Construção e validade do guião da entrevista

Afin de mieux comprendre la répression par les pyrimidines du promoteur PI de l'opéron carAB dépendant du gène carP et en vue d'établir une carte fonctionnelle de la protéine multifonctionnelle CarP/PepA, nous avons entrepris la sélection et l'étude d'un grand nombre de mutants affectés dans la répression du promoteur PI et localisés dans le gène carP/pepA. Trois stratégies de sélection de mutants ont été utilisées:

a- 6 mutants provenant de la sélection effectuée préalablement par Roovers et al,

(1988).

b-16 mutants obtenus par la technique de mutagenèse localisée, utilisant l'hydroxylamine et un lysat de phages transducteurs Pl (voir plus bas et Matériels et méthodes).

c- 18 mutants obtenus par mutagenèse à l'hydroxylamine d'ADN plasmidique portant le gène carP/pepA.

Il est évident que nous n'avons pas pu analyser toutes ces mutations au même degré. Néanmoins, toutes les mutations carP/pepA décrites dans ce travail ont été séquencées, et l'impact sur la répression de l'opéron carAB mesuré. L'activité de résolution cerfXer dépendante a été analysée dans les mutants qui portent l'allèle muté sur le chromosome (une seule copie). L'activité aminopeptidase a été mesurée dans un nombre restreint de mutants et enfin, 7 protéines CarP/PepA mutées ont été purifiées et la fixation in vitro sur la région de contrôle de l'opéron carAB étudiée.

Tableau II.3: Mesure de l’activité P-galactosidase et CPSase dans la souche sauvage MC4100 et les mutants carP sélectionnés sur chromosome cultivés en milieu minimum (-) et en milieu minimum plus arginine et uracile (AU).

CPSase (pmol/h/mg) AU P-galactosidase (nmol/min/mg) AU MC4100 0.296 0.034 MC4100 14:40 26.4 carP6 0.340 0.184 carP6 14:40 154.5 carPlO 0.570 0.285 carPlO 14:40 205.3 carP33 0.560 0.213 carP33 14:40 241.4 car P 36 0.480 0.203 carP36 14:40 163.1 carPôM 0.265 0.129 carPôM 14:40 244.8 carP9M 0.192 0.077 carP9M 14:40 201.3 carPlOM 0.154 0.316 carP20M 14:40 100.6 carP33M 0.074 0.204 carP33M 14:40 148.0

Tableau II-4: Mésure de l’activité p-galactosidase et carbamoylphosphate synthétase dans les mutants car P cultivés en milieu minimum (-) et en milieu minimum plus arginine et uracile (AU).

P-galactosidase CPSase (nmol/min/mg) (pmol/h/mg) Milieux Souches Min AU Min AU MC4100 14:40/F’101 135.0 15.0 0.352 0.034 carPlO 14:40/F’101 146.0 96.5 0.510 0.320 carP33 14:40/F’101 248.0 116.5 carP36 14:40/F’101 198.5 110.8 0.380 0.340 carPôM 14:40/F’101 125.5 76.0 0.490 0.204 carP9M 14:40/F’101 121.0 45.7 0.440 0.252 carPlOM 14:40/F’101 131.5 78.0 carP33M 14:40/F’101 124.5 76.0

a- Mutations sélectionnées sur le chromosome (Roovers et al., 1988)

Les premiers essais pour isoler des mutants partiellement constitutifs pour la synthèse de la carbamoylphosphate synthétase (Piérard et al., 1972) n'ont conduit qu'à l'obtention de mutants argR, ce qui a conduit Roovers et al. (1988) à développer une stratégie utilisant une souche diploïde pour le gène argR (afin d'éviter les mutants argR

récessifs) et portant la fusion carA-lacZ-Ap^ (14:40) dans laquelle le gène lacZ est placé sous contrôle des promoteurs PI et P2 de l'opéron car AB sur le chromosome. Cette construction, MC4100 14:40 GR102 qui pousse très lentement sur lactose comme source de carbone en présence d'arginine et d'uracile, à été utilisée pour sélectionner des mutants, spontanés ou après mutagenèse à l'éthyl-méthane-sulfatonate (EMS), qui poussent plus rapidement sur ce milieu. Parmi ces mutants, nous en avons retenu 6 qui avaient été localisés préalablement par cartographie génétique dans le gène carF/pepA-,

