4 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS COMO ADITIVOS NA NUTRIÇÃO ANIMAL

4.1 AVICULTURA

A comercialização e manejo no setor avícola no Brasil é um dos mais produtivos e lucrativos anualmente. Entretanto, a cada dia, o consumidor está mais exigente em relação à compra do produto final, como pela qualidade quanto pelo custo do produto. Por estes motivos, a ciência e tecnologia no desenvolvimento e produção de aves devem ser inovadoras, buscando constantemente uma maior qualidade e segurança alimentar destes produtos. O principal problema na avicultura está baseado na presença de microrganismos patogênicos que estão diretamente ligados a questões de saúde pública. As aves desenvolvem diferentes mecanismos de defesa para responder a estes patógenos, como anticorpos, peptídeos antimicrobianos e

peptídeos de defesa do hospedeiro (PDH), os quais, além de também possuir atividade antimicrobiana, podem ajudar no mecanismo de resposta imunológica (GARCIA; BYRD; WONG, 2018; SU et al., 2017, 2018). Um grupo destes peptídeos antimicrobianos são as defensinas que, no caso, ajudam a inativar ou eliminar bactérias, fungos ou vírus, podendo também induzir uma resposta na imunidade inata e humoral, aumentando a quantidade de imunoglobulinas IgG e IgM (YURONG et al., 2006). As defensinas tem uma sequência primária entre 18 e 45 aminoácidos, onde majoritariamente possuem muitos resíduos de cisteínas, as quais são importantes para a atividade antimicrobiana exercida pelas ligações dissulfeto formadas entre estes resíduos. A maioria destas defensinas presentes nas aves são denominadas β- defensinas aviares (AvBD) (AKBARI et al., 2008; NARUSHIN et al., 2020; SUGIARTO; YU, 2004).

Para avaliar os diferentes parâmetros comprometidos em uma análise experimental destes PAMs em aves, geralmente é necessária a coleta de partes do intestino (duodeno, jejuno, íleo e/ou ceco) e ainda, se necessário, amostras de suabe da cloaca dos animais. As doenças mais importantes e que constantemente apresentam mutações genéticas são a Leucose aviária, Doença de Marek, Gripe aviária e Salmonelose, gerando problemas graves na saúde das aves. Além disso, os microrganismos Escherichia coli, Campylobacter jejuni e os protozoários do gênero Eimeria que causam a coccidiose aviária podem comprometer seriamente a inocuidade alimentar.

As patologias decorrentes de bactérias têm sido estudadas de tal forma que, pela introdução de PAMs como aditivos nutricionais, pode-se controlar as doenças e não prejudicar a produção avícola. Algumas bactérias como

Salmonella sp. foram eliminadas por peptídeos como a microcina J25,

apresentando modificações benéficas nas microvilosidades do duodeno, jejuno e íleo, além de melhorar o rendimento da carcaça do frango e a sua microbiota cecal (WANG et al., 2020). A bacteriocina PlnK, utilizada numa solução aquosa na dieta diária de aves, controlou a presença das bactérias Gram-positivas e negativas e modulou o sistema imunológico dos animais (XU et al., 2020). O peptídeo plectasina também foi aplicado na dieta das aves e incrementou a produção de IgM e IgG, resultando numa diminuição significativa da quantidade de Escherichia coli e bactérias anaeróbicas na saúde intestinal de aves de corte

(MA et al., 2020). Outros peptídeos como a sublancina, cecropina, magainina, nisina e defensina também demonstraram evidente efeitos antimicrobianos, sendo também utilizados na nutrição de aves de corte. Muitos deles demonstraram atividade biológica frente aos microrganismos Clostridium

perfringens, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (ÖZCAN et al.,

2019). Por fim, um tipo de cecropina conhecida como CAMA é um outro exemplo de sucesso de aplicação de peptídeos antimicrobianos com resultados positivos: foram suplementados na ração e utilizados na produção animal, promovendo um aumento do crescimento das galinhas devido à retenção de nutrientes e também por um efeito modulador da microbiota intestinal das aves (CHOI et al., 2013).

