Faculdade de Farmácia
O PARADIGMA DA INFEÇÃO POR PLASMODIUM FALCIPARUM EM MULHERES GRÁVIDAS SEROPOSITIVAS PARA HIV: A PREVENÇÃO DA
TRANSMISSÃO VERTICAL E A INFEÇÃO CONGÉNITA
Catarina Rafaela Jacinto Alves
Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Quirina dos Santos Costa e coorientado pela Doutora Isabel Moutinho e pela Doutora Teresa Porta Nova
Mestrado em Análises Clínicas
v
Prefácio
Sabendo que as áreas da Biologia e Química eram as que mais me suscitavam interesse, licenciei-me no curso de Bioquímica pela Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, que me deu bases nas mais variadas áreas da Ciência. Ao longo dos três anos ganhei experiência laboratorial nos campos da Bioquímica e Química analítica, Biologia celular e Microbiologia, bem como conhecimentos teóricos noutras áreas como a Imunologia, Biologia molecular e Enzimologia. Como o plano de estudos não engloba um estágio final curricular, decidi procurar estágios voluntários de modo a ter um contacto direto com o mundo profissional, que me permitiram adquirir uma visão mais real da área em que pretendia trabalhar, nomeadamente no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, onde ganhei bastante interesse na área da saúde. Desta forma, ingressei no mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, cujo plano curricular é convidativo e enriquecedor, apresentando o que necessito para complementar os meus conhecimentos e mais tarde trabalhar na área que gosto e com que me identifico. O presente relatório diz respeito ao estágio curricular realizado no âmbito do mestrado.
Quanto à organização, o presente relatório encontra-se dividido em quatro partes: na Parte I apresentam-se o prefácio, o resumo em português e inglês, índices e lista de abreviaturas; na Parte II expõe-se o relatório de estágio, em que é feito um resumo dos locais de estágio, expondo os conhecimentos adquiridos nos mesmos, para as valências de Pré-Analítica, Bioquímica, Microbiologia e Genética. A parte III diz respeito à monografia, desenvolvida no âmbito da valência de Microbiologia, com o título “O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita”. Por último, na Parte IV, apresentam-se as conclusões e perspetivas futuras.
Este relatório está de acordo com o disposto no Artigo 37.º do Regulamento Geral do Ciclo de Estudos conducente ao Grau de Mestre da FFULisboa, nº 134/2016, DR, 2.ª série — N.º 26, de 8 de fevereiro de 2016.
vi
Resumo
O estágio descrito neste relatório integra o plano de estudos do Mestrado em Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Foi realizado no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz relativamente às áreas de Pré-Analítica, Microbiologia e Bioquímica. A valência de Genética foi desenvolvida no Laboratório GenoMed – Diagnósticos de Medicina Molecular.
Este relatório de estágio resume a experiência e conhecimento adquiridos ao longo de cerca de seis meses e expõe quais os produtos biológicos necessários à execução dos respetivos parâmetros analíticos, bem como metodologias aplicadas aos mesmos. Refere ainda como o Controlo de Qualidade Interno foi implementado e como a Avaliação Externa da Qualidade foi interpretada nas várias áreas de estudo.
A realização e duração total do estágio permitiu-me não só colocar em prática os conhecimentos obtidos nas unidades curriculares do mestrado, como realizar novas aprendizagens fundamentais para a prática profissional.
Neste documento é também apresentada uma revisão bibliográfica acerca do tema: o paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita.
vii
Abstract
The internship described in this report integrates the study plan of the Masters in Clinical Analysis by the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon. It was carried out in the Laboratory of Clinical Pathology of Hospital da Luz with respect to the areas of Pre-Analytical, Microbiology and Biochemistry. The Genetic valence was developed in GenoMed – Diagnostics of Molecular Medicine.
This internship report summarizes the experience and knowledge acquired over six months. It refers to the biological products needed to implement the respective analytical parameters, as well as the applied methodologies. It refers also to how the Internal Quality Control was implemented and how the External Quality Assessment was interpreted in the various areas of study.
The execution and total duration of the internship has allowed me to not only put into practice the knowledge obtained in the Master’s degree units, but also to obtain new learning of great importance to the professional practice.