les mutants carPlO, carP33 et carP36, obtenus spontanément, et les mutants carPôM, carP9M et carPlOM, obtenus après mutagenèse à l'EMS (Roovers et al, 1988). Nous avons entamé l'étude plus approfondie de tous ces mutants, nous avons mesuré dans les dérivés car+ en conditions de répression (arginine plus uracile) une activité spécifique de la CPSase supérieure à celle de la souche sauvage, et un facteur de répression réduit (Tableau 11-3). Ces résultats ont été confirmés par des dosages de la P-galactosidase dans le contexte de la fusion 14:40 (Tableau 11-3). Les mesures de l'activité p-galactosidase et

CPSase dans ces mêmes souches portant l'épisome F'IOl (avec l'opéron carAB)

montrent des valeurs supérieures à celle trouvée dans la souche sauvage (Tableau 11-4). Ces résultats indiquent que les mutations carP agissent en trans sur l'expression de l'opéron carAB. Les mutants carPZOM et carP33M montrent des propriétés particulières. Curieusement, l'activité CPSase mesurée dans ces mutants est plus élevée en présence d'arginine et de pyrimidines qu'en milieu minimum. Cependant, cet effet inversé n'est pas observé dans les mêmes mutants mais dans le contexte de la fusion 14:40 (carA-lacZ)

(Tableau II-4). Il n'est pas exclue qu'une modification dans la région de contrôle de l'opéron carAB ait été introduite au cours de l'étape de transduction utilisée pour la construction des dérivés car'*' à partir des mutants originaux. Le séquençage de la région de contrôle devrait donner la réponse. A l'exception de carP33M, tous les gènes carP

mutés de cette classe de mutants ont été amplifiés par la technique de PCR utilisant la polymérase Pwo et les oligonucléotides, OCPL et OCPR, qui s'hybrident de part et d'autre du gène carP. Les fragments amplifiés ont été digérés par HzndlII et clonés dans le vecteur pKK223-3- La nature des mutations a été déterminée par séquençage enzymatique. Parmi ces six mutants, trois portent une seule substitution: carPôM

(serZOphe), carP9M (ala331val) et carP33 (val366gly). L'allèle carPlO présente deux mutations dont l'une, en position 24, conduit à la création d'un codon Stop, ambre, suite à la substitution d'une paire de bases G/C en T/A (GAA^TAA). La mutation carPlOM

Mutants position (a. a) a. a affecté Ac.PepA

%(*)

sauvage - - 33

carP6M 70 ser—phe (TCC-»TTC) 25

carP9M 331 ala—val (GCC-»GTC) <5

carP20M 298 ala—val (GCA-»GTA) <5

409 ala—thr (GCG-»ACG)

carP20 24 glu~»Stop (GAA->TAA) <5 298 ala->val (GCA-»GTA)

carP33 366 val^gly (GTT-»GGT) 33

carP36 187 ala-» thr (GCA-»ACA) 25

348 val^met (GTG-»ATG) 479 lys-»asn (AAA-»AAC) LMP6 106 met^val (ATG^ATA) <5) LMP9 171 glu-»lys (GAG-»AAG) <5 LMP 11 483 gly-»asp (GGT-»GAT) <5 LMP 15 211 ala-» thr (GCT-»ACT) 10 212 asp^asn (GAC-»AAC) LMP20 165 arg-»his (CGT-»CAT) 25) LMP25 450 ala-»val (GCA-»GTA) 33 LMP26 177 gly-»asp (GGT-»GAT) <5) LMP28 (52) leu-»leu (CTG-»CTA) 25 53 glu-»lys (GAA^AAA) pNHMl 49 arg-»glu (CGG^CAG) 33 pNHM3=LMP20 165 arg-»his (CGT-»CAT) 25 pNHM4 21 gly-»asp (GGC^GAC) <5 pNHM5 130 val-»Ile (GTC^ATC) 33 451 gly^asp (GGT-»GAT) pNHM6 119 gly-»asp (GGC^GAC) 33 (302) giy^giy (GGC-»GGT) pNHM7 295 cys-»tyr (TGC-»TAC) <5 pNHM8 136 thr-»met (ACG^ATG) 33 (441) giy-^giy (GGC-»GGT) pNHM14 5 val^Iso (GTA^ATA) 271 gly-»ser (GGT^AGT) pNHMlS 409 ala-» thr (GCG-»ACG) PNHM16 78 cys-»tyr (TGC-»TAC) pNHMlS 150 pro-»leu (CCG-»CTG) PNHM20 26 arg-»cys (CGT-»TGT) pNHM21 116 his-»tyr (CAC-»TAC) (461) tyr-»tyr (TAC-»TAT) PNHM23 240 gly-»asp (GGT-»GAT pNHM26 (137) leu-»leu (CTC^CTT) 415 asp-»asn (GAC-»AAG) PNHM27 13 glu—Stop (CAG^TAG) pNHM28=4 21 gly-»asp (GGC^GAC) PNHM29 27 arg-»his (CGC-»CAC)

