PM25, une protéine majoritairement non structurée en solution

Partie 1 PM25, une LEA atypique, spécifique de la graine et

1.1. PM25, une protéine hydrophobe largement désordonnée à l’état natif et stable à

1.1.2 PM25, une protéine majoritairement non structurée en solution

Une autre des principales caractéristiques des protéines LEA est leur absence de structuration en solution. Cependant, il existe une divergence entre les résultats des prédictions obtenues successivement (Cuming, 1999; Tunnacliffe et Wise, 2007;

Battaglia et al., 2008; Hundertmark et Hincha, 2008) suggérant que les membres du groupe 5 présentent une conformation secondaire majoritairement ordonnée, et, les données de spectroscopie FTIR obtenues pour PM25 par (Boudet et al., 2006) qui indiquent que la forme recombinante de cette protéine, à l’état hydraté, est majoritairement désordonnée. Selon ces auteurs, elle présente en effet seulement 33

% d’hélice et 18 % de feuillet  Mais il faut noter que ce dernier type de structure est moins abondant chez d’autres protéines avérées être des LEA (Tunnacliffe et Wise, 2007).

Récemment, plusieurs travaux ont abouti à la publication de nouveaux algorithmes tel que PONDR VL-XT (Predictor Of Natural Disordered Regions (www.pondr.com) dont l’objectif est de prédire les contributions de domaines désordonnés à partir de la séquence primaire d’acides aminés. Ces algorithmes sont réputés plus fiable pour cet exercice que ceux utilisés jusqu’à présent (tel que PELE).

En effet, ces derniers ont été mis au point pour prédire les contributions relatives de chaque type de structure d’une protéine intrinsèquement ordonnées et apparaissent moins efficace dans la prédiction de structures désordonnées. Cette méthode de calcul a récemment été utilisée pour prédire la structure d’une protéine LEA inhabituelle, hydrophobe, de lotus (L.japonicus), IDP1, appartenant au groupe V selon la classification de Wise, et dont le comportement, ressemble à celui d’une protéine globulaire (Haaning et al., 2008). Nous avons donc soumis la séquence de PM25 à ce logiciel qui transforme les scores PONDR sous forme d’une fonction de distribution cumulée (Figure 1.3). Nous avons comparé le résultat obtenu pour PM25 avec celui obtenu pour EM6, une protéine LEA du groupe 1 dont le caractère intrinsèquement désordonnée a été vérifié expérimentalement (Soulages et al., 2002) et qui est, également, étudiée dans notre laboratoire. Nous pouvons remarquer que les 2 protéines sont en dessous d’une droite symbolisant la limite virtuelle entre les protéines considérées comme majoritairement ordonnées et les protéines considérées

Figure 1.5 : Spectre de PM25 en solution et en présence de SDS en dichroïsme circulaire et contribution des structures secondaires en spectroscopie FTIR et en DC de PM25 en solution, séchée, et en présence de SDS

En A : Spectre de PM25 seule en solution (PM25 : 1 mg/ml ; tampon phosphate 5 mM pH 7.5) et en présence de SDS 1%.

En B : Les pourcentages des différents types de structures secondaires obtenues par spectroscopie FTIR sont issus de Boudet et al., (2006). Pour les valeurs de DC, elles sont déduites des spectres obtenus en A grâce au programme DICHROWEB (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml, Lobley et al., 2002)

A B

Figure 1.4 : Caractéristiques générales des spectres protéiques obtenus en dichroïsme circulaire

En A : Spectres typiques obtenus pour différentes conformations protéiques. En B : Valeurs maximales et minimales attendues pour les différentes conformations.

FTIR CD

Longueur d'onde (nm)

180 200 220 240 260 280 300 320 340

Ellipticité molaire (deg.cm2 dmol-1 )

-6000 -4000 -2000 0 2000 4000

En solution SDS 1%

α: Hélice α β: Feuillet β τ: Coude (turn)

ρ:Pelote statistique non périodique (random coil)

PM25 PM25 séchée PM25 PM25+SDS 1%

Distribution des structures secondaires (%)

0 20 40 60 80 100

α β τ ρ

A B

FTIR CD

Longueur d'onde (nm)

180 200 220 240 260 280 300 320 340

Ellipticité molaire (deg.cm2 dmol-1 )

-6000 -4000 -2000 0 2000 4000

En solution SDS 1%

α: Hélice α β: Feuillet β τ: Coude (turn)

ρ:Pelote statistique non périodique (random coil)

PM25 PM25 séchée PM25 PM25+SDS 1%

Distribution des structures secondaires (%)

0 20 40 60 80 100

α β τ ρ

A B

FTIR CD

Longueur d'onde (nm)

180 200 220 240 260 280 300 320 340

Ellipticité molaire (deg.cm2 dmol-1 )

-6000 -4000 -2000 0 2000 4000

En solution SDS 1%

α: Hélice α β: Feuillet β τ: Coude (turn)

ρ:Pelote statistique non périodique (random coil)

PM25 PM25 séchée PM25 PM25+SDS 1%

Distribution des structures secondaires (%)

0 20 40 60 80 100

α β τ ρ

A B

FTIR CD

Longueur d'onde (nm)

180 200 220 240 260 280 300 320 340

Ellipticité molaire (deg.cm2 dmol-1 )

-6000 -4000 -2000 0 2000 4000

En solution SDS 1%

α: Hélice α β: Feuillet β τ: Coude (turn)

ρ:Pelote statistique non périodique (random coil)

PM25 PM25 séchée PM25 PM25+SDS 1%

Distribution des structures secondaires (%)

0 20 40 60 80 100

α β τ ρ

A B

Longueur d'onde (nm)

180 200 220 240 260 280 300 320 340

Ellipticité molaire (deg.cm2 dmol-1 )

-6000 -4000 -2000 0 2000 4000

En solution SDS 1%

α: Hélice α β: Feuillet β τ: Coude (turn)

ρ:Pelote statistique non périodique (random coil)

PM25 PM25 séchée PM25 PM25+SDS 1%

Distribution des structures secondaires (%)

0 20 40 60 80 100

α β τ ρ

PM25 PM25 séchée PM25 PM25+SDS 1%

Distribution des structures secondaires (%)

0 20 40 60 80 100

α β τ ρ

A B

comme majoritairement désordonnées. Ainsi, PM25 apparaît bien comme une protéine majoritairement désordonnée en solution tout comme EM6. Ce résultat est similaire à celui obtenu par (Haaning et al., 2008) pour la protéine IDP1.

