A SÍNTESE DE PEPTÍDEOS EM FASE SÓLIDA (SPFS) PARA A OBTENÇÃO DE PAMs: DA INOVAÇÃO À SUSTENTABILIDADE

Como mencionado, os peptídeos são biomoléculas naturais, formadas a partir de uma reação de condensação entre dois resíduos de aminoácidos, resultando em uma ligação peptídica. Estas biomoléculas são muito versáteis, exercendo utilidade e aplicabilidade fundamentais nas mais diversas áreas da Biologia e vem ganhando interesse nas áreas de Zootecnia, Agronomia e Veterinária, principalmente quando se aborda a nutrição animal.

Especificamente, os PAMs vêm se mostrando moléculas de grande interesse para o desenvolvimento de novos promotores de crescimento, pois seu mecanismo de ação, na maioria dos casos, evita o aparecimento de resistência dos microrganismos, diferentemente como ocorre com os antibióticos convencionais. Segundo Wang et al. (2016), os peptídeos antimicrobianos podem atuar de modo benéfico no desempenho de crescimento, digestibilidade de nutrientes, morfologia intestinal e microbiota intestinal em suínos, além de ser um composto totalmente natural. Atualmente, segundo o banco de dados específico para peptídeos DRAMP (Data

repository of antimicrobial peptides), existem cerca de 20.434 registros de

moléculas peptídicas, 5.619 das quais são PAMs gerais, contendo moléculas naturais e sintéticas, 14.739 são PAMs provenientes de patentes e 76 são PAMs

em estágio pré-clínico ou clínico do desenvolvimento de medicamentos (KANG, 2019).

Dado a importância que os PAMs vêm adquirindo dentro das ciências biológicas e agrárias, a SPFS tem sido a metodologia mais utilizada para a obtenção destas moléculas, visando à pesquisa científica e/ou a produção de peptídeos para aplicações de maneira geral. Pela primeira vez, em 1963, foi desenvolvida e implementada pelo professor Robert Bruce Merrifield, da Universidade de Rockefeller, cujo artigo científico que acabara de ser publicado no Journal of the American Chemical Society chamou muito a atenção dos pesquisadores da época, destacando-se logo pelo enunciado de seu resumo (MERRIFIELD, 1963):

Uma nova abordagem para a síntese química de polipeptídeos foi investigada. O estudo envolveu a adição gradual de aminoácidos protegidos a uma cadeia peptídica crescente que estava ligada por uma ligação covalente a uma partícula de resina sólida. Isto proporcionou um procedimento pelo qual os reagentes e subprodutos foram removidos por filtração e a recristalização dos intermediários foi eliminada. As vantagens do novo método foram a velocidade e simplicidade da operação. A viabilidade da idéia foi demonstrada pela síntese do tetrapeptídeo modelo L-leucil-L-alanilglicil-L-valina. O peptídeo era idêntico a uma amostra preparada pelo procedimento padrão de éster p-nitro-fenílico (p. 2149).

De uma maneira prática e genialmente exposta, este trabalho resultou ao autor a láurea do Prêmio Nobel de Química em 1984 pelo desenvolvimento de um método simples e engenhoso para a obtenção de peptídeos e proteínas. Esse método criou possibilidades inovadoras no campo da química de peptídeos e proteínas, que era a própria área de pesquisa de Merrifield, bem como no campo da química de ácidos nucleicos, onde outros pesquisadores puderam aplicar as suas ideias. O método de Merrifield promoveu uma transformação sem precedentes no progresso da química de peptídeos na Bioquímica, Biologia Molecular, Farmacologia e Medicina (NOBEL PRIZE, 2020).

A principal vantagem da SPFS é a aquisição de uma grande variedade de sequências peptídicas diferentes em um período relativamente curto de

tempo. Para isso, esta técnica baseia-se no crescimento da cadeia peptídica por meio da adição de resíduos de aminoácidos protegidos, um a um, a sua região N-terminal. Desta forma, a síntese ocorre da direção C-terminal para a N- terminal, oposta à direção natural das sínteses de proteínas, permanecendo durante todo o processo covalentemente ligada a um inerte e insolúvel (porém poroso) suporte polimérico de poliestireno (PS) ou simplesmente denominado de resina, que representa a fase sólida.

