Or, PM25 apparaît pendant la maturation de la

Figure 3.4 : Courbes de germination de graines dormantes de M.truncatula et perte de la dormance en fonction du temps de post-maturation

En A, 80 graines présentant la mutation ou non pour PM25 sont mises à germer dans l’eau, à 23°C, à la lumière continue immédiatement après récolte. Les plantes D23, DR108 expriment PM25, les plantes D17, D19, D20, D30 sont des mutants pm25-1 ne l’exprimant plus. Des graines de R108 conservées pendant 3 mois, (NDR108) sont également testées dans les mêmes conditions. En B, l’évolution du temps mis pour obtenir 50 % de germination (t50) de graines déficientes (symbole ouvert) et non déficientes (symbole fermé) en PM25 en fonction du temps de post-maturation à sec. Les mesures sont effectuées sur 80 graines à 23°C et en lumière 24h/24. La courbe pleine représente l’évolution de la perte de dormance pour les graines sauvages dormante DR108 et les graines pm25⁺, les courbes en pointillés l’évolution pour les graines mutantes pm25^-.

Figure 3.5 : Courbes de germination de graines de M.truncatula en présence de fluridone 20 µM 40 graines déficientes (symboles ouvert) ou non (symbole fermé) pour PM25sont imbibées en absence (figure A) ou en présence de fluridone 20 µM (figure B), inhibiteur de la synthèse d’ABA. Le pourcentage de germination est suivi en fonction du temps à l’obscurité et à 20°C. LSD : Least Significant Difference

Jours d'imbibition

0 20 40 60 80 100

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D19 D17 D20 D30 NDR108

Temps de post-maturation (mois)

0 1 2 3

t50 (jours)

0 10 20 30 40 50

60 DR108

D23 D19 D20 D30

A B

Jours d'imbibition

0 20 40 60 80 100

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D19 D17 D20 D30 NDR108

Temps de post-maturation (mois)

0 1 2 3

t50 (jours)

0 10 20 30 40 50

60 DR108

D23 D19 D20 D30

A B

Heures d'imbibition

0 50 100 150 200 250

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D17 D19 D20 D30

Heures d'imbibition

0 50 100 150 200 250

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D17 D19 D20 D30

LSD

Heures d'imbibition

0 50 100 150 200 250

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D17 D19 D20 D30

Heures d'imbibition

0 50 100 150 200 250

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D17 D19 D20 D30

B Heures d'imbibition

0 50 100 150 200 250

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D17 D19 D20 D30

Heures d'imbibition

0 50 100 150 200 250

Germination (%)

0 20 40 60 80 100

DR108 D23 D17 D19 D20 D30

LSD

graine en concomitance avec l’augmentation de la dormance (Boudet et al. 2006).

Nous avons donc testé l’hypothèse selon laquelle PM25 serait impliquée dans la dormance des graines.

Nous avons comparé la germination de graines de deux lignées présentant le phénotype Pm25⁺ (wt et mutant Tnt1 Pm25⁺²³) et de 4 lignées présentant le phénotype Pm25^- immédiatement après la récolte des gousses, c’est à dire n’ayant pas subit de post-maturation. Tous les tests ont été effectués uniquement sur l’allèle PM25-1. Les graines sont misent à germer dans des conditions identifiées comme favorisant la mise en évidence de la dormance : 23°C et lumière blanche 24h/24. Les graines sont scarifiées afin de s’affranchir de toute dormance tégumentaire et d’obtenir une imbibition homogène de toutes les graines. Nous pouvons voir sur la figure 3.4A qu’une dizaine de jours sont nécessaires pour que les premières graines de R108 fraîchement récoltées commencent à germer alors qu’il ne faut que quelques heures (environ 20h) pour que les graines ayant été stockée pendant 3 mois germent (R108ND). Lorsque nous observons les courbes de germination obtenues pour les mutants Tnt1 présentant le phénotype Pm25^-, aucune différence significative n’est visible par rapport aux courbes obtenues pour les graines Pm25⁺. En effet, le début de la germination commence dans les deux cas, 10 jours après le semis, et suit la même cinétique que les graines sauvages. Il ne semble donc pas y avoir de différences entre les niveaux de dormance des graines sauvages et mutantes à la récolte.

Nous avons voulu ensuite déterminer si PM25 pouvait influencer la levée de dormance pendant la post-maturation à sec. Pour cela, des graines fraîchement récoltées ont été stockées à température ambiante. Après 1 et 3 mois de stockage, elles sont imbibées à la lumière. A partir des courbes de germination (données non présentées), nous avons calculé le T50, qui est le temps nécessaire pour obtenir 50 % de germination. Chez les graines sauvages et celles de la lignée 23 présentant le phénotype Pm25⁺, la dormance est levée progressivement puisque le T50 est d’environ 20 jours juste après récolte et atteint environ 24 h après 3 mois de stockage, même si on relève un point aberrant à un mois de stockage pour les graines de la lignée 23 (Figure 3.4B). Les graines au phénotype Pm25^- ne semblent pas se comporter de manière significativement différente par rapport au phénotype PM25⁺.

Figure 3.6 : Taux finaux de germination de M.truncatula avant et après un vieillissement accéléré

3 lots de 40 graines Pm25^-, PM25⁺ et sauvage R108 de M.truncatula sont stockés pendant 0 (A), 14 (B) ou 21 jours (C) à 35°C et 75 % d’humidité relative, puis, mis à germer dans l’eau à 20°C et à l’obscurité. Les taux finaux de germination sont déterminés. Les barres d’erreurs représentent la moyenne des 3 réplicats biologiques.

Figure 3.7 : Taux finaux de germination de M.truncatula en absence ou en présence de NaCl 60 mM 3 lots de 25 graines de M.truncatula pour chaque individu sont mis à imbiber dans l’eau ou dans une solution de NaCl 60 mM à 20°C et à l’obscurité. Les taux finaux de germination sont déterminés. Les barres d’erreurs représentent la moyenne des 3 réplicats biologiques.

A B