3.2.2.3 Eletroforese capilar de alta eficiência

Nos últimos anos, a eletroforese capilar de alta eficiência (ECAE) tem-se tornado uma técnica promissora para a separação de uma ampla variedade de amostras, devido a sua alta resolução, alta eficiência, rapidez e pequeno consumo de amostras e solventes, quando comparada a CLAE120,121_.

A separação das SFAs empregando a ECAE é efetuada normalmente em dois modos: eletroforese capilar (EC) ou eletrocromatografia cinética capilar micelar (ECCM). A preparação das amostras é semelhante às descritas para os métodos de CLAE. Tampões fosfato ou borato são os mais comumente utilizados como modificadores eletrolíticos para a separação dos analitos no modo ECCM. No modo de EC a separação é controlada pelo ajuste adequado do pH do tampão empregado.

A ordem de migração das SFAs depende da razão carga massa e é determinada primariamente pelos valores de pKa. Deste modo, a precisa otimização do pH do tampão é indispensável para uma separação adequada. Para a EECM além do pH a concentração do surfactante é crucial. Além da importância dos valores de pKa, a separação é governada pelas constantes de ligação do soluto- micela.

NG et al.168 desenvolveram um método de eletroforese capilar usando E- ciclodextrina como modificador para a separação de uma mistura de sete SFAs. O pH 7,0 apresentou os melhores resultados para a separação e monitoramento em 210 nm. Uma relação linear foi observada para concentrações de 100 a 1000 ppm. A recuperação média de SFAs na análise de amostras de medicamentos foram relativamente baixas, em torno de 86,0%.

FUH e CHU169 propuseram o uso da ECAE combinado a etapa de clean-up por EFS para a determinação de oito SFAs em amostras de carne. A completa separação é conseguida usando solução tampão de Na3PO4 – H3PO4 (pH 6,5)

concentrações de SFA de 0,5 – 5,0 ppm, com LDs variando de 5 a 10 ppb. As porcentagens de recuperação foram de 80 a 97%.

III.3.2.3. Métodos microbiológicos

O uso de kits comercialmente disponíveis, baseados nestes métodos microbiológicos como testes rápidos para a detecção de resíduos de antimicrobianos em alimentos de origem animal têm se difundido.

Os métodos microbiológicos permitem detectar um amplo espectro de antimicrobianos, mas com a limitação de que os limites de detecção (LD) são relativamente altos, variando normalmente de 2 µg / Kg a 10 mg / Kg. Desta forma, classes de antimicrobianos como a das sulfonamidas não pode ser determinada com sensibilidade adequada para análise de resíduos dos mesmos170.

Os conjuntos mais antigos apresentam como princípio, a inibição do crescimento de espécies de bactérias sensíveis, o que possibilita a sua aplicação em diferentes tipos de amostras, como urina, soro e vários tecidos. A análise é executada em placas, utilizando-se um disco ou swab (é um cotonete de cabo comprido que já vem esterilizado num invólucro de papel) estéril posto em contato com o fluido ou tecido suspeito de conter resíduos. O swab é, então, posicionado na placa de ágar contendo a bactéria sensível ao antibiótico e incubado por 8 a 12 horas, dependendo do conjunto utilizado. A zona de inibição de crescimento bacteriano circundante ao swab indica a presença de antibiótico na amostra4.

A inibição do crescimento microbiano pode ser avaliada, também, através de indicadores colorimétricos. Os sistemas que empregam esta técnica são conhecidos pela sigla BsDA (Bacillus stearothermophilus Disk Assay), considerados oficiais para a detecção de resíduos de antibióticos b-lactâmicos no leite171. Diferentemente dos testes de placa, a inibição microbiana é constatada usando-se um indicador de pH, cuja cor é alterada na presença de compostos ácidos produzidos pelo B.

stearothermophilus. Deste modo, se na amostra houver resíduos, o crescimento

bacteriano é inibido e a mudança de cor não ocorre.