Geralmente, são empregadas duas estratégias/químicas para a SPFS: a química Boc, onde se utiliza o composto ácido-lábil Boc (terc-butiloxicarbonila) para a proteção dos grupos N-terminais dos aminoácidos, e a química Fmoc, que utiliza o composto base-lábil Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarboxila) como protetor (CHAN e WHITE, 1999). Atualmente, a estratégia mais utilizada é a química Fmoc, onde o grupo α-amino do aminoácido é protegido por este grupo base-lábil e suas cadeias laterais ionizáveis e/ou reativas por grupos estáveis à base empregada e lábeis ao ácido trifluoroacético (TFA). Os protetores garantirão o direcionamento da reação dos Fmoc-aminoácidos apenas no local de interesse para a formação da ligação peptídica e previnem reações secundárias, como a incorporação de derivados dipeptídicos em vez de um derivado de aminoácido. Além disso, podem ajudar na purificação final do produto devido a menor quantidade de produtos indesejados. Entre os protetores permanentes das cadeias laterais dos aminoácidos mais comumente utilizados na SPFS estão os grupos Boc (protegendo grupos indólicos e aminas), tritila (Trt, protegendo grupos imidazóis, amidas e sulfidrilas), 2,2,4,6,7- pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonila (Pbf, protegendo grupos guanidínicos) e O-terc-butila/t-butila (tBu, protegendo grupos potencialmente ionizáveis como hidroxilas, fenóis e ácidos carboxílicos) (PIRES et al., 2014).

Nesta estratégia, o grupo Fmoc por ser base-lábil é removido pela base 4-metilpiperidina. Alternativamente, a química Boc emprega propriamente este grupamento ácido-lábil como protetor do grupo N-terminal e derivados benzílicos (Bzl) para a proteção da maioria das cadeias laterais de resíduos de aminoácidos trifuncionais. Entretanto, esta estratégia está em desuso, devido à utilização de ácidos muito fortes para a clivagem, além de necessitar de uma etapa adicional (neutralização com uma base, trietilamina - TEA) para completar o ciclo de formação da ligação peptídica. Assim, o ciclo geral para a realização

de uma ligação peptídica dentro da SPFS, envolvendo as etapas de desproteção, lavagem e acoplamento pela estratégia Fmoc está representado no esquema geral da Figura 1.

Figura 1 - Esquema geral representando o ciclo geral para a realização de uma ligação peptídica na SPFS, envolvendo as etapas de desproteção, lavagem e acoplamento.

Fonte: Os autores.

Uma outra grande vantagem da utilização da SPFS é que a purificação de cada ciclo do procedimento, com seus resíduos já conectados à resina, pode ser realizada após cada etapa por uma simples lavagem utilizando solventes orgânicos adequados, geralmente diclorometano (DCM), N-metil-2-pirrolidona (NMP) ou N,N-dimetilformamida (DMF), entre outros de diferentes polaridades. Como as reações são realizadas em seringas com placas porosas, as impurezas, subprodutos e excesso de reagentes não estão conectados à resina, a qual, como mencionado anteriormente, é inerte e insolúvel nas condições utilizadas. Desta forma, os compostos indesejados são simplesmente

arrastados pelo solvente pela realização de uma simples filtração, permitindo a separação destes compostos em solução da resina, eliminando-os do ambiente reacional.

A reação de acoplamento, isto é, a formação da ligação peptídica entre aminoácidos e/ou peptídeos, é um passo fundamental na SPFS. De um modo geral, a reação consiste em dois passos consecutivos: o primeiro é a ativação dos grupos carboxila dos Fmoc-aminoácidos e o segundo consiste na acilação do grupo amino, finalizando o processo de acoplamento. Durante o primeiro passo, o aminoácido protegido (ou peptídeo) reage com os chamados reagentes ativantes ou acoplantes, os quais produzem um intermediário reativo, o que possibilita a conclusão do segundo passo. Usa-se, geralmente, um excesso destes reagentes para garantir um maior rendimento reacional. Brevemente, na etapa de acoplamento, os reagentes acoplantes mais comumente utilizados são a diisopropilcarbodiimida (DIC) e N-hidroxibenzotriazol (HOBt) ou o- (benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HBTU) e seus análogos acompanhados da base N,N-diisopropiletilamina (DIEA ou DIPEA). Na SPFS, existem diversos modos de ativação dos grupos carboxílicos dos Fmoc- aminoácidos, assim como diversos mecanismos de reação para os diferentes tipos de agentes acoplantes. Esta abordagem não será evidenciada nesta seção e pode ser encontrada com detalhes em diversas literaturas já publicadas (PIRES et al., 2014; CARPINO e EL-FAHAM, 1999; KÖNIG e GEIGER, 1970; EL-FAHAM e ALBERICIO, 2011).

