produção de etanol
A equipe do Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas (LBMP) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (Fcav) da Unesp
construiu algumas bibliotecas metagenômicas com genes 16SrRNA e bibliotecas em vetores capazes de receber grandes fragmentos de DNA. Essas bibliotecas estão sendo usadas para avaliar a diversidade em solos submetidos aos mais variados manejos agrícolas (Figura 4.4) e para a pros- pecção de genes de importância biotecnológica, incluindo genes envolvidos na biossíntese de compostos antioxidantes, enzimas e antibióticos. A sub- -clonagem dos vetores selecionados, contendo os genes de interesse, per- mite o isolamento, sequenciamento e expressão dos genes de que poderão contribuir para a busca de bioprodutos e inovações biotecnológicas.
Figura 4.4 – Fotos dos locais de coleta de solos para análise da diversidade de microrganis- mos e construção de bibliotecas metagenômicas. Em sentido horário: área de solo sob arbo- reto de eucalipto (Unesp); solo cultivado com hortaliças e tomate; área de solo sob floresta nativa (Unesp); solo cultivado (milho, feijão, soja)
Os estudos dos microrganismos dos solos por análise metagenômica realizados pelo grupo de Pesquisa de Bioquímica de Microrganismos e Plantas da Fcav/Unesp revelaram a diversidade bacteriana de solos de flo- restas nativas ou solos submetidos a diversas manipulações, como o cultivo intenso de milho e hortaliças, áreas de pastagens e áreas sob eucalipto, além do tratamento com lodo de esgoto. Nesses estudos, puderam ser observadas
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diferenças nas populações bacterianas e, fundamentalmente, o desapareci- mento de determinado grupos conforme a manipulação sofrida pelos solos: • Silveira, E. L.; Pereira, R. M.; Scaquitto, D. S.; Pedrinho, E. A. N.;
Moraes, S. P. V.; Wickert, E.; Carareto Alves, L. M.; Lemos, E. G. M. Bacterial diversity of soil under eucalyptus assessed by 16S rDNA se- quencing analysis. PAB. v.41, p.1507-1516, 2006. Diaponível Dispo- nível em: <http://www.scielo.br/pdf/pab/v41n10/a08v4110.pdf>; • Pereira, R. M.; Silveira, E. L.; Scaquito, D.C.; Pedrinho, E. A. N.;
Moraes, S. P. V.; Wickert, E.; Carareto Alves, L. M.; Lemos, E. G. M. Molecular characterization of bacterial populations of different soils.
Braz. J. Microbiol. v.37, p.439-447, 2006. Disponível em: <http:// www.scielo.br/pdf/bjm/v37n4/v37n4a07.pdf>;
• Pereira, R. M.; Silveira, E. L. da; Carareto Alves, L. M.; Lemos, E. G. de M. Avaliação de populações de possíveis rizobactérias em so- los sob espécies florestais. Revista Brasileira de Ciência do Solo. v.32, p.1921-1927, 2008. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/ rbcs/v32n5/13.pdf>;
• Pedrinho, E. A. N.; Lemos, E. G. M.; Pereira, R. M.; Silveira, E. L.; Carareto Alves, L. M.; Wickert, E.; Valarini, M. J. Avaliação do impac- to do lodo de esgoto na microbiota do solo utilizando o gene 16S rRNA.
Arq. Inst. Biol. (Impresso). v.76, p.443-448, 2009. Disponível em: <http://www.biologico.sp.gov.br/docs/arq/v76_3/pedrinho.pdf>; • Val-Moraes, S. P.; Valarini, M. J.; Ghini, R.; Lemos, E. G. M.; Ca-
rareto Alves, L. M. Diversidade de bactérias do solo sob vegetação nativa e cultivo de hortaliças. Cienc. Agron. (UFC. Impresso). v.40, p.7-16, 2009. Disponível em: <http://www.ccarevista.ufc.br/seer/ index.php/ccarevista/article/viewFile/397/293>;
• Val-Moraes, S. P.; Marcondes, J.;, Carareto Alves, L. M.; Lemos, E. G. M. Impact of sewage sludge on the soil bacterial communities by DNA microarray analysis. World Journal of Microbiology & Bio-
technology. p.DOI: 10.1007/s, 2011. Disponível em: <http://www. springerlink.com/content/d666852488r35335/fulltext.pdf>.
Nesses trabalhos, a metodologia básica utilizada consistiu em se isolar o DNA metagenômico, fazer uma reação de PCR com essas amostras meta- genômicas, clonar os fragmentos obtidos, sequenciar e comparar os resul- tados com o banco de dados, segundo o esquema a seguir.