Tableau II-5: Localisation des mutations carP, substitutions d'acides aminés et dosage de l'activité aminopeptidase des protéines mutées correspondantes. *, pourcentage d'activité aminopeptidase résiduelle après traitement thermique (70%).

présente deux substitutions, ala298val et ala409thr, tandis que l'allèle carP36 porte trois substitutions d'acides aminés (alal87thr, val348met et lys479asn) (Tableau 11-5 et Figure 11-16). D'autre caractéristiques de ces mutants sont décrits plus loin (voir 11.A. 14,15 et 16).

b- Mutagenèse localisée

Nous avons exploité ici la proximité des gènes carP/pepA etpyrBI (80% de cotransduction par le phage PI) sur le chromosome d'E.coli pour favoriser la sélection de mutants carP. Un lysat de phage Plvir préparé sur la souche sauvage MC4100 a été mutagénisé à l'hydroxylamine pendant 6 heures, puis utilisé pour transduire la souche

pyrB~ H26 14:40 Xcar. Cette souche ne possède pas d'ATCase et est donc incapable de pousser en absence d'uracile. Nous avons sélectionné des recombinants pyrB'^ sur milieu minimum supplémenté de vitamine Bl, proline et ampicilline et testé par réplique 1500 colonies pour la croissance sur lactose comme source de carbone en présence et en absence d'arginine et d'uracile (pour réprimer les promoteurs PI et P2) et sur des boîtes MacConkey en présence de lactose. Sur les 1500 colonies testées 30 poussaient vite sur lactose en présence d'arginine et d'uracile et formaient des colonies rouges sur MacConkey lactose. Pour vérifier si la mutation responsable de ce phénotype est localisée dans le gène carP, un stock de phage Plvir a été préparé sur chacun de ces mutants et utilisé pour transduire à nouveau la souche pyrB~ H26 14:40 Xcar. Si la mutation est localisée dans le gène carP, 80% des transduits pyrB'^ doivent former des colonies rouges sur MacConkey lactose. Après ce test, 16 mutants, désignés par LMP (Localised Mutagenesis carP) suivi d'un nombre, ont été retenus pour une analyse plus approfondie.

Nous avons amplifié les différents allèles par la technique de PCR à partir de l'ADN génomique préparé sur ces 16 candidats comme modèle et les oligonucléotides OCPL et OCPR, qui s'hybrident de part et d'autre du gène carPfpepA, (voir Matériel et Méthodes). Après digestion aux enzymes Smal et Stul les fragments d'ADN de 1932 pb portant les différents allèles ont été clonés dans le vecteur pUC18 et séquencés par la méthode enzymatique de Sanger et al. (1977). Sur les 16 candidats, 8 correspondent à l'introduction d'un codon stop (Figure 11-16 et Tableau 11-5). 7 mutants présentent une mutation simple (parfois double au niveau de l'ADN mais dont une est silencieuse, elle ne résulte pas en un changement au niveau de la protéine) résultant en un changement d'un seul acide aminé: LMP6 (metl06val), LMP9 (glul711ys), LMPll (gly483asp), LMP20 (argl65his), LMP25 (ala450val), LMP26 (glyl77asp), et LMP28 (glu531ys). Le mutant LMP15 présente une double mutation qui conduit à la substitution de deux acides aminés contigus, ala211thr et asp212asn. Les activités P-galactosidase mesurées dans ces 8 mutants cultivés en milieu minimum plus arginine et uracile sont 2 à 4 fois