Alguns peptídeos antimicrobianos podem ser produzidos por bactérias ácido lácticas (BAL). Estes microrganismos vivem no intestino e fazem parte da microbiota saudável das aves e também de outros animais. Estudos foram realizados para aumentar ou potencializar a presença de PAMs como resposta aos patógenos bacterianos. Por exemplo, a utilização de probióticos (microrganismos vivos que, administrados em quantidades adequadas, resultam em benefícios à saúde do hospedeiro), geralmente obtidos de cepas bacterianas da família dos Lactobacillus sp. (AKBARI et al., 2008; SCHLEE et al., 2008; WEHKAMP et al., 2004), ou por meio do cultivo de leveduras, dos quais se obtiveram resultados promissores na expressão de genes precursores de PAMs em galinhas de idade avançada (ZHANG et al., 2020). Numa outra abordagem ainda utilizando os PAMs, Ohh et al. (2009) avaliaram o extrato de batata misturado com proteínas e o peptídeo antimicrobiano potamina-1 como suplemento na alimentação das galinhas, demonstrando uma eliminação de bactérias coliformes e promoção de crescimento em frangos de corte. Ainda no âmbito alimentar, a aplicação de PAMs gerou resultados de impacto benéficos na qualidade da produção de ovos. A pigmentação da casca estaria relacionada à variabilidade dos PAMs presentes na clara, indicando que controlar e fortalecer os mecanismos de defesa são fatores prioritários para a obtenção de produtos de qualidade, levando-se em consideração o bem-estar animal e a biossegurança da produção (JAVŮRKOVÁ et al., 2019).

A utilização de PAMs como um tratamento alternativo frente ao combate de diferentes patógenos presentes na avicultura foram também

estudados utilizando estas biomoléculas provenientes de outros organismos, como de suínos. Desta forma, foram isolados PAMs do intestino destes animais e aplicados em galinhas inicialmente livres de patógenos, no intuito de aumentar a produção de IgA e entender a resposta imunorregulatória da mucosa intestinal (WANG et al., 2009). Ainda nesta linha, um estudo verificou a aplicação de PAMs obtidos de uma fração do intestino – localizado na união do ileocecal de coelhos (Sacculus rotundus) – como aditivo em bebidas. Como resultados, observaram-se um aumento nas vilosidades do duodeno e jejuno junto a um incremento de IgA, o que se conclui que esta aplicação modificou, quase que em sua totalidade, a estrutura do intestino da galinha sadia, além de alterar a sua resposta imunológica, o que dá uma perspectiva positiva para uma ampliação de sua aplicação (LIU et al., 2019). A divercina AS7 é um peptídeo isolado de Carnobacterium divergens AS7 e obtido de BAL da flora intestinal de peixes. A atividade biológica destas moléculas modificou o pH intestinal, modificado por bactérias, modulando-o e restaurando a um pH próximo ao normal (ENGBERG; HEDEMANN; JENSEN, 2002; OLEJNIK-SCHMIDT et al., 2014). A nisina, como já mencionada acima, é um PAM isolado da bactéria Gram- positiva Lactococcus lactis e aprovada pela Food and Drug Administration (FDA, entidade que regula o uso de medicamentos e alimentos nos EUA) pela sua eficiente atividade reguladora de presença de bactérias Gram-negativas em aves, como as enterobactérias e bacteroides (JÓZEFIAK et al., 2013). A albusina B, além das evidentes propriedades antimicrobianas e intestinais apresentadas, mostrou uma alta atividade antioxidante, o que leva a um efeito favorável na prevenção de outras possíveis doenças oportunistas que se desenvolvem durante o crescimento das aves (WANG et al., 2013).

Diante deste panorama, os peptídeos antimicrobianos têm demonstrado funções muito importantes na produção de aves, com efeitos na modulação imunológica, promoção de proteção do organismo e melhoria das qualidades dos produtos finais advindos da avicultura. Um fato interessante que foi observado é que os PAMs não apresentam risco ao serem utilizadas como possíveis substitutos de fármacos pois, muitas vezes, estas moléculas fazem parte do próprio sistema/mecanismo de defesa das aves. Além disso, existem comprovadamente muitos peptídeos bioativos que exercem outras funções biológicas como anticancerígenos, anti-inflamatórios e anti-

hipertensivos, os quais estão presentes tanto na gema do ovo, na carne ou em subprodutos da produção avícola (ARENA; SCALONI, 2018).