O DNA metagenômico extraído de diferentes solos apresentou frag- mentos com alto tamanho molecular (Figura 4.5A), o que pode ser conse- guido através da utilização de kits comerciais específicos. Esse material foi, então, submetido à reação de amplificação com oligonucleotídeos específi- cos para o gene 16SrRNA (Kuske et al., 1997) gerando, assim, um conjunto de fragmento com 1500pb (Figura 4.5B). Os fragmentos da PCR foram in- seridos em vetor plasmídico, clonados em Escherichia coli, sendo as células transformadas selecionados em meio de cultivo contendo IPTG e X-Gal (Figura 4.5C). A inserção do fragmento de DNA dá-se na região do gene
lacZ responsável pela síntese de -galactosidase que quebra o substrato X-gal, originando coloração azul. Por essa metodologia as células que recebe- ram o inserto formam colônias brancas uma vez que não são mais capazes de sintetizar a -galactosidase, e as que não receberam formam colônias azuis.
Figura 4.5 – Resultados da metodologia aplicada para análise da diversidade de microrga- nismos por abordagem metagenômica. A) eletroforese de DNA metagenômico; B) eletrofo- rese do produto de amplificação do DNA metagenômico com oligonucleotídeos específicos para o gene 16S rRNA; C) placas contendo clones transformados com plasmídeos contendo amplicons do gene 16Sr RNA.
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Os clones obtidos puderam ser utilizados para a análise da diversidade das amostras ambientais através do sequenciamento dos fragmentos clo- nados e da técnica de microarranjo de DNA. Demonstrando, assim, que a diversidade bacteriana dos solos submetidos a diferentes tratamentos pode ser alterada, alguns microrganismos desaparecem e outros aumentam sua população. Em diversas situações essa alteração populacional pode signi- ficar perda de elementos importantes de um ambiente ou aparecimento de organismos de modo desequilibrado.
Um aspecto que está sendo estudado atualmente, e também com as fer- ramentas da metagenômica, é a avaliação da interferência da cana de açúcar na microbiota dos solos. Assim, essa abordagem foi aplicada para um estu- do da diversidade através da clonagem e do sequenciamento de fragmentos 16S rDNA de dois sistemas de solo no estado de São Paulo: 1) mata nativa e 2) cultura da cana. Fragmentos 16S rDNA foram amplificados e clonados em vetor pGEM-T easy, permitindo o posterior sequenciamento de DNA e análise da comunidade do grupo Bacteria.
As sequências FASTA obtidas foram analisadas e comparadas com o GenBank do Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI), e análises filogenéticas foram realizadas utilizando o programa Bionume- rics (6.0.1 – AppliedMaths) baseados em sequências alinhadas. Os dados revelaram que, em comunidades do solo da floresta eram predominantes Acidobacterium, Verrucomicrobium, Proteobacterium, Firmicutes, Ac- tinobacterium, enquanto no solo das culturas de cana foram encontrados Firmicutes e Proteobacterium.
O uso de ferramenta da metagenômica é um avanço real para compreen- der a função e como interagem os membros de uma comunidade microbia- na complexa, assim como isolar genes de interesse biotecnológico (Streit; Schmitz, 2004; Handelsman, 2004). As análises metagenômicas, além de possibilitarem a observação dos microrganismos de um habitat que ainda não se consegue cultivar, possibilitam a obtenção de clones com genes codi- ficadores das mais diversas substâncias encontradas na natureza.
A metodologia de construção de bibliotecas genômicas, que envolve a geração e clonagem de fragmentos de DNA de alto tamanho molecular em vetores apropriados, e a prospecção de genes de interesse, tem sido utilizada exaustivamente por mais de três décadas. A clonagem de DNA metagenô- mico, entretanto, foi pela primeira vez reportada na metade da década de
1990, com a construção de uma biblioteca de metagenoma marinho (Stein et al., 1996).
Nos últimos anos, observou-se um progresso significante na metagenô- mica, que começa a proporcionar um entendimento substancial das fun- ções da comunidade microbiana natural (Ward, 2006), assim como uma utilização biotecnológica para seus resultados.Visto que a ampla diversida- de microbiana do solo e de várias comunidades constitui-se de um enorme
pool genético e biológico que pode ser explorado para a descoberta de novos genes, vias metabólicas inteiras e seus produtos (Cowan et al., 2005).