In this document is also presented a bibliographic reviw on the theme: The paradigm of Plasmodium falciparum infection in HIV-positive pregnant women: prevention of vertical transmission and congenital infection.
viii
Agradecimentos
Inicialmente, agradeço a todos os docentes e convidados pelos conhecimentos fornecidos ao longo do Mestrado em Análises Clínicas.
Expresso o meu especial agradecimento à Professora Doutora Quirina dos Santos Costa pela sua orientação, disponibilidade, apoio e atenção dispensada.
Agradeço à Dra. Teresa Porta Nova pela oportunidade de realização do estágio na GenoMed e aos técnicos das várias secções do laboratório, por tudo o que me ensinaram e deram a conhecer. Da mesma forma, agradeço à Dra. Isabel Moutinho e aos responsáveis e técnicos das várias áreas do laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz, por todo o apoio e contribuição para que o estágio resultasse numa excelente experiência a nível de formação e pessoal.
Não podia deixar de agradecer à minha família e amigos por todo o carinho, conselhos e apoio incondicional, com especial agradecimento aos meus pais por todo o esforço que fizeram para que pudesse concluir os meus estudos. Sem vocês, nada disto seria possível. Um grande Obrigado!
ix
Lista de Abreviaturas
Parte II
Relatório de Estágio
ABL1 –Abelson murine leucemia viral oncogene homolog 1
ADA – Associação Americana de Diabetes (do inglês, American Diabetes Association) ADN – Ácido desoxirribonucleico
ADNc – Ácido desoxirribonucleico complementar ADP – Difosfato de adenosina
AE – Tampão de eluição
AEQ – Avaliação Externa da Qualidade
AgHBs - Antigénio de superfície do vírus da Hepatite B AGJ - Anomalia da Glicemia de Jejum
AL – Tampão de lise ALP – Fosfatase alcalina
ALT – Alanina aminotransferase ARN – Ácido ribonucleico
AST – Aspartato aminotransferase ATL – Tampão de lise tecidular ATP – Trifosfato de adenosina
BCR – Breakpoint cluster region gene BE – Excesso de bases
BHI - Caldo Coração – Cérebro BNP - Péptido natriurético cerebral
BRAF – v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B Ca2+ - Ião cálcio
CAM – Gelose Campylosel Cl- - Ião cloro
CLED – Gelose Cistina Lactose Deficiente em Eletrólitos CK – Creatina quinase
CK-MB – Isoenzima MB da creatina quinase
x
CO2 – Dióxido de carbono
CPNPC - Carcinomas de pulmão de não pequenas células CPPC - Carcinomas de pulmão de pequenas células CQI – Controlo de Qualidade Interno
DAPI - 4,6-diamidino-2-fenilindol
DGF – Doenças Genéticas e Farmacogenética DGS – Direção-Geral da Saúde
DMG – Diabetes mellitus gestacional DMSO – Dimetilsulfóxido
dNTP –Desoxirribonucleótidos trifosfato ddNTPs – Didesoxirribonucleótidos trifosfato DRM – Doença residual mínima
DTT – Ditiotreitol
EAM – Enfarte agudo do miocárdio EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético EGFR – Epidermal growth factor receptor gene
EIA – Ensaio imunoenzimático (do inglês, enzyme immunoassay)
ELFA – Ensaio enzimático fluorescente (do inglês, enzyme linked fluorescent assay) EMN - Rede Europeia do Mieloma (do inglês, European Myeloma Network)
EMQN - Rede Europeia de Qualidade Genética Molecular (European Molecular Genetics Quality Network)
Fem – Força eletromotriz
FISH – Hibridação in situ de fluorescência (do inglês, fluorescence in situ hybridization) GGT – γ-glutamil transferase
GHEP-ISFG - Grupo de Línguas Espanhola e Portuguesa da Sociedade Internacional de Genética Forense
GN – Gram negativo(s) GP – Gram positivo(s)
GS – Gelose Columbia + 5% de sangue de Carneiro H2S – Sulfeto de hidrogénio
HAE2 - Gelose Chocolate Haemophilus 2