Para verificar a desproteção do grupo Fmoc descrita anteriormente e a etapa de acoplamento de cada derivado de aminoácido durante todas as etapas da SPFS, deve ser realizado um teste colorimétrico para a análise da presença de grupos amina. Este ensaio consiste na reação de uma amina primária ou secundária com a ninidrina, produzindo um composto azul escuro conhecido como púrpura de Ruhemann no primeiro caso ou um composto marrom, correspondendo a produtos não clássicos específicos para aminas secundárias como ocorre, por exemplo, com o aminoácido prolina (KAISER et al., 1970).

Com toda a sequência desejada de aminoácidos acoplada à resina, realiza-se o processo final de obtenção do peptídeo denominado de clivagem, que é a quebra por ácido (TFA) da ligação entre o peptídeo sintetizado e a resina funcionalizada, além da desproteção total do peptídeo, eliminando todos os

protetores das cadeias laterais. Durante o processo de clivagem pelo TFA leva à formação de carbocátions, intermediários altamente reativos, os quais podem promover diversas reações colaterais não desejadas, como: i) aminoácidos cujos protetores são facilmente removíveis, onde podem acontecer reações cruzadas com outros grupos ionizados; ii) aminoácidos cujos protetores são de remoção mais difíceis, necessitando um maior tempo reacional de clivagem e, por fim, iii) em aminoácidos cujos protetores das cadeias laterais são extremamente reativos e podem fazer ligações ou modificações indesejadas em sua cadeia lateral.

Para superar estes problemas, são utilizados na clivagem ácida os chamados scavengers, ou sequestradores de carbocátions, os quais reagem imediatamente com estes grupos, evitando reações colaterais. Quando o peptídeo contém cadeias laterais propensas à alquilação, como sulfidrilas, tioéteres e grupos indol e fenol, é recomendado o uso de uma mistura constituída de diferentes sequestradores de carbocátions com alta nucleofilicidade. Desta forma, entre os scavengers mais utilizados na SPFS, estão o Reagente K (solução de 81,5% de TFA, 5% de tioanisol, 5% de fenol, 5% de água, 2,5% de etanoditiol (EDT) e 1% de triisopropilsilano (TIS), por volume) (KING et al., 1990) – usado para peptídeos que possuem o aminoácido arginina protegido com o grupo 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfonila (Mtr) ou um triptofano desprotegido; uma solução contendo 94% de TFA, 2,5% de água, 2,5 % EDT e 1% de TIS – usada para peptídeos que possuem resíduos de cisteínas protegidos com grupos tritila e metioninas e, por fim, para as demais sequências de aminoácidos, utiliza-se a mistura mais frequentemente empregada, a qual contém 95% de TFA, 2,5% de água e 2,5% de TIS. As misturas utilizadas para a clivagem são chamadas de “coquetéis de clivagem” e são reagidas com as peptidilresinas durante 120 minutos, sob constante agitação e à temperatura ambiente (CHAN e WHITE, 1999; PIRES et al., 2014).

O desenvolvimento da síntese de peptídeos ao final do século XX marcou uma revolução significativa à química de macromoléculas e, como descrito anteriormente, em várias áreas da ciência. Além disso, a maioria dos medicamentos peptídicos comercializados em escala industrial é produzida por métodos químicos e, mais frequentemente, pela SPFS. Entretanto, a metodologia exige o uso de quantidades significativas de solventes

considerados produtos químicos perigosos e potencialmente poluentes, além de tóxicos, como o DMF, NMP, N,N-dimetilacetamida (DMA) e DCM. O alto consumo de solventes é devido a dois fatores principais: primeiro, o grande número de etapas químicas necessárias para produzir um peptídeo e, segundo, as lavagens repetitivas como parte do processo. Como na SPFS não há purificação após cada etapa química, é necessário remover o excesso de reagentes do meio antes de prosseguir para a próxima etapa, e isso é conseguido com extensivas lavagens da resina, as quais geram uma grande quantidade de desperdício e perdas de solvente (LOPEZ et al., 2018). Portanto, estes novos métodos revolucionários trouxeram também questões sérias de poluição, os quais mudam e ameaçam a vida deste planeta.