Várias abordagens do uso de técnicas moleculares têm sido realizadas para a utilização de genes e organismos transformados para a utilização da biomassa como fonte de energia. Uma abordagem metagenômica a partir de DNA metagenômico dos microrganismos de rúmem de bovinos iden- tificou mais de 20 mil genes com características de genes envolvidos no metabolismo de carboidratos e 90 proteínas, sendo 57% delas ativas contra substratos celulolíticos (Hess et al., 2011)
A metagenômica tem sido utilizada com sucesso em todas as escalas: para análises filogenéticas, para o estudo de genes (Streit; Schmitz, 2004; Voget et al., 2003; Ferrer et al., 2005), vias biossintéticas complexas (Brady et al., 2001; Gillespie et al., 2002; Courtois et al., 2003; Lim et al., 2003) para a descrição do metabolismo de bactérias desconhecidas (Tyson et al., 2004) e para estudo de comunidades microbianas contidas em diversas amostras específicas como biofilmes e consórcio de bactérias contidas em culturas de enriquecimento (Tyson et al., 2004; Knietsch et al., 2003). Muitos ambien- tes são focos da metagenômica, incluindo solos (Rondon et al., 2000; Cour- tois et al., 2003), cavidade oral (Diaz-Torres et al., 2003), rumem (Ferrer et al., 2005), habitats aquáticos (Kim; Fuerst, 2006), entre outros.
Estratégias diferentes para a construção de bibliotecas metagenômicas variam conforme a intenção do estudo. Bibliotecas que contêm grandes in- sertos de DNA ambiental são construídas principalmente em vetores cos- mídeos (Courtois et al., 2003), fosmídeos (Ginolhac et al., 2004) e BAC (Rondon et al., 2000), e permitem identificação e exploração de genes e vias biossintéticas complexas. Vetores com alto número de cópias e que acei- tam insertos pequenos também são utilizados pela facilidade de obtenção de DNA plasmidial suficiente para análises baseadas em sequência (Tyson et al., 2004).
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A pesquisa da biblioteca metagenômica pode ser feita de diversas for- mas e, tipicamente, envolve hibridização com uma sonda para o gene de interesse. O sequenciamento de todos os clones da biblioteca e posterior análise genômica ou a análise da expressão de DNA heterólogo dos clones da biblioteca são técnicas eficientes, porém muito trabalhosas.
Recentemente, formatos de microarranjos têm sido desenvolvidos e avaliados para detecção de genes e análises da comunidade microbiana em ambientes complexos. Esses estudos indicam que tecnologias baseadas em microarranjos genômicos possuem grande especificidade, sensitividade e potencial quantitativo, tornando-se uma ferramenta paralela de alto ren- dimento para detecção de genes em amostras ambientais (Wu et al., 2001; Zhou, 2003).
No LBMP estão sendo pesquisados genes relacionados a diversas áreas de interesse biotecnológico através da construção de bibliotecas metagenô- micas. Entre essas pesquisas pode ser citada a prospecção de genes de inte- resse na produção de etanol a partir da biomassa.
A enzima xilose isomerase catalisa a conversão reversível da D-xilose e D-glicose para D-xilulose e D-frutose, respectivamente. Xilose é o segun- do carboidrato mais abundante na natureza, e a fermentação comercial des- se composto para a produção de etanol pode representar uma alternativa de aumento da produtividade para o futuro. Nos processos industriais de fer- mentação, a levedura Saccharomy cescerevisiae é comumente utilizada para produção de etanol. A levedura selvagem fermenta prontamente glicose, mas não é capaz de metabolizar xilose. Apenas uma pequena parcela de bactérias, leveduras e fungos filamentosos são naturalmente capazes de fer- mentar xilose. Neste trabalho foi realizada a prospecção de novos genes de xilose isomerase em bibliotecas metagenômicas e em isolados de Burkhol- dérias através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Não foi possível recuperar genes oriundos das bibliotecas metagenômi- cas. Dos treze isolados de Burkholdérias testados, seis apresentaram am- plificação positiva para o gene de xilose isomerase (Figura 4.6). Os genes foram completamente sequenciados e as sequências foram utilizadas em análises computacionais, que permitiram estabelecer a identidade entre as sequências e a dedução da função das proteínas baseadas em similaridades. Esses genes estão sendo utilizados em ensaios de expressão, para caracteri- zação das novas enzimas, considerando que essas sequências representam
proteínas que formam um grupo distinto quando comparado com outras enzimas do banco de dados.
Do mesmo modo, estão sendo analisados nas bibliotecas metagenô- micas genes envolvidos na degradação do amido e da celulose. Os genes envolvidos na degradação do amido estão sendo prospectados a partir de reação de PCR e os da celulose, pesquisados a partir da análise funcional dos clones, duas formas frequentes de se prospectar genes de interesse em bibliotecas metagenômicas.
