Tests de protection de la lactate déshydrogénase

effet, des concentrations élevées de PM25 ne sont pas suffisantes pour induire une protection après 10 min suggérant la possibilité d’une réaction irréversible induite par la chaleur (Figure 2.6 B).

2.2.1.2 Effet de PM25 sur la protection de la citrate synthase pendant le séchage

La CS est également sensible au séchage. Cependant, il a pu être montré un effet protecteur de son activité enzymatique pour plusieurs protéines LEA lors du séchage (Goyal et al., 2005; Haaning et al., 2008). Nous avons donc séché l’enzyme en présence ou en absence de PM25 dans deux conditions d’humidité relative différentes 43 et 75 % et mesuré son activité après réhydratation. Comme nous l’avons indiqué dans le relevé bibliographique, PM25 possède des propriétés de rétention en eau différentes pour ces deux valeurs d’humidité relative.

En l’absence de PM25, la perte d’activité résultante d’un séchage à 43 ou 75 % d’humidité relative est très proche, entre 90 et 95 % de perte d’activité pour les deux types de séchage (Figure 2.7 A et B). Lorsque l’enzyme est séchée en présence de PM25, l’activité enzymatique après le traitement est améliorée, puisqu’elle est d’environ 20 % soit 10 à 15 % supérieure à celle dans le témoin. Cependant, si l’effet observé est significativement différent de celui obtenu en présence de EM6, il ne l’est pas de celui obtenu en présence de la BSA et cela pour les deux conditions testées. Par ailleurs, PM25 ne semble pas protéger de manière plus efficace la CS quelque soit les conditions d’humidité relative puisque nous atteignons 20 % d’activité après séchage dans les deux conditions.

Afin de compléter ces résultats nous avons travaillé sur un autre système enzymatique modèle : la lactate déshydrogénase qui, elle, a la propriété de s’agréger et de perdre son activité lors de la congélation.

Figure 2.8 : Effet du nombre de cycle de congélation (A) et de l’ajout de protéines après 3 cycles de congélation (B) sur l’activité de la lactate déshydrogénase

En A, mesure de la perte d’activité enzymatique de la LDH provoquée par des cycles de congélation à l’azote liquide, par suivi de la disparition du NADH (mesure de la DO à 340 nm). En B, des quantités croissantes de protéines (PM25, EM6, BSA, lysozyme) sont ajoutées pendant la congélation en masse ratio protéine:LDH 1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 10:2. La courbe en présence d’eau représente le témoin sans ajout de protéines. Le pourcentage d’activité après traitement est calculé par rapport aux témoins respectifs sans traitements mais en présence des protéines. Les barres d’erreurs représentent l’écart- type calculé pour 3 réplicats biologiques. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05

A B

Masse ratio protéine:LDH

'1:1' '2:1' '4:1' '6:1' '10:1'

Pourcentage d'activité/non congelée

0 20 40 60 80 100

Nombre de cycle de congélation décongélation

0 1 2 3 4

Pourcentage d'activité/non congelée

0 20 40 60 80 100

A B

Masse ratio protéine:LDH

'1:1' '2:1' '4:1' '6:1' '10:1'

Pourcentage d'activité/non congelée

0 20 40 60 80 100

Nombre de cycle de congélation décongélation

0 1 2 3 4

Pourcentage d'activité/non congelée

0 20 40 60 80 100

2.2.2.1 Effet de PM25 sur la protection de la lactate déshydrogénase pendant la congélation

La lactate déshydrogénase est une enzyme tétramèrique qui a la propriété de s’agréger et de perdre son activité lorsqu’elle est congelée (Greiff et Kelly, 1966).

Sur le même principe que pour la CS, nous avons testé si PM25 avait des propriétés cryoprotectrices. Dans un premier temps, nous avons testé le nombre de cycles de congélation nécessaire pour diminuer significativement l’activité de l’enzyme. Après 1 cycle consistant en une congélation rapide dans l’azote liquide suivie d’une décongélation à température ambiante pendant 10 minutes, l’activité enzymatique chute à 30 % de la valeur obtenue avant congélation et chute à moins de 20 % après 3 cycles (Figure 2.8 A). Nous avons donc choisi de travailler après 3 cycles de congélation/décongélation. En présence de PM25, aucun effet significatif n’est observé pour un rapport massique de PM25:LDH 1 :1 (Figure 2.8 B). Par contre, plus la quantité de PM25 est augmentée et plus l’activité de la LDH après la congélation est améliorée. Ainsi, dès un rapport massique de 6:1, l’activité est complètement préservée. En ce qui concerne EM6 et BSA, elles sont capables d’offrir une protection partielle mais nettement moins efficace que PM25. En effet, en présence d’un rapport massique de 6 :1 et 10 :1, l’activité résiduelle après congélation atteint un pallier aux alentours de 80 % en présence de BSA. De la même façon, l’activité résiduelle après congélation en présence de EM6 se situe aux alentours de 60% pour un rapport massique 10 :1.

2.2.2.2 Effet de PM25 sur la protection de la lactate déshydrogénase pendant le séchage

Tout comme pour la CS, le séchage à 43 % HR diminue très fortement l’activité de la LDH (Figure 2.9 A). En effet après séchage et réhydratation, l’activité n’est plus que de 1 à 1.5 % de l’activité mesurée avant séchage. Lorsque l’enzyme est séchée en présence de PM25 en ratio masse protéine 2 :1, l’activité enzymatique est augmentée de manière significative, mais peu efficacement puisque elle n’atteint que 5 % de l’activité avant traitement. Cet effet protecteur est également observé pour EM6 mais pas pour la BSA ou le lysozyme. Cependant si PM25 est ajoutée en quantité plus élevée (10 :1 ratio massique protéine protectrice : LDH) la préservation de l’activité enzymatique est améliorée puisque elle est de l’ordre de 12 fois supérieure à celle

Figure 2.9 : Effet de l’ajout de protéines sur l’activité de la lactate déshydrogénase après séchage

L’enzyme est séchée pendant 4h à 43% d’humidité relative en présence de PM25, EM6, BSA ou de lysozyme en A : masse ratio 2 :1 protéines : LDH et en B : masse ration 10 :1 protéine : LDH. Le pourcentage d’activité après traitement est calculé par rapport aux témoins respectifs sans traitements mais en présence des protéines. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type calculé pour 3 réplicats biologiques. Un test ANOVA est effectué afin de déterminer les niveaux de significativité obtenus, les lettres indiquent les groupes résultants avec p<0.05

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6

Pourcentage d'activité/non séché

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6 BSA lysozyme

A B

a b

b

ab ab

a a

b

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6

Pourcentage d'activité/non séché

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6 BSA lysozyme

A B

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6

Pourcentage d'activité/non séché

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6 BSA lysozyme

Pourcentage d'activité/non séché

0 2 4 6 8 10 12 14 16

H₂O PM25 EM6 BSA lysozyme

A B

a b

b

ab ab

a a

b

a b

b

ab ab

a a

b

dans l’eau (figure 2.9 B). Par ailleurs, cet effet n’est pas retrouvé en présence de EM6 dans les mêmes proportions. Comme pour la CS, l’effet protecteur de PM25 est beaucoup plus limité que pendant la congélation cependant il reste spécifique puisqu’il n’est pas observé en présence de BSA ou de EM6.