3.2 Suinocultura

O trato gastrointestinal dos suínos é habitado por centenas de espécies de bactérias que, simultaneamente com fungos, protozoários e leveduras, constituem um habitat que metaboliza os substratos endógenos e exógenos para a absorção dos nutrientes finais. Quando os substratos não são absorvidos, pode acontecer um desequilíbrio osmótico entre o conteúdo intestinal e celular, o que pode afetar as populações bacterianas do local. No colón, existe um grande número de coliformes, Lactobacillus, além de organismos anaeróbicos que integram a homeostase da microflora. No intestino grosso, os ácidos graxos voláteis aumentam a absorção de água e sódio (VAN BEERS- SCHREURS et al., 1998). Assim, em geral, a microbiota do intestino tem como papel atuar como uma barreira contra a colonização excessiva de bactérias patogênicas, por meio da competição por energia e produção de metabólitos. Esta microbiota, aliada à estrutura funcional e anatômica do intestino, passam por diversas modificações de acordo com o estágio de vida do animal e também em decorrência de fatores como condições ambientais, tipo de dieta, entre outros (ZLOTOWSKI et al., 2008).

A busca por possíveis substitutos aos antibióticos comerciais tem aumentado gradativamente na produção de suínos, devido ao fato das restrições quanto ao uso de antibióticos na produção animal e a grande resistência bacteriana que estes antibióticos podem causar, além do rastro de substâncias sintéticas que deixam na carne e no meio ambiente. Neste sentido, os PAMs têm se tornado alvo de pesquisas também na suinocultura, com o intuito de aplicá-los para a avaliação de seus efeitos nos principais patógenos, para uma otimização biosustentável da produção de suínos.

Segundo Brown et al. (2007), o uso de aditivos nutricionais, tais como os probióticos, pode atuar na proteção de animais adultos contra a colonização desequilibrada de patógenos, como a Escherichia coli e Salmonella e propiciar melhores índices zootécnicos em animais jovens, além da diminuição de

diarreia. Compreende-se por diarreia a abundância de água nas fezes proporcionalmente à matéria seca: as fezes normais apresentam mais de 24% de matéria seca, ao passo que as fezes líquidas apresentam menos de 20%. As diarreias são tidas como as grandes responsáveis pela grande perda de líquidos, eletrólitos e nutrientes dos suínos, ocasionando, assim, um baixo desempenho destes animais. Podem ocorrer por diversos fatores, dentre eles nutricionais, devido à acidificação do pH do intestino grosso, apresentando-se numa forma pastosa, com cores variando do marrom ao cinza. Estas diarreias podem acometer desde animais na fase de maternidade até animais em fase de terminação (ZLOTOWSKI et al., 2008).

Os principais patógenos que atuam na ocorrência da diarreia em suínos são devido à presença de Escherichia coli, que pode causar diarreias secretórias, ocasionadas quando há um excedente de água causada por toxinas liberadas por este patógeno. Essas toxinas alteram as trocas de água e o fluxo de eletrólitos no intestino delgado (FAIRBROTHER, 2006; MENIN et al. 2008). Alternativamente, outros agentes patogênicos podem atuar nas disfunções intestinais dos suínos, como o Clostridium perfringens do tipo A (CPA), que causa alterações clínicas por uma diminuição da superfície de absorção na mucosa do intestino, devido à secreção de duas toxinas chamadas de alfa e enterotoxina. Estas toxinas ocasionam uma série de alterações da permeabilidade intestinal e, como consequência, ocorre um acúmulo de líquidos e posterior diarreia, seguidas de desidratação e, amiúde, mortes súbitas (COSTA et al., 2004).

Na tentativa de superar estes problemas, os PAMs novamente podem ser aliados na eliminação das enterites, já que podem ser aplicados para diversas finalidades na cadeia produtiva de suínos, como por exemplo, promotores de crescimento, melhoria da digestibilidade dos nutrientes, auxílio à morfologia intestinal e, especificamente, na modulação da microbiota intestinal (WANG et al., 2016). Segundo Xiao et al. (2015), PAMs provenientes da lactoferrina foram utilizados na nutrição de suínos, na qual alguns estudos já descreveram que estas biomoléculas podem exercer resultados benéficos sobre o desempenho destes animais, tais como o aumento do peso corporal final e o ganho de peso médio diário, além da redução da conversão alimentar (TANG et al, 2012). Este desempenho zootécnico dos leitões pode estar ligado

diretamente à ação antimicrobiana dos PAMs, visto que estas moléculas podem eliminar bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (XIAO et al., 2015), de modo similar à regulação da microbiota descrita para as aves.

Os PAMs também podem melhorar o sistema imunológico de suínos. A cecropina AD, um peptídeo antimicrobiano isolado da lagarta da Hyalophora

cecropia e também utilizado na nutrição de aves, foi administrado em leitões

recém desmamados previamente desafiados com E. coli enterotoxigênica k88. As evidências demonstraram que os resultados encontrados foram equivalentes ao de leitões que receberam uma dieta com uma mistura de antibióticos convencionais. Desta forma, a cecropina ampliou a quantidade de lactobacilos no ceco, apresentando um efeito sobre a regulação da população bacteriana entérica, além de aumentar a imunidade do leitão contra a E. coli (WU et al., 2012).