HBV – Vírus da hepatite B (do inglês, hepatitis B virus) hCG - Gonadotropina coriónica humana
xi HDL – Lipoproteína(s) de alta densidade (do inglês, high density lipoprotein)
HEKT – Gelose Hektoen
HFE – Proteína da Hemocromatose Hereditária HH – Hemocromatose Hereditária
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês, Human Immunodeficiency Virus) HK - Hexoquinase
HM – Módulo de imunoensaio heterogéneo
HRP-II – Proteína rica em histidina II (do inglês, histidine rich protein II) IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
iMM - Instituto de Medicina Molecular
IMT – Tecnologia do Multisensor Integrado (do inglês, Integrated Multisensor Technology)
iQM – Controlo de Qualidade inteligente (do inglês, intelligent Quality Management) ISCN - Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética Humana (do inglês, International System for Human Cytogenetic Nomenclature)
ISO – Organização Internacional de Normalização (do inglês, International Organization for Standardization)
K+ - Ião potássio
KCl – Cloreto de potássio
KRAS – Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog Lac - Lactose
LBA – Lavado bronco-alveolar LCR – Líquido cefalorraquidiano LDH – Lactato desidrogenase LLA – Leucemia Linfocítica Aguda LMC – Leucemia Mielóide Crónica
LOCI – Módulo de imunoensaios homogéneos de alta sensibilidade
MAP –Proteínas ativadas por mitogénios (do inglês, Mitogen Activated Protein) MCK - Gelose MacConkey
MgCl2 – Cloreto de magnésio
MRSA - Staphylococcus aureus meticilina-resistentes (do inglês, methicillin-resistant Staphylococcus aureus)
xii
Na+ - Ião sódio
NAD - Nicotinamida adenina dinucleótido
NADH – Forma reduzida de nicotinamida adenina dinucleótido
NADPH - Forma reduzida de fosfato nicotinamida adenina dinucleótido
NCEP – ATP III – Programa Nacional de Educação sobre o Colesterol – Painel de Tratamento de Adultos III (do inglês, National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III)
UK - NEQAS – Serviço Nacional de Avaliação Externa da Qualidade do Reino Unido (do inglês, The United Kingdom National External Quality Assessment Service)
NS1 – Glicoproteína não estrutural 1
NT-proBNP - N-terminal pro-péptido natriurético cerebral PBD – PBS + octilfenoxipolietoxietanol
PBS –Tampão fosfato-salino
ρCO2 - Pressão parcial de dióxido de carbono
PCR – Reação em cadeia da polimerase (do inglês, polymerase chain reaction) pH – Potencial de hidrogénio
Ph – Cromossoma Filadélfia
pLDH – Lactato desidrogenase de Plasmodium
PNAEQ - Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade ρO2 – Pressão parcial de oxigénio
PTGO – Prova de tolerância à glicose oral PVX - Gelose Chocolate + PolyViteX
QCMD – Controlo de Qualidade para o Diagnóstico Molecular (do inglês, Quality Control for Molecular Diagnosis)
RAS – Vírus do Sarcoma de Rato RCLB –Tampão de lise de eritrócitos RMM – Resposta Molecular Major RN – Recém-nascido(s)
RQ-PCR – Reação em cadeia da polimerase em tempo real (do inglês, real time polymerase chain reaction)
RSV – Vírus sincicial respiratório (do inglês, Respiratory Syncytial Virus)
RT-PCR – Reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (do inglês, reverse transcriptase polymerase chain reaction)
xiii SIDA - Síndrome da imunodeficiência adquirida
SNC – Sistema nervoso central SSC - Citrato sódio salino T3 - Tiroxina
T4 - Triiodotironina
TA – Temperatura ambiente
Taq – Polimerase de ADN termo-estável TBE – Tris-Borato-EDT
tcdB - Gene que codifica a toxina B de Clostridium difficile TCO2 - Dióxido de carbono total
TDG - Tolerância diminuída à glicose TE – Tris-EDTA
