3.2.2.1 Cromatografia líquida de alta eficiência

A CLAE é uma das técnicas analíticas mais empregadas na análise de SFAs o número de publicações é muito grande120,121. Para fornecer ao leitor uma visão geral sobre estes procedimentos, alguns destes métodos foram selecionados e encontram-se apresentados na Tabela 3, relatando algumas das suas principais características. Outros métodos foram detalhadamente descritos devido a sua maior relevância.

A separação é comumente realizada em modo reverso, empregando colunas de sílica modificadas com grupos C-18, C-8 ou C-4, e raramente colunas de íon-par também são empregadas.

A fase móvel consiste principalmente da mistura de acetonitrila – água; metanol – água ou misturas ternárias de acetonitrila – metanol – água. O uso de etanol – água também foi proposto. Adicionalmente, acetato ou SDS também são adicionados à fase móvel para melhorar a separação cromatográfica.

A retenção das SFAs não depende somente da polaridade da fase móvel, mas também da ionização destes compostos. Deste modo, o ajuste do pH da fase móvel tem papel fundamental na eficiência de separação. O pH ótimo encontra-se em torno de 4,4, valor este no qual todas as sulfonamidas com exceção da sulfanilamida tem excelente retenção.

Tabela 3. Características dos principais métodos de CLAE descritos para análise de sulfonamidas. Matriz Preparação das amostras Detecção LD (Pg kg-1_{) Ref.} Frutos do

mar

Extração líquido-sólido e EFS

de exclusão por tamanho UV 10 135 Rim e

fígado

Dispersão da matriz em fase sólida e extração com fluído supercrítico

EM com ionização

eletrospray 5 - 14 136 Leite e

ovos

Dispersão da matriz em fase sólida

EM com ionização

eletrospray 1 - 6 137 Leite ELL e ultrafiltração _{ionização eletrospray} EM quadrupolo com 5 -20 138

Carne Extração com CH2Cl2 UV-EM/EM 50 139

Mel _{catiônica e EFS em Oasis-HLB} Dissolução com EFS de troca CLAE com detecção _{por fluorescência} 2 - 5 16 Leite SFAs são isoladas através de _diálise UV em 260 nm ---- 140

Leite ELL com acetonitrila seguida _{por EFS} CLAE/APCI-EM 8,2 141 Leite Clean-up usando UF DAD 5 - 20 142

Leite e ovos

Extração com ácido tricloroacético-metanol (4:1, v/v), etapa de EF e CL em C-8

UV em 268 nm 100 (leite)

10 (ovos) 143

Dentre os métodos de CLAE vários tipos de detecção são empregadas, como: absorção na região do UV5,8,11,12,14,28,144-153, fluorescência16,41,154-156, EM7,10,13,15,157-160 e apenas um método utilizando detector eletroquímico é descrito, o qual se baseia na medida coulométrica161.

HUANG et al.5 propuseram um método simplificado de CLAE para a identificação e determinação de resíduos de sulfonamidas em amostras de leite bovino. As sulfas são extraídas com a mistura etanol – ácido acético (97:3, v/v) seguida por centrifugação. O sobrenadante é então separado em coluna C-8 modificada com grupos éter, confeccionada pelos próprios autores. O sistema opera em modo isocrático utilizando como fase móvel a mistura acetonitrila – água (5:95) com detecção em 270 nm. Uma relação linear foi observada para o intervalo de concentração de 50 a 1000 ppb para sulfanilamida e de 100 a 1000 ppb para sulfadiazina, sulfamezarina e sulfametazina. A separação das quatro sulfas é conseguida em aproximadamente 16 minutos. As porcentagens de recuperação variaram de 83,7 a 103,0%.

ZAYAS-BLANCO et al.28 _{desenvolveram um procedimento simples e rápido}

para a determinação de sulfametazina em leite bovino sem a interferência de outras sulfonamidas. O método envolve um pré-tratamento inicial de 20 mL da amostra pela adição de HCl 1 mol L-1 _{(20 mL) para precipitação das proteínas e purificação para}

obtenção de um extrato em diclorometano limpo através da EFS em cartucho C-18. Quando amostras de leite integral são analisadas uma etapa adicional de ELL com hexano é necessária para remoção das gorduras. O extrato é evaporado até secura e o resíduo reconstituído em 0,5 mL de HCl 1 mol L-1_{. Neste pré-tratamento a}

amostra é concentrada 40 vezes. A separação e quantificação da sulfametazina são realizadas por CLAE operando em modo reverso e eluição isocrática. A fase móvel consiste na mistura de uma solução aquosa de metanol – acetato de amônio 4,0 x 10-3 mol L-1, com vazão de 1 mL min-1. A detecção é efetuada em 264 nm. Uma relação linear foi observada em cinco níveis de concentração (25, 50, 100 150 e 200 ppb) para amostras de leite fortificadas com o padrão analítico. A porcentagem média de recuperação foi 82,8 % com LD de 3 ppb.