Uma outra molécula com atividade antimicrobiana que vem sendo estudada e tem mostrado efeitos benéficos é o peptídeo antimicrobiano A3 (AMP-A3). Segundo Yoon et al. (2012a), este peptídeo demonstrou resultados benéficos, aumentando o crescimento em leitões desmamados, além de atuar beneficamente na morfologia e microflora intestinal. Este fato foi corroborado por outro estudo realizado pelo mesmo autor, avaliando a suplementação com o peptídeo antimicrobiano P5 (AMP-P5) (YOON et al., 2012b). Este peptídeo mostrou-se eficiente em relação ao desempenho e digestibilidade dos nutrientes, o que pode estar relacionado com uma maior disponibilidade das substâncias nutritivas, visto que o peptídeo também atua de forma benéfica na microflora intestinal.

O KR-32 é um peptídeo antimicrobiano que contém 32 resíduos e também foi estudado recentemente para a aplicação na nutrição de suínos. Em estudos in vitro realizado por Hu et al. (2020), esta molécula mostrou-se bastante promissora, com uma alta atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e baixa citotoxicidade, além de atuar para a melhoria da barreira intestinal. Já em estudos in vivo na dieta de leitões durante o desmame, a aplicação do PAM KR-32 apresentou uma diminuição da diarreia dos animais que receberam uma dieta com esta molécula em relação aos animais que receberam uma dieta controle, diminuindo também a inflamação entérica dos leitões. Nesta mesma intenção, em estudo realizado por Xiong et

al. (2014), os autores avaliaram o efeito da inclusão de diferentes PAMs, como a lactoferrina, cecropina, defensina e plectasina na dieta de suínos desmamados, criados em cinco fazendas diferentes. Foi possível observar que a suplementação com peptídeos atuou de forma benéfica no desenvolvimento zootécnico dos animais, promovendo um aumento da taxa de conversão alimentar, diminuição da incidência de diarreia e aumentando a taxa de sobrevivência dos leitões.

Uma outra estratégia estudada foi a utilização do peptídeo antimicrobiano composto (CAP), constituído principalmente de um PAM de larvas da Musca domestica e por uma defensina suína. Avaliou-se o efeito sinérgico da suplementação destes peptídeos na dieta dos suínos numa proporção de 1:1. Assim, o resultado desta suplementação demonstrou-se favorável tanto no desempenho animal, como também na diminuição de diarreia dos tratados, em comparação aos animais que receberam uma dieta controle, contendo os antibióticos convencionais colistina (polimixina E - polipeptídeo cíclico) e o macrolídeo leucomicina (SHI et al., 2018). Utilizando-se destes mesmos peptídeos, Ren et al. (2015) avaliaram as funções do sistema imunológico dos suínos e os resultados sugeriram que os peptídeos podem aumentar a população de células T e induzir uma menor porcentagem de células apoptóticas. No geral, a função imune celular foi evidentemente melhorada em leitões desmamados com o tratamento destes PAMs.

4.3 Bovinocultura

A utilização dos antibióticos na alimentação de ruminantes teve início na década de 50, onde os mesmos já eram usados no tratamento e prevenção de doenças, assim como na forma de promotores de crescimento, objetivando-se acelerar o desenvolvimento dos animais, excluindo microrganismos que reduziam a eficiência de utilização dos alimentos no trato gastrointestinal (OLIVEIRA et al., 2005). Na época, os antibióticos eram utilizados em doses subterapêuticas e os resultados dessa utilização foram muito satisfatórios. No entanto, com o passar do tempo, os antibióticos começaram a ser utilizado de

forma indiscriminada, o que trouxe aos problemas de resistência bacteriana que se vivencia atualmente.