Atualmente, a colheita da cana-de-açúcar sem a utilização do fogo para despalha (cana crua) vem crescendo gradualmente devido à pressão da so- ciedade contra as queimadas e às vantagens agronômicas da permanência da palha no campo. Essa mudança elevou a utilização de máquinas para a realização da colheita, aumentando a quantidade de matéria verde (folhas) que chega à indústria. Esse aumento trouxe desvantagens para as usinas, uma delas é a presença do amido no caldo da cana-de-açúcar, que, em altas concentrações, pode interferir negativamente no processo de fabricação do açúcar, pois as extremidades da cana-de-açúcar, bem como as folhas, são ricas em amido.
O amido pode causar vários problemas durante o refino do açúcar, in- terferindo no processo de filtração e cristalização, proporcionando turbidez visível durante a dissolução do açúcar em água, além de reduzir drastica- mente o rendimento. Esses problemas decorrentes da presença do amido podem fazer com que a indústria tenha prejuízos durante a produção do açúcar. Para eliminação do amido, recomenda-se a aplicação de enzimas -amilases, essas enzimas agem hidrolisando as ligações alfa1-4 (presentes entre as moléculas de glicose das cadeias de amido).
As enzimas amilases atualmente disponibilizadas no mercado são co- mercializadas por um custo elevado e, portanto, precisam ser utilizadas de forma bem controlada. Desse modo, o desenvolvimento de novos processos de produção da amilase pode levar tanto à diminuição dos custos como à obtenção de produtos com características especiais importantes para o uso em grande escala.
Considerando-se essa abordagem, a obtenção de genes envolvidos na sín- tese de enzimas degradadoras de amido é de grande importância biotecnoló- gica na atualidade. No LBMP (Milena Tavares, comunicação pessoal) estão sendo prospectados genes envolvidos na degradação de amido em bibliote-
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Figura 4.6 – Análise filogenética da sequência de aminoácidos do gene de xilose isometa- se. A reconstrução filogenética foi computada pelo método de distância, utilizando a ma- triz PAM, e o método neighbor-joining de construção de filogramas, com 1000 bootstraps. O número de substituições de aminoácidos é proporcional ao comprimento da escala. As sequências obtidas neste trabalho estão ilustradas em vermelho. Os números de acesso das sequências oriundas dos bancos de dados estão em parênteses ao lado do nome das linha- gens. (Viviane Schuk, comunicação pessoal)
cas metagenômicas. Na Figura 4.7, pode-se observar a presença de ampli- ficação gênica em biblioteca metagenômica construída a partir de DNA de solo cultivado com cana-de-açúcar, esse material esta sendo sequenciado e a sequência gênica de interesse deverá ser estudada in silico e clonada em vetores de expressão para a avaliação de suas características enzimáticas.
Figura 4.7 – Perfil eletroforético de uma amplificação por PCR partindo de 70 ng de DNA Fosmidial obtidos de trinta pools de 96 clones de fosmídeos utilizando primers específicos para a amilase. As amplificações intensas correspondem às placas 07 e 17.
Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e de- sempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares que ajudam na mi- neralização da matéria orgânica, liberação de carbono e nutrientes na forma em que são assimilados. Devido a esses importantes fatores, é que cada vez mais aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo.
A celulase pertence a essa classe de enzimas, ela é formada por um com- plexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose através da quebra da ligação ,1-4. A partir disso, foi realizada uma busca de gene relacionado com a hidrólise da celulose em biblioteca metagenômica de DNA extraído
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de solo de arboreto de eucalipto. Foram realizados testes bioquímicos e mo- leculares, partindo de um par de oligonucleotídeos iniciadores degenerados que foi construído para identificar o gene da glucanase que está ligado à hidrólise da celulose.
Com o teste bioquímico foi possível selecionar clones que estão rela- cionados com hidrólise da celulose (Figura 4.8), a confirmação dos clones positivos foi feita através de reações de PCR. Após a escolha do clone, foi feita uma sub-biblioteca, os clones dessa biblioteca foram sequenciados e através desse sequenciamento foi possível encontrar gene relacionado à hi- drólise da celulose (Rodrigues, 2009).
Figura 4.8 – Placas A, B e C contendo clones da biblioteca metagenômica cultivados em meio contendo vermelho congo. Resultados positivos para hidrólise da celulose puderam ser observados através da formação do halo “amarelo” ao redor dos clones que estão indicados pelas setas. (Rodrigues, 2009)
O sequenciamento dos clones da sub-biblioteca foram feitos para encon- trar genes relacionados a hidrólise da celulose, as sequências foram analisadas pelo pacote phredPhrap/Consed. Foram sequenciados 864 clones dos 1.344 clones da subbiblioteca, entre os 864 clones, o inserto sequenciado possui aproximadamente 40.000pb e foram gerados 305 contigs (Rodrigues, 2009).