No início dos anos 90, decorrente a este problema, o campo de pesquisa da Química Verde (ou Green Chemistry), ou química sustentável, surgiu como uma abordagem para reduzir consideravelmente a poluição, levando-se em conta todos os aspectos do processo químico, como a toxicidade dos produtos, solventes, reagentes e catalisadores utilizados, bem como de questões de segurança e a energia necessária para que toda a transformação desejada ocorra de um modo biosustentável (JAD et al., 2019). Os primeiros exemplos da Síntese Verde de Peptídeos em Fase Sólida (SVPFS) foram amplamente relatados por MacMillan et al. (2013) e por Fernando Albericio e colegas nos últimos 10 anos, com vários trabalhos publicados sobre o uso de solventes menos perigosos e prejudiciais ao ambiente, como a água, o tetrahidrofurano (THF), acetonitrila (ACN), 2-metiltetrahidrofurano (2-MeTHF), éter ciclopentilmetílico ou metoxiciclopentano (CPME), acetato de etila (EtOAc) e γ-valerolactona (GVL). Mais recentemente, o uso de N-butilpirrolidona (NBP) foi descrito e avaliado por Lopez et al. (2018) para a síntese de um octapeptídeo linear para a preparação da somatostatina (Octreotida).

Desta forma, pode-se evidenciar na literatura algumas mudanças importantes nas etapas clássicas da SPFS sendo averiguadas para uma possível transição para a Química Verde. No estudo feito por Jad et al. (2016), são relatados protocolos nos quais solventes como o DMF e DCM são completamente eliminados, sendo substituídos por solventes verdes, como o 2-MeTHF e o CPME. Como principal resultado obtido, uma estratégia completa utilizando a Química Verde na SPFS é descrita, fazendo-se uso do 2-MeTHF,

EtOAc e isopropanol para as etapas de acoplamento, remoção do Fmoc e lavagem a temperatura ambiente. Este processo foi aplicado na síntese do pentapeptídeo Aib-encefalina, um peptídeo curto e conhecido por ser constituído de sequências difíceis, as quais dificultam a sua síntese por agregação das cadeias peptídicas. Além disso, estes resultados foram observados numa resina totalmente constituída de polietilenoglicol (PEG – ChemMatrix), considerada um suporte polimérico integrante da Química Verde (JAD et al., 2016).

Posteriormente, em outra investigação, estudou-se a etapa de remoção do Fmoc com estes solventes verdes, pois ainda não se havia atingido um rendimento razoável. Assim, a remoção de Fmoc utilizando uma solução de piperidina a 20% em uma variedade de solventes verdes foram avaliados: N- formilmorfolina, 2-MeTHF, CPME, dimetil isossorbida, EtOAc, dimetilcarbonato, GVL, isopropanol e α,α,α-trifluorotolueno. O desempenho desses solventes durante a desproteção do Fmoc foi comparado ao DMF, que é usado como solvente padrão, principalmente para a remoção do grupo Fmoc. Após avaliação do inchamento das resinas utilizadas (resinas de poliestireno e ChemMatrix) e desproteção de Fmoc para ambas resinas, verificou-se que o solvente GVL apresentou resultados capazes de substituir o DMF pelas etapas de remoção de Fmoc nas duas resinas PS ou ChemMatrix. Além disso, a N- formilmorfolina mostrou um excelente desempenho com a resina de PEG ChemMatrix, viabilizando a utilização de solventes verdes em todas as etapas da SPFS (JAD et al., 2017; KUMAR et al., 2017).