Tableau II-6: Mesure de l’activité (3-galactosidase dans les mutants

carP de la série LMP. Activité p-galactosidase nm/min/mg Min AU Facteur de répression H26 14:40 X car (sauvage) 219 30.9 7.1 H26 14:40 Xcar LMP6 272.1 202.4 1.3 H26 14:40 Xcar LMP7 313.6 98.1 3.1 H26 14:40 X,car LMP9 460.0 188.3 2.4 H26 14:40 A.car LMPll 141.3 176.3 0.8 H26 14:40 X,car LMP 14 409.6 139.1 2.9 H26 14:40 X.car LMP 15 149.1 118.1 1.3 H26 14:40 X.car LMP20 247.8 149.9 1.6 H26 14:40 Xcar LMP25 .. 325.4 _ 94.2 3.5 H26 14:40 Xcar LMP26 411.6 124.9 3.3 H26 14:40 >^ar LMP28 418.8 132.6 3.2

plus élevées que celle mesurée dans la souche sauvage (Tableau II-6). Ce qui est en accord avec les tests phénotypiques sur milieu MacConkey lactose utilisés pour leur sélection. Par contre, en milieu minimum les mutants LMPll et LMP15 présentent des activités plus faibles que celle mesurée dans la souche sauvage; tous les autres mutants présentent une activité P-galactosidase plus élevée. Tous les mutants montrent un facteur de répression par les pyrimidines plus faible que celui mesuré dans la souche sauvage.

c- Mutations sélectionnées sur le plasmide:

La souche CôOOr'm" Aprolac carP6 14:40, portant la mutation carP6 et la fusion

carA-lacZ sur le chromosome, forme des colonies rouges sur milieu MacConkey lactose. L'introduction dans cette souche, du gène carP sur un plasmide muticopie (pNHW) portant la résistance à la kanamycine, résulte en la formation des transformants qui sont blancs sur ce même milieu. Afin de sélectionner des mutations dans le gène carP qui ne seraient plus capables de complémenter la mutation carPS chromosomique, nous avons soumis à la mutagenèse par l'hydroxylamine (deux heures à 70°C, voir Mat. et Met.) une préparation de plasmide pNHW et utilisé l'ADN traité pour transformer la souche C600r"m“ Aprolac carP6 14:40.

Sur 500 colonies kanamycine résistante obtenues, 30 formaient des colonies rouges sur MacConkey lactose (pNHM1^30). A partir de chacun de ces 30 mutants, l'ADN plasmidique a été isolé et utilisé dans une nouvelle transformation afin de vérifier la nature plasmidique de la mutation. 18 candidats formant des colonies rouge foncé, ont été retenues pour analyse plus approfondie après ce test.

Les résultats des dosages de l'activité p-galactosidase dans ces souches (Tableau 11-7) montrent que tous les mutants qui sont apparus rouges sur les boîtes MacConkey après la deuxième transformation présentent une activité supérieure à celle obtenue avec la même souche réceptrice transformée avec le plasmide pNHWl portant le gène

carP sauvage. On peut subdiviser ces mutants en trois sous-classes; une dont l'activité P-galactosidase est comparable à celle de la souche réceptrice carP6. Cette classe comprend la majorité des mutants (pNHMl, 6, 7, 9, 14,15, 21, 22, 23, 26, et 27). Une

deuxième classe comprenant les mutants pNHM8 et pNHMlS qui présentent une

activité P-galactosidase inférieure à celle de la souche réceptrice portant la mutation

carP6. Ces deux mutants présentent une activité résiduelle CarP/PepA qui leur permet

de complémenter partiellement la mutation carP6. La dernière sous-classe est

représentée par des mutants qui présentent une activité p-galactosidase largement supérieure à celle de la souche carPô, elle comprend les mutants pNHM3,4,5,16, 20, 28 et 29. Nous avons transformé la souche H26 14:40 carPô X car par les plasmides pNHWl et pNHMl, 6, 20, 21 et 29 afin de pouvoir mesurer l'activité P-galactosidase en milieu

minimum et en milieu minimum plus arginine et uracile. Les transformants présentent des facteurs de répression réduits (2 à 3 fois) par rapport à celui observé dans la souche sauvage (6.8 fois) (Tableau II-8).

