Partie 2 Caractérisation fonctionnelle de PM25
2.1 Effet de PM25 sur la protection de l’ADN et la survie bactérienne lors de stress
2.1.1 Effet de PM25 sur la conformation de l’ADN
En dichroïsme circulaire, l’amplitude et la position du spectre entre 250 et 300 nm nous renseignent sur la conformation de l’ADN. Dans cette région PM25 n’absorbe pas de manière significative, nous n’avons donc pas d’interférences avec le signal obtenu pour l’ADN. Les caractéristiques des pics obtenus et leurs amplitudes vont dépendre du milieu (eau, ethanol, sels), mais également de la composition en bases de l’ADN (pour revue (Kypr et al., 2009)). Pour l’ADN de thymus de veau, la forme B présente typiquement un pic de faible amplitude aux alentour de 285 nm, tandis que la forme A présente un pic de forte amplitude aux alentour de 270 nm. Les spectres ici présentés sont obtenus pour de l’ADN de thymus de veau seul dans un tampon NaPO4 1 mM ; EDTA 0,1 mM, pH 7, puis en présence de PM25 ou de BSA qui est utilisée comme protéine témoin dans le même tampon (Figure 2.2). Le spectre de l’ADN seul présente un pic de faible amplitude qui est centré à 288 nm indiquant qu’il se trouve sous conformation B. Lorsque PM25 est ajoutée à la solution (ratio massique 1 :1), le pic montre un glissement à 285 nm et une augmentation de son amplitude de 4000 à 10000. deg.cm2dmol-1, ce qui pourrait indiquer un changement de conformation de l’ADN. Cependant, la modification du spectre obtenu est très inférieure à celle généralement observée dans le cas d’un changement avéré de conformation vers la forme A qui devrait montré un glissement plus important aux alentour de 270 nm ainsi qu’une plus forte augmentation d’amplitude (Nejedlý et al., 2005; Nejedlý et al., 2007). Par ailleurs, lorsque la BSA est ajoutée dans le même rapport massique, le profil du spectre obtenu est tout à fait similaire à celui en présence de PM25. Il ne semble donc pas y avoir d’effet spécifique de PM25 sur la conformation de l’ADN.
2.1.2 Protection contre les UV
Par analogie avec les SASP, nous avons testé si la surexpression de PM25 chez Escherichia coli engendrait une résistance accrue de ces bactéries face à un stress
900mJ.cm-2
Temps (heures)
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
50mJ.cm-2
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
0 mJ.cm-2
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
PM25 fI I
25 kDa 37 kDa
B A R
C
D 900mJ.cm-2
Temps (heures)
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
50mJ.cm-2
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
0 mJ.cm-2
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
PM25 fI I
25 kDa 37 kDa
B A R
C
D
50mJ.cm-2
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
0 mJ.cm-2
0 5 10 15 20 25
DO600nm
0 1 2 3 4
R fI I
PM25 fI I
25 kDa 37 kDa
R
PM25 fI I
25 kDa 37 kDa
B A R
C
D
Figure 2.3: Taux de PM25 déterminé en western blot pour les bactéries faiblement induite, induite et réprimé (A) et effet de stress UV (B , C, D) sur des bactéries surexprimant ou non PM25
L’expression de PM25 est réprimée en présence de glucose (R), induite faiblement (fI) en absence d’inducteur ou de répresseur, ou fortement (I) en présence de L-arabinose chez E.Coli. En A : Le taux de PM25 pour les 3 niveaux d’expression est vérifié en western blot. En B, C, D : les bactéries sont soumises à différentes doses d’UV, 0, 50 et 900 mJ.cm-2 puis remises en culture dans du LB liquide.
La reprise de la croissance bactérienne est suivie au cours du temps par mesure de la DO à 600 nm.
