Partie 3: Analyses physiologiques de mutants d’insertion tnt1 de
3.3 Phénotypage biochimique
3.3.3 Teneur en sucres solubles
N’ayant pu mettre en évidence de différences dans les constituants principaux de la graine, nous avons ensuite tester l’hypothèse selon laquelle la différence de masse pourrait être provoquée par un retard dans la maturation de la graine. Pour ce faire, nous avons mesuré les teneurs en sucres solubles, glucose, saccharose et oligosaccharides de la famille des RFOs présents dans la graine à 28 JAP et à maturité. En effet, la teneur en saccharose et oligosaccharides de la famille des RFOs et, plus particulièrement le rapport des teneurs Sac/RFO sont considérés comme des
Figure 3.14 : Teneurs en sucres solubles de graines 28 JAP de M.truncatula
Les teneurs en sucres solubles, glucose (A,B) ; saccharose (C,D) ; raffinose (E,F) ; stachyose (G,H) de graines immatures âgées de 28 JAP de M.truncatula sont déterminées sur 3 lots de 15 graines pour l’allèle pm25-1 (1) (A, C, E, G) et sur 3 lots de 10 graines pour les 2 autres allèles (2 et 3) (B, D, F, H) par dosage Dionex. Les écarts-types sont déterminés sur trois réplicats techniques pour chaque répétition biologique. Les groupes a et b identifient les valeurs
stachyose
teneur en stachyose en µg/mg de MS
0 10 20 30 40 50 60
raffinose
teneur en raffinose en µg/mg de MS
0 2 4 6 8 10
saccharose
Teneur en sucrose en µg/mg de MS
0 10 20 30 40 50 60 70
glucose
teneur en glucose en µg/mg de MS
0 2 4 6 8 10
a
2008 2009 2008 2009
2008 2009 2008 2009
a b
1 3 2 1 3 2
1 3 2 1 3 2
: Pm25- : Pm25+
a
A B C D
E F G H
b
b b
b b
b b b
stachyose
teneur en stachyose en µg/mg de MS
0 10 20 30 40 50 60
raffinose
teneur en raffinose en µg/mg de MS
0 2 4 6 8 10
saccharose
Teneur en sucrose en µg/mg de MS
0 10 20 30 40 50 60 70
glucose
teneur en glucose en µg/mg de MS
0 2 4 6 8 10
a
2008 2009 2008 2009
2008 2009 2008 2009
a b
1 3 2 1 3 2
1 3 2 1 3 2
: Pm25- : Pm25+
a
A B C D
E F G H
b
b b
b b
b b b
Figure 3.13 : Voies de biosynthèse des RFOs dans les semences de légumineuses
Figure 3.15 : Teneurs en sucres solubles de graines matures de M.truncatula
Les teneurs en sucres solubles, glucose (A,B) ; saccharose (C,D) ; raffinose (E,F) ; stachyose (G,H) et verbascose (I, J)de graines matures de M.truncatula sont déterminées sur 3X15 graines pour l’allèle pm25-1 (1) (A, C, E, G, I) et sur 3X15 graines pour les 2 autres allèles (2 et 3) (B, D, F, H, J) par dosage Dionex. Les écarts-types sont déterminés sur trois réplicats techniques pour chaque répétition biologique. Les groupes a et b identifient les valeurs présentant des différences statistiques après un test Anova p<0.05.
verbascose
Teneur en verbascose en µg/mg de MS
0 1 2 3 4 5
a b
2008 2009
1 3 2
verbascose
Teneur en verbascose en µg/mg de MS
0 1 2 3 4 5
a b
2008 2009
1 3 2
stachyose
Teneur en stachyose en µg/mg de MS
0 10 20 30 40 50 60
raffinose
Teneur en raffinose en µg/mg de MS
0 1 2 3 4 5
saccharose
Teneur en sucrose en µg/mg de MS
0 2 4 6 8 10
glucose
Teneur en glucose en µg/mg de MS
0 1 2 3 4
5 2008 2009 2008 2009
2008 2009
1 3 2 1 3 2
1 3 2 1 3 2
: Pm25- : Pm25+
a a
b b
stachyose
Teneur en stachyose en µg/mg de MS
0 10 20 30 40 50 60
raffinose
Teneur en raffinose en µg/mg de MS
0 1 2 3 4 5
saccharose
Teneur en sucrose en µg/mg de MS
0 2 4 6 8 10
glucose
Teneur en glucose en µg/mg de MS
0 1 2 3 4
5 2008 2009 2008 2009
2008 2009
1 3 2 1 3 2
1 3 2 1 3 2
: Pm25- : Pm25+
a a
b b
A B C D
E F G H
A B C D
E F G H
I J
I J
a b
indices du stade de maturation et de la qualité des graines (Bailly et al., 2001). Par ailleurs, chez le soja il a pu être montré un lien entre l’accumulation de stachyose et l’acquisition de la tolérance à la dessiccation (Blackman et al., 1992; Sinniah et al., 1998). Les RFOs s’accumulent selon la voie de biosynthèse présentée figure 3.13.
