Partie 2 Caractérisation fonctionnelle de PM25
2.2 Effet de PM25 sur la protection enzymatique
2.2.1 Tests de protection de la citrate synthase
présentant une faible teneur en PM25 étant donné que nous avons pu montrer qu’une forte induction était néfaste à une croissance optimale (figure 2.3 B). Des culots bactériens amenées à une DO(600nm) de 1,2 ont été séchés pendant 7 jours à 75 % ou 43 % d’humidité relative (HR), permettant de tester un effet éventuel de PM25 en relation avec sa capacité de rétention en eau à ces deux valeurs d’humidité relative (Cf. figure 9). Les bactéries séchées sont ensuite réhydratées délicatement en milieu LB liquide puis une dilution sériée est effectuée afin de déterminer les quantités de CFU (Colony-Forming Unit) sur milieu LB solide. Après dessiccation à 43 % d’HR, les bactéries n’exprimant pas PM25 présentent un très faible taux de survie, de l’ordre de 0.6 % par rapport aux bactéries non séchées (figure 2.4). En présence de PM25 la tolérance à la dessiccation des bactéries n’est pas améliorée, le taux de survie étant similaire à celui observé en absence de la protéine. Les résultats obtenus pour un séchage à 75 % HR sont similaires (données non montrées). PM25 ne semble donc pas améliorer la survie bactérienne lors de la dessiccation
Figure 2.5 : Effet du chauffage à 43°C sur l’activité de la citrate synthase en absence (A) ou en présence (B) de glycérol
En A, l’enzyme à une concentration de 10 ng/µl est chauffée à 43°C dans le tampon de réaction seul puis refroidie sur la glace. En B, différentes concentrations de glycérol (40, 60 % vol/vol) sont ajoutées avant chauffage. Les pourcentages d’activité sont calculés par rapport aux témoins avant chauffage en présence/absence de glycérol. Les écart-types sont calculés par rapport à la moyenne de 3 réplicats techniques.
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité/témoin non chauffé
0 20 40 60 80 100
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité/témoin non chauffé
0 20 40 60 80 100
glycérol 40%
glycérol 60%
A B
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité/témoin non chauffé
0 20 40 60 80 100
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité/témoin non chauffé
0 20 40 60 80 100
glycérol 40%
glycérol 60%
A B
conditions expérimentales en étudiant les effets protecteur du glycérol tels que décrits dans la littérature (Mishra et al., 2005). Ceci nous permettant de nous affranchir des artéfacts liés notamment à l’encombrement moléculaire lorsque de trop fortes concentrations protéiques sont utilisées. Lorsque l’enzyme est chauffée à 43°C, son activité diminue très rapidement, elle n’est plus que de 40 % après seulement 2 minutes de chauffage et devient très faible, aux alentours de 5 %, après 5 minutes, puis négligeable après 10 minutes (Figure 2.5 A). En revanche, en présence de glycérol 40 et 60 % (Figure 2.5 B) après 2 minutes de chauffage à 43°C l’activité se situe entre 75 et 80 % de celle mesurée avant chauffage ; et après 20 minutes elle reste de l’ordre de 30 %. Les résultats indiquent que le glycérol est capable de retarder la dénaturation de l’enzyme, et sont similaires à ceux obtenus par (Mishra et al., 2005).
Ayant validé le modèle, nous avons ensuite étudié les effets de PM25 recombinante dans les mêmes conditions que ci-dessus. Nous avons également testé l’effet de EM6 et de la BSA comme protéines témoins. Comme nous l’avons précisé au cours de la partie 1, EM6 est une protéine LEA du groupe 1, qui a été clonée et purifiée au laboratoire. EM6 a été choisie car son abondance est corrélée à la mise en place de la tolérance à la dessiccation tout comme PM25 (Boudet et al., 2006).
Lorsque la CS est chauffée en présence de PM25 (rapport massique 2 :1), la perte d’activité enzymatique est significativement ralentie pendant des temps très courts de chauffage (Figure 2.6 A). En effet, à 2 minutes, nous observons encore une activité d’environ 60 % en présence de PM25 contre 30 % dans le témoin (effet est comparable à celui du glycérol 40 %). Après cinq minutes de chauffage, bien que l’activité résiduelle soit fortement réduite, un effet significatif de PM25 est toujours observé. Ces observations prennent toutes leurs significations lorsque nous les comparons avec les résultats obtenus en présence de EM6 et BSA. En effet, ces deux protéines n’exercent aucune protection contre le chauffage. Après 10 min, PM25 n’exerce plus d’effet protecteur. Lorsque des concentrations croissantes de PM25, 0,5 à 4 :1 (masse :masse ; protéine :CS) sont ajoutées, si pour un rapport de 0.5 :1 aucune amélioration significative n’est obtenue, à partir d’un rapport 1 :1 la protection devient effective (Figure 2.6 B). De plus nous pouvons constater un effet dose-réponse puisque plus la quantité de PM25 est augmentée, plus la protection est efficace. Cependant, ceci ne reste valable que pour les temps court de chauffage, en
Figure 2.6 : Pourcentage d’activité de la citrate synthase en fonction du temps de chauffage en présence de PM25, EM6 ou BSA
En A, l’enzyme est chauffée de la même façon qu’en 2.6, mais en présence de PM25, EM6 ou BSA en ratio massique protéine:CS 2:1. Les pourcentages d’activité sont calculés par rapport aux témoins non chauffés respectifs. En B, L’enzyme est chauffée en présence de PM25 0.5:1 ; 1:1 ; 2:1 ; 4:1 en masse ratio protéine:CS. Les pourcentages d’activité sont déterminés par rapport aux témoins respectifs. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type calculé pour 3 réplicats biologiques. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05
Figure 2.7 : Activité de la citrate synthase après séchage en présence de PM25
L’enzyme (10 ng/µl) est séchée pendant 4h à 43% d’humidité relative en A et pendant 5h à 75% d’humidité relative en B. L’évolution du pourcentage de l’activité enzymatique est mesurée par rapport aux témoins non séchés respectifs.