UV. Nous avons utilisé la souche BL21-AI de E coli transformée avec le plasmide pDEST17 contenant la séquence codant pour PM25. Les taux d’expression de PM25 dans les bactéries sont vérifiés par western blot (2.3 A). L’expression de PM25 est induite par le L-arabinose et réprimée par le glucose (Fig. 2.3.A). De plus, elle est également faiblement induite en absence de ces deux sucres (Fig 2.3.A). Nous avons mis à profit cette observation en incluant dans nos essais des bactéries contenant une faible teneur en PM25. Ceci nous permettant de mettre en évidence un éventuel effet dose-réponse.
Les bactéries transformées ont été soumises à des rayonnements UV à des doses énergétiques de 50 et 900 mJ.cm-2. Après exposition, la reprise de la croissance est suivie par mesure de la DO à 600 nm en fonction du temps en milieu LB liquide. En absence de stress, lorsque PM25 est faiblement induit, la courbe de croissance bactérienne présente le même profil que lorsque PM25 n’est pas exprimé. En revanche, les bactéries surexprimant plus fortement PM25 présentent un retard de croissance allant jusqu’à environ 5 heures. Lorsque les bactéries subissent des rayonnements UV de 50 mJ et 900 mJ/cm2, les bactéries n’exprimant pas PM25 présentent un retard de croissance de 1 et 3 h respectivement par rapport au témoin (Figure 2.3 B-D). Suite aux stress UV, la présence d’une faible concentration en PM25 ne provoque pas de différence significative dans la reprise de croissance par rapport aux bactéries pour lesquelles l’expression du gène est réprimée. Les courbes se superposent parfaitement. En présence d’une forte concentration de PM25, les bactéries ne semblent pas être avantagée puisque elle accuse un retard de croissance, par rapport aux bactéries réprimées ou faiblement induites pour PM25, similaire à celui observé en l’absence de stress pour les deux intensités de rayonnement UV.
Ainsi, il apparaît que PM25 ne semble pas conférer un avantage pour les bactéries face à un stress UV. Une forte concentration de la protéine apparaît même pénalisante pour la croissance bactérienne.
2.1.3 Protection contre la dessiccation
Nous avons ensuite testé si la présence de PM25 chez E.coli leur conférait un avantage sélectif en cas de dessiccation, un stress plus approprié dans le cadre de ce travail. Ainsi, nous avons testé l’effet du séchage sur des suspensions bactériennes
Figure 2.4: Croissance bactérienne après séchage
PM25 est réprimé en présence de glucose ou faiblement induit en absence du répresseur chez E.Coli. Les bactéries sont ensuite séchées pendant 7 jours à 43 % d’humidité relative puis remisent en culture dans du LB. Le taux de survie bactérien est évalué par comptage sur boite en CFU. Le pourcentage de survie bactérienne est ensuite évalué par rapport aux CFU avant séchage. Les barres d’erreurs représentent les écarts-types déterminés sur la moyenne de 3 réplicats biologiques.
Réprimé Faiblement induit
Pourcentage de survie bactérienne
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
Réprimé Faiblement induit
Pourcentage de survie bactérienne
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
présentant une faible teneur en PM25 étant donné que nous avons pu montrer qu’une forte induction était néfaste à une croissance optimale (figure 2.3 B). Des culots bactériens amenées à une DO(600nm) de 1,2 ont été séchés pendant 7 jours à 75 % ou 43 % d’humidité relative (HR), permettant de tester un effet éventuel de PM25 en relation avec sa capacité de rétention en eau à ces deux valeurs d’humidité relative (Cf. figure 9). Les bactéries séchées sont ensuite réhydratées délicatement en milieu LB liquide puis une dilution sériée est effectuée afin de déterminer les quantités de CFU (Colony-Forming Unit) sur milieu LB solide. Après dessiccation à 43 % d’HR, les bactéries n’exprimant pas PM25 présentent un très faible taux de survie, de l’ordre de 0.6 % par rapport aux bactéries non séchées (figure 2.4). En présence de PM25 la tolérance à la dessiccation des bactéries n’est pas améliorée, le taux de survie étant similaire à celui observé en absence de la protéine. Les résultats obtenus pour un séchage à 75 % HR sont similaires (données non montrées). PM25 ne semble donc pas améliorer la survie bactérienne lors de la dessiccation