TFG – Taxa de filtração glomerular TKI – Inibidor de tirosina quinase
TOOD - Caldo Todd-Hewitt + antibióticos TPA - 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato
TSA – Teste(s) de suscetibilidade aos antibióticos TSH – Hormona estimulante da tiróide
UFC – Unidades formadoras de colónias UV – Ultravioleta
VCA - Gelose Chocolate PolyViteX VCAT3 VP6 – Proteína viral 6
VRE – Enterococcus spp. vancomicina-resistentes (do inglês, vancomycin-resistant Enterococcus)
xiv
Parte III
O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita
AMA – Antigénio de membrana apical
ACT – Terapia combinada com artemisina (do inglês, artemisinin-based combination therapy)
ARN – Ácido ribonucleico
ART – Terapia antirretroviral (do inglês, antiretroviral therapy) CCR5 – Recetor de quimiocinas tipo 5
CDC - Centro de Controlo e Prevenção de Doenças (do inglês, Centers for Disease Control and Prevention)
CSA – Sulfato de condroitina A CTX – Cotrimoxazole
DDT - Diclorodifeniltricloroetano EBA – Antigénio de ligação ao eritrócito GPI – Glicosilfosfatidilinositol
HAART - Terapia antirretroviral altamente ativa (do inglês, highly active antiretroviral therapy)
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês, Human Immunodeficiency Virus) IL – Interleucina
INF-γ – Interferão gama
IPT – Tratamento preventivo intermitente (do inglês, intermittent preventive treatment) IPTp – Tratamento preventivo intermitente na gravidez (do inglês, intermittent preventive treatment in pregnancy)
IRS – Pulverização residual intra-domiciliária (do inglês, indoor residual spraying) ITNs – Redes tratadas com inseticidas (do inglês, insecticide-treated bednet) LIF – Fator inibidor de leucemia (do inglês, leukemia inhibitory factor)
MIP - Proteína inflamatória de macrófagos (do inglês, macrophage inflammatory protein) MSP - Proteína da superfície do merozoito (do inglês, merozoite surface protein)
(NANP)5 – 5 repetições da sequência de aminoácidos da proteína circunsporozoíta NRTIs - Inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleótidos (do inglês, nucleoside reverse transcriptase inhibitors)
xv NNRTIs - Inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleótidos (do inglês, non -nucleoside reverse transcriptase inhibitors)
PCR – Reação em cadeia da polimerase (do inglês, polimerase chain reaction) PIs – Inibidores de protease (do inglês, protease inhibitors)
RANTES – Ligando do receptor de quimiocinas 5 (do inglês, Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)
RAP - Proteína associada a róptrias (do inglês, rhoptry associated protein) RDTs – Testes de diagnóstico rápido (do inglês, rapid diagnostic tests) SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida
SP – Sulfadoxina-pirimetamina TDF - Tenofovir disoproxil fumarato TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
VSAs – Antigénios variantes de superfície (do inglês, variant surface antigens) WHO – Organização Mundial de Saúde (do inglês, World Health Organization)
xvi
Índice Geral
Parte I………..……iii Prefácio ... v Resumo ... vi Abstract ... vii Agradecimentos ... viii Lista de Abreviaturas ... ixÍndice Geral ... xvi
Índice de Figuras ... xx
Índice de Tabelas ... xxii
Parte II………..1 Relatório de Estágio……….3 1.Introdução ... 3 2.Fase Pré-Analítica ... 5 2.1.Procedimentos de colheita ... 6 2.2.Triagem ... 10
2.3.Conservação das amostras ... 11
Gestão de Resíduos ... 13
3.Bioquímica ... 14
3.1.Equipamentos ... 14
3.2.Metabolismo dos hidratos de carbono ... 19
3.3.Metabolismo dos lípidos ... 22
3.4.Proteínas ... 26
3.5.Resposta inflamatória ... 27
3.6.Função renal ... 28
xvii