PM25, EM6 et BSA sont ajoutées avant séchage en masse ratio 2:1 protéine : CS. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type calculé pour 3 réplicats biologiques. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05
a aa
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d’activitéchauffé/non chauffé
0 20 40 60 80
H2O PM25 2:1 EM6 2:1 BSA 2:1
c b a c
a
a b a
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité chauffée/non chauffée
0 20 40 60 80
H2O PM25 0.5:1 PM25 1:1 PM25 2:1 PM25 4:1
aa b
c d
aa bc c
a a a a a a a a a a a a a
A B
a aa
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d’activitéchauffé/non chauffé
0 20 40 60 80
H2O PM25 2:1 EM6 2:1 BSA 2:1
c b a c
a
a b a
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité chauffée/non chauffée
0 20 40 60 80
H2O PM25 0.5:1 PM25 1:1 PM25 2:1 PM25 4:1
aa b
c d
aa bc c
a a a a a a a a a a aa a a a a
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d’activitéchauffé/non chauffé
0 20 40 60 80
H2O PM25 2:1 EM6 2:1 BSA 2:1
c b a c
a
a b a
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité chauffée/non chauffée
0 20 40 60 80
H2O PM25 0.5:1 PM25 1:1 PM25 2:1 PM25 4:1
aa b
c d
aa bc c
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d’activitéchauffé/non chauffé
0 20 40 60 80
H2O PM25 2:1 EM6 2:1 BSA 2:1
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d’activitéchauffé/non chauffé
0 20 40 60 80
H2O PM25 2:1 EM6 2:1 BSA 2:1
c b a c
a
ac b a b a c
a
a b a
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité chauffée/non chauffée
0 20 40 60 80
H2O PM25 0.5:1 PM25 1:1 PM25 2:1 PM25 4:1
aa b
c d
aa bc c
Temps (min)
2 5 10 20
Pourcentage d'activité chauffée/non chauffée
0 20 40 60 80
H2O PM25 0.5:1 PM25 1:1 PM25 2:1 PM25 4:1
aa b
c d
aa bc c
a a a a a a a a a a a a a
A B
Pourcentage d'activité séchée/non séchée
0 5 10 15 20 25 30
Pourcentage d'activité séchée/non séchée
0 5 10 15 20 25 30
a
b c
c c
a
ab bc
H2O PM25 EM6 BSA H2O PM25 EM6 BSA
A B
Pourcentage d'activité séchée/non séchée
0 5 10 15 20 25 30
Pourcentage d'activité séchée/non séchée
0 5 10 15 20 25 30
a
b c
c c
a
ab bc
H2O PM25 EM6 BSA H2O PM25 EM6 BSA
A B
effet, des concentrations élevées de PM25 ne sont pas suffisantes pour induire une protection après 10 min suggérant la possibilité d’une réaction irréversible induite par la chaleur (Figure 2.6 B).
2.2.1.2 Effet de PM25 sur la protection de la citrate synthase pendant le séchage
La CS est également sensible au séchage. Cependant, il a pu être montré un effet protecteur de son activité enzymatique pour plusieurs protéines LEA lors du séchage (Goyal et al., 2005; Haaning et al., 2008). Nous avons donc séché l’enzyme en présence ou en absence de PM25 dans deux conditions d’humidité relative différentes 43 et 75 % et mesuré son activité après réhydratation. Comme nous l’avons indiqué dans le relevé bibliographique, PM25 possède des propriétés de rétention en eau différentes pour ces deux valeurs d’humidité relative.
En l’absence de PM25, la perte d’activité résultante d’un séchage à 43 ou 75 % d’humidité relative est très proche, entre 90 et 95 % de perte d’activité pour les deux types de séchage (Figure 2.7 A et B). Lorsque l’enzyme est séchée en présence de PM25, l’activité enzymatique après le traitement est améliorée, puisqu’elle est d’environ 20 % soit 10 à 15 % supérieure à celle dans le témoin. Cependant, si l’effet observé est significativement différent de celui obtenu en présence de EM6, il ne l’est pas de celui obtenu en présence de la BSA et cela pour les deux conditions testées. Par ailleurs, PM25 ne semble pas protéger de manière plus efficace la CS quelque soit les conditions d’humidité relative puisque nous atteignons 20 % d’activité après séchage dans les deux conditions.
Afin de compléter ces résultats nous avons travaillé sur un autre système enzymatique modèle : la lactate déshydrogénase qui, elle, a la propriété de s’agréger et de perdre son activité lors de la congélation.