A anotação dos genes foi realizada de forma manual através da utilização do programa Artemis Release 10. A sequência de aminoácidos em formato FASTA foi submetida ao banco de genes do National Center for Biotech-
nolgy Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), atra- vés do programa BLASTP, para comparação com sequências homólogas de proteínas depositadas no banco de dados. Todos os 305 contigs foram analisados e foi encontrado resultado positivo nos contigs 33,109 e 184 (ibi- dem). As possíveis proteínas foram identificadas pelo programa Artemis e sua provável classificação funcional está na Tabela 4.1.
Tabela 4.1 – Relação dos possíveis genes relacionados a hidrólise da celulose.
Contigs Função proposta de possíveis proteínas similares Bactéria fonte da proteína similar Similaridade/ Identidade (%) no de acesso proteína similar
Contig 33 cellulose synthase operon protein YhjU
Salmonella enterica subsp. 80/87 YP_02660285.1| hypothetical protein EcolC_0178 Escherichia coli ATCC 8739 94/95 YP_001723187 Contig 109 PTS system, N,N’-diacetylchitobiose- specific IIC component
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483 95/93 YP_02664041.1 Contig 184 PTS system, N,N’- diacetylchitobiose-
specific IIC component
Salmonella
enterica subsp.
enterica serovar Agona str. SL483
95/93 YP_02664041.1
No contig 33, observou-se similaridade da sequência com a de uma proteína do operon da celulose sintase. O fragmento possui 753 bases e 250 aminoácidos e não apresenta domínio conservado, mas sabe-se que dois genes são codificados e que sua função é atribuída à hidrólise de celulose insolúvel, os genes são: celulose 1,4–betacellobiosidase (celK) e betagluco- sidase (bglH).
Os contigs 109 e 184 apresentaram a formação de dois fragmentos que se complementam e formam a proteína PTS (Figura 4.9), esses fragmentos têm 705 bases e 234 aminoácidos e 679 bases e 226 aminoácidos. O sistema PTS, que é uma fosfotransferase, responsável pelo transporte e fosforilação de carboidratos, é acoplado ao PEP (fosfoenolpiruvato). Também é respon- sável pela “quebra” de moléculas grandes e insolúveis em água como é o caso da celulose. O sistema utiliza parte do carbono liberado pela quebra dos compostos nas ligações -1,4.
O sistema PTS é bem complexo e conta com auxílio de dois conjuntos de enzimas, enzima I (EI) e HPr, e enzima II (EII) que é formada por três domínios A, B e C. Os domínios encontrados no contig 109 e 184 estão relacionados com II C, essa enzima é responsável pela proteção integral da membrana. Além disso, as sequências encontradas apresentam domínios relacionados ao sistema PRK e genes cel B e cel D (Figura 4.6). PRK é um domínio no qual o sistema PTS atua, mas nesse caso ele quebra a estrutura da quitina. Por outro lado, os genes cel B e cel D fazem parte de um operoncel,
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que é composto por cinco genes ce lA, cel B, cel C, celD, e cel F. O gene cel
B codifica um produto que é requerido para o transporte e a fosforilação de celobiosefosfoenolpiruvato-dependente, e cel D codifica um repressor do transporte (Rodrigues, 2009).
Figura 4.9 – Esquema das sequências do contig 109 após ser submetido ao BLASTP.
Outra abordagem que se pode ter através dos estudos metagenômicos é quando se inicia a pesquisa de genes a partir de uma cultura enriquecida de microrganismos. Dessa forma, está sendo realizada pesquisa de genes de interesse na desconstrução de biomassa a partir de consórcios microbia- nos degradadores de biomassa. Um conjunto de microrganismos (consór- cio) foi isolado de solos com resíduos de cana. Esse consórcio está sendo mantido no LBMP, em meios de cultivo contendo bagaço de cana ou ce- lulose, como fonte de carbono (Maria Luiza M. de Almeida, comunicação pessoal).
Através de análises metagenômicas os constituintes desse consócio es- tão sendo estudados, assim como o DNA metagenômico dele possibilitará o isolamento de um conjunto de genes que permitirão a desconstrução da biomassa e sua utilização para a produção de etanol. Observaram-se por análises microbiológicas que esse conjunto bacteriano produz celulase e amilase (Figura 4.10), dessa forma os genes codificadores dessas enzimas deverão ser isolados e clonados em vetores de expressão para posterior estu-