Nos últimos anos, a resistência antimicrobiana tornou-se um dos grandes desafios da saúde pública. Estima-se que, no mundo inteiro, aproximadamente 700 mil mortes sejam causadas devido à resistência aos antibióticos convencionais (O’NEILL, 2014), incluindo 230 mil mortes por tuberculose multirresistente a medicamentos (OMS, 2019). De acordo com a OMS, resistência antimicrobiana pode ser definida como a “capacidade de um microrganismo de impedir a atuação de um antimicrobiano”, o que torna os tratamentos ineficazes e as infecções persistentes, muitas vezes incuráveis. Além da utilização desenfreada e excessiva dos antibióticos, a falta de inovação também contribui para o desenvolvimento da resistência antimicrobiana: as novas tecnologias não acompanham a velocidade de adaptação dos microrganismos aos fármacos. O uso inadequado de antibióticos nas atividades pecuárias é um dos fatores que contribuiu para a disseminação da resistência. Pode-se citar como exemplo a avoparcina, antibiótico glicopeptídico semelhante à vancomicina que, quando utilizado na produção de aves, leva a um aumento no nível de Enterococcus resistentes à vancomicina na flora intestinal e fecal de humanos saudáveis, os quais tiveram acesso aos animais tratados com o antibiótico (VAN DEN BOGAARD et al., 1997). Em janeiro de 2020, o MAPA proibiu a utilização de bacitracina, lincomicina, tiamulina, tilosina e virginiamicina como promotores de crescimento para a indústria animal (MAPA, 2020). Desta forma, apesar de serem considerados antibióticos importantes e eficientes para a saúde humana, sua utilização em subdosagens por longos períodos – como é feita na nutrição animal – poderia levar ao desenvolvimento de bactérias resistentes a esses antibióticos, impossibilitando o tratamento de doenças.

Considerando a peculiaridade dos animais ruminantes de viverem em simbiose com um grupo estabelecido de microrganismos ruminais, o desenvolvimento e a aplicação de novos produtos tendem a ser um processo mais longo. Alguns estudos in vitro têm sido feitos testando os PAMs como aditivos alimentares, principalmente utilizando bacteriocinas. As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias, estáveis ao calor e que podem ser utilizadas contra bactérias da mesma espécie ou até mesmo de

outros gêneros (COTTER et al., 2005). As bacteriocinas mais promissoras para serem utilizadas em substituição aos antibióticos são aquelas produzidas pelas BAL, pois são amplamente aceitas devido seu longo uso como probióticos nos alimentos (SANG e BLECHA, 2008). Como exemplos de bacteriocinas derivadas de bactérias ácido láticas, apresentam-se a nisina, mersacidina e lacticina, sendo que a primeira foi aprovada para uso comercial no processamento de alimentos e para tratamento de mastite bovina (DUFOUR et al., 2007) e a segunda foi testada para o tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-positivas (HANCOCK e SAHL, 2006).

A produção de metano ruminal, além de ser um problema ambiental por ser um dos gases que contribui para o efeito estuda, representa uma menor eficiência da utilização de nutrientes no rúmen, ou seja, energia que deveria estar sendo transformada em produto está sendo perdida na forma de gás. Assim, uma outra bacteriocina que foi testada como aditivo alimentar é a bovicina HC5, uma bacteriocina proveniente da Streptococcus bovis que é ativa contra uma ampla variedade de bactérias Gram-positivas, além de nenhum tipo de adaptação das bactérias-alvo foi observada (MANTOVANI, et al., 2001). Um estudo conduzido por Lee et al. (2002) testou os efeitos da bovicina HC5 in vitro na produção de metano ruminal. Foi observado no estudo citado previamente que a bovicina HC5 pode inibir a produção de metano no rúmen em diferentes faixas de pH – entre 5,5 e 6,7. Considerando que os inibidores da produção de metano normalmente são efetivos apenas por um curto período de tempo devido à adaptação dos microrganismos metanogênicos – responsáveis pela produção de metano no ambiente ruminal, o estudo testou também a capacidade da bovicina HC5 em inibir a produção de metano continuamente. Assim, observou-se que as metanogênicas não se adaptaram à bovicina HC5 e, interessantemente, houve uma redução gradual na população de metanogênicas no rúmen. Outro estudo, conduzido por Lima et al. (2009), testou se a bovicina HC5 poderia inibir a desaminação de aminoácidos no rúmen e se a bacteriocina afetaria os mesmos tipos de bactérias produtoras de amônia os quais são atingidas pela monensina – sendo este atualmente o antibiótico mais utilizado na produção de carne. Em conclusão, os dois aditivos selecionaram o mesmo tipo de bactéria.

Uma análise da utilização de peptídeos antimicrobianos em caprinos foi conduzida por Liu et al. (2017). No trabalho, foram utilizados uma defensina recombinante suína e um antimicrobiano proveniente de moscas, na proporção de 1:1, como suplemento alimentar para caprinos até 60 dias de vida, objetivando avaliar o seu efeito no desempenho dos animais e nos parâmetros fermentativos ruminais. Observou-se que a utilização destes PAMs trouxe