De acordo com o estudo de Přibylka et al. (2019), foi desenvolvido um protocolo de síntese que emprega a base hidróxido de sódio (NaOH) em uma mistura de 2-MeTHF/metanol para a desproteção do grupo Fmoc e utilização unicamente do solvente 2-MeTHF para a etapa de acoplamento. O protocolo foi desenvolvido com a resina mais utilizada, à base de poliestireno/divinilbenzeno. Esta estratégia sintética foi usada para a obtenção do peptídeo Leu-encefalina e os resultados obtidos (pureza bruta de 99%, rendimento de 62%) foram totalmente compatíveis aos alcançados com um protocolo tradicional usando piperidina, DMF e DCM. Assim, conseguiu-se eliminar os solventes mais perigosos para o meio ambiente (DMF e DCM) e reagentes (piperidina) usados na SPFS tradicional e foi feita a substituição pelo

solvente verde 2-MeTHF como solvente de acoplamento único, além de uma solução de NaOH em 2-MeTHF/metanol para etapa de desproteção do Fmoc.

A aplicação de misturas de solventes verdes na SVPFS com combinações de di-hidrolevoglucosenona (Cyrene), sulfolano ou anisol com carbonato de dietila ou dimetila em diferentes proporções, foram testadas por Ferrazzano et al. (2019). A capacidade de inchamento de resinas de poliestireno e polietilenoglicol de funcionalidade diferente foi explorada e a solubilidade de aminoácidos e reagentes de acoplamento foi estudada. Além disso, a síntese do peptídeo modelo Aib-encefalina foi realizada nas novas misturas verdes: em particular, as misturas em volume de Cyrene/carbonato de dietila (30:70), sulfolano/carbonato de dietila (30:70) e anisol/carbonato de dimetil (70:30) apresentaram boas propriedades de intumescimento para as resinas de PS e PEG, independentemente de sua funcionalização terminal. Este fato confirma a possibilidade de substituir completamente o DMF em todo o processo da SPFS tradicional. Em adição, a síntese do peptídeo modelo Aib-encefalina com anisol/carbonato de dimetil numa resina ChemMatrix/Rink Amide exibiu resultados satisfatórios, apresentando uma alta pureza nas análises realizadas por cromatografia líquida de alta performance (CLAE).

Na clivagem, a última etapa da SPFS, também é possível verificar pesquisas científicas buscando alternativas para substituição de solventes ou reagentes menos poluentes, apropriados à Química Verde. No trabalho de Al Musaimi et al. (2018), foi descrita a precipitação de peptídeos brutos com o solvente verde CPME em substituição ao éter dietílico e éter metil terc-butílico, os quais são os solventes mais amplamente utilizados para esta função. Além de suas características ambientais, de saúde e segurança preferíveis, o CPME não apresentou dificuldades de manuseio e demonstrou grande estabilidade em meios ácidos, minimizando a possibilidade da ocorrência de reações colaterais. Como resultados, os peptídeos precipitados com éter dietílico e CPME apresentaram perfis cromatográficos idênticos. Desta forma, esta observação indica que o uso do éter biosustentável não é prejudicial para a qualidade do produto final. Além disso, o CPME e o éter dietílico produziram uma quantidade de massa semelhante de peptídeo precipitado. Portanto, o estudo conclui que o solvente verde CPME pode substituir eficientemente os

éteres dietílicos e terc-butilmetílicos, mais poluentes e perigosos, pela precipitação dos peptídeos após a sua clivagem (AL MUSAIMI et al., 2018).

De maneira geral, a SPFS apresenta-se como uma ferramenta muito útil para obtenção de peptídeos, principalmente da classe dos antimicrobianos, viabilizando a sua aplicação nas diversas áreas do conhecimento. Desta forma, tornar esta técnica mais eficiente, otimizada e ambientalmente limpa é fundamental para que esta metodologia venha a ser empregada em larga escala, sem agredir o meio ambiente e aceita pelos mercados consumidores mais exigentes. Na trilha deste caminho, poderá seguramente ser oferecido uma alternativa natural e promissora para a síntese dos PAMs, resultando em altos rendimentos na sua obtenção e possibilitando um novo e conveniente caminho para uso dos antibióticos como aditivos nutricionais.

Portanto, é possível iniciar mudanças nos protocolos da SPFS tradicional a fim de se alcançar resultados com menores impactos ambientais, o que é algo extremamente visado e demandado atualmente: aliar o progresso e otimização da síntese química, trazendo compostos com atividade biológica natural e alternativa aos convencionais, com a preservação da natureza, por meio da biosustentabilidade, representada nesta seção pela Química Verde.