Effet de PM25 sur la prévention de l’agrégation protéique

dans l’eau (figure 2.9 B). Par ailleurs, cet effet n’est pas retrouvé en présence de EM6 dans les mêmes proportions. Comme pour la CS, l’effet protecteur de PM25 est beaucoup plus limité que pendant la congélation cependant il reste spécifique puisqu’il n’est pas observé en présence de BSA ou de EM6.

Figure 2.10 : Effet de l’ajout de PM25 sur l’agrégation avant dialyse et congélation

Nous mesurons l’agrégation des protéines par mesure de la DO à 340/280 nm avant dialyse puis nous ajoutons PM25 en proportion 2 :1 en ratio massique PM25 : protéine. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type calculé pour 3 réplicats. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05

Figure 2.11 : Evolution de l’agrégation de protéines solubles en fonction du nombre de cycles de congélation

L’agrégation de protéines solubles de radicules de M.truncatula est suivie après 2 ou 8 cycles de congélation/décongélation en présence ou en l’absence de PM25 rapport massique 1 :1 ou 2 :1 PM25 : protéine soluble. En A, l’agrégation est suivie par mesure de la DO à 340/280. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type calculé pour 3 réplicats. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05. En B l’agrégation est suivie sur gel coloré en bleu colloïdale après centrifugation des échantillons et séparation des fractions culot/surnageant.

DO 340/280

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

PM25 - +

a a

DO 340/280

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

PM25 - +

a a

C S C S C S

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

H2O PM25 1:1 PM25 2:1

2 décongélations 8 décongélations

H₂O PM25

1:1

PM25 2:1

A B

a

b c

a

b b

C S C S C S

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

H2O PM25 1:1 PM25 2:1

2 décongélations 8 décongélations

H₂O PM25

1:1

PM25 2:1

A B

a

b c

a

b b

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

H2O PM25 1:1 PM25 2:1

2 décongélations 8 décongélations

H₂O PM25

1:1

PM25 2:1

A B

a

b c

a

b b

contribution de PM25 au lieu de la formation/disparitoin d’agrégats. Pour ce faire, nous avons testé l’effet de l’ajout de PM25 sur l’échantillon protéique avant les stress, c'est-à-dire avant dialyse et congélation. Lorsque PM25 est ajoutée dans un échantillon protéique avant traitement (Figure 2.10) aucune variation du rapport A340/A280 n’est observable. Dès lors, nous pouvons conclure que le rapport A340/A280

est un reflet de la turbidité de la solution et non de la quantité de PM25.

2.3.1 Effet de PM25 sur l’agrégation engendrée par la congélation

Nous avons voulu tester dans un premier temps si, la multiplication du nombre de cycles de congélation/décongélation engendrait une agrégation de plus en plus importante. Nous avons donc fait subir aux échantillons de protéines solubles de 2 à 8 cycles de congélations/décongélations (Figure 2.11). Après 2 cycles de congélation, le rapport de A340/A280 augmente jusque 0,4 (figure 2.11 A). Par contre, après 8 cycles, la valeur est identique à celle obtenue pour 2 cycles, ainsi, le niveau d’agrégation ne semble pas être amplifié avec la multiplication du nombre de cycles de congélation au-delà de 2. Lorsque l’échantillon est congelé en présence de PM25 en rapport massique PM25: protéines solubles 1 : 1 et 2 : 1, les protéines sont préservées de l’agrégation quelque soit le nombre de cycles de congélation. Nous avons également analysé l’agrégation des protéines lors de la congélation, par centrifugation suivie d’une électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel d’acrylamide 1D. Pour cela, nous avons fait migrer les protéines dialysées puis congelées, après centrifugation, et, séparation du culot et du surnageant. Les protéines qui se sont agrégées vont précipiter et se retrouver dans le culot, tandis que les autres seront présentes dans le surnageant (Chakrabortee et al., 2007). Nous avons donc fait migrer sur gel les échantillons ayant subi 8 cycles de congélation, après séparation des protéines agrégées et non agrégées par centrifugation. Nous observons effectivement qu’une partie des protéines se retrouvent dans le culot en absence de PM25 (figure 2.11 B). Par contre, en présence de PM25, la majorité des protéines se retrouvent dans le surnageant et ce pour les deux concentrations de PM25 testées.

Par analogie avec les résultats obtenus dans la littérature, nous pouvons dès à présent émettre l’hypothèse que PM25 pourrait jouer le rôle de chaperon moléculaire en empêchant de manière passive la formation d’agrégats, comme cela a été montré

C S C S C S H₂O PM25

1:1

PM25 2:1

C S C S C S

H₂O PM25 1:1

PM25 2:1

Figure 2.12 : Effet de la quantité de PM25 sur l’agrégation de protéines solubles de M.truncatula après congélation à -20°C

En A, l’agrégation des protéines est suivie par mesure de la DO à 340/280 avant ou après ajout de quantités croissantes de PM25 après congélation en rapport massique PM25 : protéines solubles. Les barres d’erreurs représentent l’écart- type calculé pour 3 réplicats. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05. En B, les échantillons protéiques sont centrifugés puis le culot : C et le surnageant : S sont déposés sur gel à volume constant. PM25 est ajoutée après congélation en rapport massique 1 :1 et 2 :1 PM25 : protéines solubles. La révélation est faite au bleu colloïdal.

Figure 2.13: Effet de l’ajout de différentes protéines purifiées sur l’agrégation de protéines solubles de M.truncatula

PM25, EM6, et BSA sont ajoutées en rapport massique 2 :1 PM25 : protéines solubles après congélation. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type calculé pour 3 réplicats. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

H₂O PM25

1:1

PM25 2:1 PM25

0.5:1

a b

c d

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

H₂O PM25

1:1

PM25 2:1 PM25

0.5:1

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

H₂O PM25

1:1

PM25 2:1 PM25

0.5:1

a b

c d

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

H₂O PM25 EM6 BSA a

b c

a

DO 340/280

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

H₂O PM25 EM6 BSA a

b c

a

A B

pour d’autres protéines LEA. (Chakrabortee et al., 2007; Kovacs et al., 2008b). Nous nous sommes donc attaché dans un second temps à mettre en évidence un effet de PM25 sur la dissolution des agrégats.