Tableau II-7; Mésure de l’activité (i-galactosidase dans les mutants carP sur plasmide créés à l’hydroxylamine ^drochloride. Activité P-galactosidase (nmol/min/mg) C600r~m~Aprolac carP6 14:40 52.8 C600r"m”A/?ro/ac carP6 14:40/pNHWl 15.9 C€>OOT~m~Aprolac carP6 14:40/pNHMl 58.6 C600r”m”A/7rc>/ac carP6 14:40/pNHM3 103.0 C600T~m~Aprolac carP6 14:40/pNHW4 113.1 C600T~m~Aprolac carPô 14:40/pNHM5 81.4 CS00r~m~Aprolac carP6 14:40/pNHM6 60.6 C600r”m”Apro/ac carP6 14:40/pNHM7 55.6 C600r"m”Apro/ac carPô 14:40/pNHM8 30.3 C600r”m“Apro/ac carP6 14:40/pNHM9 57.8 C600r"m"Apro/ac carP6 14:40/pNHM14 56.4 C600r“m"Aprc>/ac carPô 14:40/pNHM15 51.2 <ZS00r~TrrAprolac carP6 14:40/pNHM16 93.4 C6>00r~m~Aprolac carPô 14:40/pNHM18 33.2 CSOOr~m~Aprolac carP6 14:40/pNHM20 79.0 C()00r~m~Aprolac carP6 14:40/pNHM21 48.6 ÇZ€>00r~rr\~Aprolac carP6 14:40/pNHM22 43.8 C600r"m“A/?roZac carP6 14:40/pNHM23 58.0 C600r~m~Aprolac carP6 14:40/pNHM26 57.4

CZSOOr'rrT Apro lac carP6 14:40/pNHM27 42.6

C60Qv~m~Aprolac carPô 14:40/pNHM28 78.1

C2600t~ti\~ Apro lac carP6 14:40/pNHM29 76.5

Le séquençage nucléotidique (par la méthode enzymatique) utilisant les oligonucléotides basés sur la séquence du gène carP sauvage nous a permis de localiser les différentes mutations induites par le chlorydrate d'hydroxylamine. La plupart des mutants simples consistent en une seule substitution au niveau de l'ADN (Tableau II-5).

D'autres allèles portés par les plasmides pNHM6, pNHM8, pNHM21 et pNHM26,

présentent deux mutations au niveau de l'ADN mais dont une est silencieuse (ne

Tableau II-8: Dosage de l’activité p-galactosidase de la souche H26 14:40 Xcar transformée par le plasmide pNEO portant les mutants du gène carP en milieu minimum (Min) et en milieu minimum plus arginine et uracile (Arg+Ura).

Activité (3-galactosidase

nmol/min/mg

Facteur de Min Arg+Ura ^répression

H26 14:40 carP6 Àcar/pNHWl 169.4 24.9 6.8 H26 14:40 carP6 A,car/pNHMl 123.4 43.0 2.9 H26 14:40 carP6 Xc:ar/pNHM6 194.7 79.0 2.5 H26 14:40 carP6 À^ar/pNHM20 116.0 39.6 2.9 H26 14:40 carP6 Xcar/pNHM21 102.3 50.9 2.0 H26 14:40 carP6 À^ar/pNHM29 77.7 37.6 2.1

conduit pas à un changement d'acide aminé). Deux candidats seulement, pNHM5 et pNHM21, présentent deux substitutions au niveau de la protéine. Une seule mutation stop, dans le candidat pNHM27 (CAG-»TAG) à été créée par cette méthode. D'une façon générale les mutations ne sont pas localisées dans une région bien définie, mais sont dispersées sur toute la longueur du gène carP (Figure 11-16).

Des dosages de l'activité aminopeptidase de plusieurs mutants ont été effectués (voir § 11.A.14.) et les protéines CarP mutées purifiées utilisées pour tester leur fixation sur la région de contrôle de l'opéron carAB (voir 11.A.15.).