Os métodos que empregam princípios microbiológicos, contudo, apresentam certas pontos críticos que exigem maiores cuidados e conhecimento técnico

especializado para sua execução; além disso, os resultados não são imediatos. Estes kits também apresentam baixa especificidade e podem gerar resultados falso- positivos, exigindo, portanto, testes confiáveis adicionais para a confirmação dos resultados172_{. Estas análises confirmatórias normalmente são feitas por técnicas}

mais especializadas de separação cromatográfica acopladas a espectrômetros de massa e utilizadas para a detecção e quantificação de resíduos de antimicrobianos em diversas matrizes.

III.3.2.4. Métodos imunológicos

Os conjuntos que empregam princípios imunológicos baseiam-se na competição por sítios de ligação em receptores de células bacterianas que são específicos para várias classes de antibióticos. Os receptores bacterianos são adicionados à amostra, juntamente com antibióticos conjugados com isótopos radioativos (radioimunoensaio) ou enzimas (ELISA). A concentração de resíduos na amostra pode ser avaliada através de radiometria ou colorimetria, sendo diretamente proporcional ao número de sítios receptores ocupados pelo antibiótico não marcado. Entre as vantagens destas técnicas, destacam-se rapidez e simplicidade de execução, menor conhecimento técnico exigido para suas operações, maior especificidade para determinados antibióticos e possibilidade de detecção de outros agentes antimicrobianos, além de antibióticos173.

É importante ressaltar que os conjuntos de reativos necessitam de condições adequadas de armazenagem e operação, pois, por se tratar de um material biológico, são sensíveis às variações do ambiente. Assim, deve-se procurar mantê- los em temperatura conveniente para conservação, bem como realizar o teste em sala apropriada para esta finalidade, evitando a ocorrência de resultados falso- positivos. Além disso, as orientações fornecidas pelo fabricante devem ser seguidas rigorosamente, principalmente no que se refere à alíquota de leite tomada para o ensaio, ao uso adequado dos reagentes e cumprimento dos períodos de incubação, quando necessários173.

Recentemente, novos métodos analíticos, baseados em reações imunológicas e/ou enzimáticas foram aprimorados, oferecendo uma alternativa prática, aos procedimentos microbiológicos174-176.

O´KEEFFE, M. et al.175 _{utilizando-se do princípio dos métodos de imunoensaio}

propuseram o desenvolvimento de uma nova metodologia, denominada de imunocromatografia, a qual como o próprio nome indica, alia os princípios cromatográficos com aqueles dos procedimentos baseados em imunoensaios. Entretanto, neste inicio, a aplicação da metodologia ficou restrita a análise somente de uma sulfonamida isolada, a sulfametazina. Recentemente133_{, procedimento}

semelhante foi desenvolvido, porém ampliando o espectro de analitos, permitindo a análise de várias sulfonamidas simultaneamente.

III.3.2.6. Outros métodos

Métodos eletroanalíticos são poucas vezes empregados para a análise de SFAs177-191. As poucas citações de uso desta técnica são feitas até a década de 90 e daí em diante nenhuma referência de métodos eletroquímicos é feita na literatura.

Dentre estes métodos, YAO et al.181 descreveram a construção de eletrodos íons-seletivos para a determinação potenciométrica de sulfatiazol, sulfadoxina e sulfadimetoxina em formulações farmacêuticas. Os eletrodos são construídos pela imobilização dos complexos íon-par formados entre cetiltrioctilamônio com as formas aniônicas das sulfas examinadas em tubos de PVC. Os eletrodos apresentaram resposta rápida (15 – 25 segundos) e comportamento nerstiano para faixas de concentrações entre 3,00 x 10-5 – 1,00 x 10-2 mol L-1. O método foi aplicado na análise de medicamentos com recuperação média de 99,3% e ausência de interferências.

Outros métodos propostos na literatura empregam medidas de absorção atômica182-184 para a determinação indireta de SFAs em diversas matrizes. Métodos volumétricos com determinação do ponto de equivalência através de medidas espectrofotométricas185 ou potenciométricas186 também foram propostos para a análise de medicamentos. Entre outras técnicas citam-se a CCD187, procedimentos em fluxo188-190 e recentemente, a fluorimetria191,192 também foi empregada.

Capítulo IV. Estratégias e técnicas analíticas