Dans la Figure 3.14, nous observons, dans les graines sauvages à 28 JAP, que le sucre majoritaire est le saccharose, avec environ 40 µg/mg de MS (matière sèche), suivi du stachyose, avec environ 20 µg/mg de MS ; le glucose et le raffinose sont moins abondant, avec environ 4 µg/mg de MS. Pour la récolte 2008, aucune différence significative de teneurs pour les sucres solubles testés n’apparaît entre les graines mutantes appartenant au phénotype Pm25- par rapport aux graines Pm25+. Pour la récolte 2009, les graines sauvages présentent une accumulation de saccharose significativement plus importante que les graines déficientes, mais elles ont moins de raffinose et moins de stachyose, ce qui pourrait indiquer un retard de maturation puisque les sucres de fin de voie de biosynthèse sont moins représentés, et donc une maturation plus précoces des graines pm25-.
En ce qui concerne l’évolution des teneurs en sucres solubles dans les graines sèches (Figure 3.15), nous constatons chez les graines sauvages que le sucre majoritaire est devenu le stachyose (environ 60 µg/mg de MS) dont le taux a été multiplié par 3 par rapport aux graines 28 JAP. Le taux de saccharose à fortement diminué par rapport aux graines 28 JAP puisqu’il n’est plus que d’environ 6µg/mg de MS, les teneurs ont donc été divisé par 7. Le taux de raffinose a également été réduit, environ 2 fois, et le glucose est devenu très minoritaire. Un nouveau sucre est apparu, le verbascose qui est situé plus en aval de la fin de la voie de biosynthèse des sucres par rapport aux autre sucres cités précédemment, (environ 1µg/mg de MS).
Lorsque les teneurs en sucres entre les graines sauvages et déficientes en PM25 sont comparées, nous n’observons aucune différence pour la récolte 2008, seule la récolte 2009 montre des différences entre les graines PM25+ et PM25- avec des teneurs supérieures en saccharose et en verbascose pour les graines sauvages.
Il n’apparaît donc pas clairement de lien entre l’absence de PM25 et une variation des teneurs en sucres, que ce soit en quantité ou en qualité. Nous pouvons remarquer que les teneurs en sucres dans les plantes sauvages ont peu évolué d’une
Figure 3.17 : Expression de PM25 et de ses homologues chez M.truncatula dans les graines 28 jours après pollinisation
L’expression relative de PM25 et des différents homologues (± écart type, sur trois réplicats techniques) est suivie par RT-QPCR. Toutes les données sont comparées par rapport à l’expression dans les graines sèches. Toutes les données sont normalisées par rapport à Msc27. Les expressions relatives sont mesurées par calcul du 2-∆∆CT. La barre noire représente le seuil de significativité.
Figure 3.16 : Arbre phylogénétique des membres du groupe des D-34 chez M.truncatula
Les numéros de TC indiquent les homologies de séquence retrouvées dans la banque EST TIGR de Medicago (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/mta1/) pour les différents gènes. L’arbre phylogénétique est obtenu au moyen du logiciel Tree View (Page, 1996)
2-∆∆CT
0 5 10 15 20 25 30
PM25 D34a D34b D34c PM24 ECP31
2-∆∆CT
0 5 10 15 20 25 30
PM25 D34a D34b D34c PM24 ECP31
D34b (TC117045)
ECP31 (TC128648)
D34c (TC135172)
D34a (TC133491)
PM25 (TC115138)
PM24 (TC125472) 0.1
D34b (TC117045)
ECP31 (TC128648)
D34c (TC135172)
D34a (TC133491)
PM25 (TC115138)
PM24 (TC125472) 0.1
année de récolte sur l’autre, ce qui indique que nos mesures sont fiables et qu’il ne semble pas y avoir d’effet récolte.
3.4 Etude de l’expression des homologues de PM25 au cours de la