Afin de conforter cette prédiction, nous avons déterminé la contribution des différentes structures secondaires de PM25 en solution par une technique complémentaire à la spectroscopie FTIR (FTIR : Fourrier Transformed Infra Red): le dichroïsme circulaire (DC) en UV lointain. En effet, cette méthode est couramment utilisée dans les études de structure/fonction des protéines LEA (Soulages et al., 2002; Mouillon et al., 2006; Tolleter et al., 2007). Les spectres obtenus en spectroscopie FTIR par (Boudet et al., 2006) l’avaient été en diluant la forme recombinante purifiée de PM25 dans du D2O. Nous avons ici repris la même forme recombinante provenant de la même série de purification mais diluée dans du tampon phosphate 5 mM pH 7.5.

La technique de dichroïsme circulaire (CD) en UV lointain permet d’avoir accès à la structure et/ou conformation d’une macromolécule en solution et notamment la structure secondaire d’une protéine par l’étude de son spectre d’absorption en lumière polarisée. Le groupement amide de la liaison peptidique est un chromophore, qui, placé entre deux carbones asymétriques que sont les carbones  de deux acides aminés voisins, va absorber différemment une onde polarisée circulaire gauche et une onde polarisée circulaire droite. En effet, les groupements peptidiques sont orientés selon des angles  et  caractéristiques des différents types de structures secondaires. L’allure et les valeurs maximales et minimales du spectre obtenu en DC vont donc varier selon que la protéine est repliée en hélices , feuillet  ou qu’elle est non structurée (Fig.1.4 A et B). La fraction de chaque type de structures secondaires présentes dans la protéine peut ainsi être estimée en considérant le spectre CD de celle-ci comme la somme des contributions de chaque type par rapport à un spectre de référence pour chacun de ces types (Greenfield et Fasman, 2002).

La figure 1.5 A montre le spectre d’absorption de PM25 (courbe rouge), obtenu dans la région des UV lointain, dissoute dans le tampon phosphate. Il présente un maximum dans les ellipticités molaires négatives aux alentours de 200 nm typique

d’une absence de structuration de la protéine (Random coil ou pelote statistique) et ne présente aucun des autres critères attendus pour les autres conformations. Ce spectre est très similaire à celui d’autres protéines LEA du groupe 1 (Soulages et al., 2002), 2 (Mouillon et al., 2006) et 3 (Tolleter et al., 2007), et confirme que PM25 présente une conformation majoritairement désordonnée en solution.

Il a été décrit à plusieurs reprises que des protéines LEA pouvaient se structurer en hélice  lors du séchage (Boudet et al., 2006; Tolleter et al., 2007) mais également sous l’effet d’un agent chimique tel que le SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) (Ismail et al., 1999; Tolleter et al., 2007). Nous avons voulu savoir si la conformation de PM25 pouvait également être influencée par le SDS. Le spectre CD obtenu en présence de SDS 1% (Figure 1.5 A, courbe bleue) fait apparaître les caractéristiques typiques d’une protéine majoritairement structurée en hélice avec deux minima à 208 et 222 nm pour les valeurs d’ellipticité négative et un maximum à 192 nm pour les valeurs d’ellipticité positives. Ceci nous indique une capacité de la protéine à se structurer en présence de SDS. Le site internet DICHROWEB (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml, (Lobley et al., 2002)) dispose d’algorithmes qui permettent de comparer les spectres étudiés à ceux de protéines de référence dont la structure est parfaitement connue grâce à l’analyse des cristaux protéiques par diffraction des rayons X. Cette comparaison permet par une méthode de « curve fitting » d’estimer la contribution des différentes structures secondaires en décomposant le spectre obtenu en DC. Nous avons ainsi pu estimer la contribution de chaque structure en solution et en présence de SDS 1% et confronter nos résultats avec les données obtenues en spectroscopie FTIR par (Boudet et al., 2006).

Les structures en coude (turn) et en pelote statistique non périodique (random coil) représentent les régions désordonnées de la protéine. Les structures en coude sont des régions non ordonnées mais présentant tout de même un repliement particulier de la protéine faisant souvent le lien entre deux régions ordonnées. Les structures en pelote statistique non périodique sont des régions ne présentant aucune structuration. Si les deux méthodes indiquent que PM25 est globalement non ordonnée en solution (Figure 1.5 B), les données obtenues en DC indiquent une absence de structuration en solution plus importante par rapport aux données obtenues en spectroscopie FTIR. En effet, le DC indique une proportion en hélice

Figure 1.6: Analyse par western blot de la solubilité à la chaleur de PM25 et EM6

Des extraits de protéines solubles, extraites de graines de M. truncatula imbibées 6h, sont chauffés aux températures indiquées pendant 10 minutes. Les extraits sont centrifugés puis le culot (C) et le surnageant (S) sont analysés en SDS-PAGE (dépôt protéique à volume constant) puis western blot. PM25 et EM6 sont révélés par un anti-corps spécifique (Boudet et al., 2006)

EM6

20 15

PM25

37 25