SMEDLEY152 descreve um estudo em colaboração com oito laboratórios para a determinação de oito sulfonamidas em amostras de leite bovino usando a CLAE com detecção ultravioleta em 265 nm. Antes das análises as sulfas precisam ser extraídas da matriz com a mistura de solventes: clorofórmio – acetona (2+1, v/v). O extrato orgânico é evaporado até secura e o resíduo é reconstituído em solução aquosa de mono-hidrogeno fosfato de potássio 0,1 mol L-1. Uma etapa de ELL adicional é feita com hexano para remoção das gorduras. A separação das sulfas foi efetuada em modo isocrático em coluna C-18. A separação e a quantificação foram conseguidas após duas análises empregando condições cromatográficas diferentes. Em uma primeira análise, utilizou-se como fase móvel a mistura metanol - KH2PO4

(12 + 88, v/v), possibilitando a separação inicial de cinco sulfas. A segunda análise é feita empregando como fase móvel a mesma mistura supracitada, porém na proporção de 30:70 (v/v). Em ambas as condições a coluna foi mantida a 35°C com a fase móvel fluindo a uma vazão de 1,5 mL min-1. A necessidade de duas condições cromatográficas diferentes para a separação das oito sulfas implica na análise de uma mesma amostra duas vezes. Este fato torna a análise dispendiosa e demorada. Se dois sistemas cromatográficos forem disponíveis o tempo total de análise diminui, mas o custo aumenta. Se não há disponibilidade de dois

equipamentos, o tempo de análise aumenta consideravelmente, pois primeiro uma análise é feita empregando a primeira fase móvel, então a coluna precisa ser condicionada com a segunda fase móvel por pelo menos uma hora para que só então a segunda análise seja efetuada. Isto também eleva os custos da análise, pois o gasto com solventes é maior.

WU et al.153 _{determinaram oito sulfonamidas (sulfadiazina, sulfatiazol,}

sulfametazina, sulfametoxipiridazina, sulfamonometoxina, sulfametoxazol, sulfametoxina e sulfaquinoxalina) em leite bovino utilizando a CLAE operando em modo gradiente com detecção em 270 nm. As amostras inicialmente são filtradas em papel de filtro quantitativo e na seqüência 10 mL são tratados com sulfato de sódio anidro (15 g) e acetato de etila (15 mL) com agitação por um minuto. A mistura é centrifugada e a fase orgânica coletada e o procedimento repetido mais uma vez. Os extratos orgânicos são combinados, evaporados até secura e o resíduo dissolvido em 1 mL de acetato de etila. Esta solução é então submetida a uma etapa de purificação em cartucho de extração aniônico contendo sílica modificada com grupos amino. As sulfas são eluídas com 1,5 mL da mistura de metanol – acetonitrila – solução aquosa de ácido acético 1% (1:1:8, v/v/v) e separadas em coluna C-18. Um número de 75 amostras foram fortificadas e analisadas. As porcentagens de recuperação variaram de 70,5 a 89,0%. Em duas das amostras analisadas foi constatada a contaminação por sulfadiazina em concentrações de 9,7 e 12,3 ppb.

TSAI e KONDO156 desenvolveram um método de CLAE com detecção fluorimétrica para a determinação de sulfadiazina, sulfatiazol, sulfametazina, sulfamonometoxina, sulfametoxazol e sulfadimetoxina em sangue e leite bovinos. Foi empregado o ácido p-aminobenzóico como padrão primário. As sulfas foram extraídas com acetonitrila, seguida por evaporação e derivatizadas pela adição de fluorescamina gerando derivados fluorescentes. A separação em coluna C-18 empregou como fase móvel a mistura acetonitrila – fosfato 10,0 x 10-3 mol L-1 nas proporções 30:70 (v/v) e a detecção fluorimétrica com excitação em 390 nm e emissão em 475 nm. A separação é efetuada em aproximadamente 20 minutos. A faixa de concentração de trabalho foi de 0,1 – 100 ppb. As taxas de recuperação na análise de amostras enriquecidas com mistura de sulfas em concentrações de 1,0 e 10 ppb foram de 95,4 – 107,2% e 81,4 – 89,6% para sangue e de 80,7 – 91,1% e 62,6 – 84,1% para leite, respectivamente.

VOLMER160 _{propôs a determinação de resíduos de 21 sulfonamidas em}

amostras leite bovino empregando a técnica CLAE, acoplada a espectrometria de massas (EM-EM). A separação é conseguida em menos de seis minutos operando em modo reverso com a fase móvel constituída pela mistura de acetonitrila e água (10:90, v/v) com adição de 0,1% de ácido fórmico com eluição em modo gradiente. As amostras requerem uma etapa prévia de purificação para precipitação das proteínas do leite e remoção das gorduras empregando HCl e hexano, respectivamente. O extrato resultante é pré-concentrado 10 vezes pela evaporação do solvente. As porcentagens de recuperação foram avaliadas para níveis de concentração de 10 e 100 ppb, com resultados variando de 72 – 96%.