3.8.Função pancreática e gastrointestinal ... 41
3.9.Função cardíaca ... 43
3.10.Função tiroideia ... 49
3.11.Fármacos ... 50
3.12.Aparelho reprodutor ... 57
3.13.Metabolismo ósseo e mineral ... 60
3.14.Equilíbrio ácido-base ... 64
3.15.Equilíbrio hidro-eletrolítico ... 66
3.16.Sistema nervoso central ... 68
3.17.Controlo de Qualidade em Bioquímica Clínica ... 70
4.Microbiologia ... 72
4.1.Equipamentos ... 72
4.2.Bacteriologia ... 74
4.2.1.Exame direto ... 75
4.2.2.Exame cultural ... 76
4.2.3.Geradores de atmosfera e caixas de incubação ... 79
4.2.4.Procedimentos para diagnóstico bacteriológico ... 80
4.2.5.Identificação de bactérias ... 94
4.2.6.Testes de suscetibilidade aos antibióticos ... 104
4.3.Micologia ... 105
4.3.1.Meios de cultura ... 106
4.3.2.Procedimentos para diagnóstico micológico ... 107
4.3.3.Identificação de fungos e leveduras ... 109
4.4.Parasitologia ... 111
4.4.1Procedimentos para diagnóstico parasitológico ... 112
4.5.Virologia ... 115
4.5.1.Procedimentos para diagnóstico virológico ... 116
4.6.Controlo de Qualidade em Microbiologia ... 122
5.Genética ... 124
5.1.Doenças Genéticas ... 124
xviii 5.1.2.Análise e relatório ... 130 5.1.3.Exemplo de aplicação ... 130 5.2.Citogenética ... 131 5.2.1.Métodos ... 132 5.2.2.Exemplo de aplicação ... 139
5.3.Hemato-oncologia - Biologia Molecular ... 140
5.3.1.Leucemia Mielóide Crónica ... 140
5.3.2.Métodos ... 141
5.4.Tumores Sólidos ... 145
5.4.1.Cancro do pulmão ... 146
5.4.2.Métodos ... 149
5.5.Controlo de Qualidade em Genética ... 150
6.Bibliografia ... 152
Parte III……….161
O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita………...163 Resumo ………..……….……….….163 Abstract………..……….………..….164 Objetivos ………..……….…...…….165 Material e Métodos………..………….….166 1.Introdução……….…….167 2.Epidemiologia da Coinfeção……….……….170
3. Interações entre Malária e HIV na Gravidez………173
3.1.Impacto do HIV na malária durante a gravidez……..………..173
3.2.Impacto da malária maternal no HIV………..………..176
3.3.Efeito da malária na transmissão vertical do HIV………..…...178
4.Implicações da Coinfeção na Mãe e no Recém-nascido………..…..…181
5.Importância do Diagnóstico….………….……….………....183
6.Tratamento………..…….……..186
xix
6.2.Tratamento do HIV na gravidez………...…….………….………187
6.3.Anemia………..………189
7.Prevenção………...191
7.1.Tratamento preventivo intermitente………..………...……191
7.2.Profilaxia com cotrimoxazole………..193
7.3.Controlo do vetor………..………..………….193
7.4.Estratégias de prevenção………..………...196
8.Interações entre Fármacos e Efeitos Adversos………...…...199
9.Conclusão……….…..201
10.Bibliografia………...………...203
Parte IV……….………...….211
xx
Índice de Figuras
Parte II
Relatório de Estágio
Figura 1. GEM Premier 3000………...…..……....14
Figura 2. Dimension® Integrated Chemistry System………..…...….16
Figura 3. Clinitek Atlas® com manipulador de amostras tipo carrossel………….……17
Figura 4. Aparelho VIDAS®………..…...…..18
Figura 5. Equipamento VITEK®2………...….72
Figura 6. Equipamento BacT/ALERT® 3D………..…...73
Figura 7. Equipamento GenomEra CDX™ system………..…..74
Figura 8. Esquema da sementeira das urinas………..….79
Figura 9. Eletroferograma do exão 2 do gene HFE. A troca de uma citosina por uma guanina na posição 187 do exão 2 (c.187C˃G), leva a troca do aminoácido histidina pelo aspartato no codão 63 (H63D)………131
Figura 10. Exemplo de cariograma do sexo feminino (46,XX) com bandeamento Giemsa………...133
Figura 11. (Esquerda) FISH de interfase com sonda para o BCR-ABL1, que mostra dois sinais verdes e dois vermelhos numa célula normal. (Direita) FISH de interfase, em que a sonda para o BCR-ABL1 mostra a fusão com sinal amarelo numa célula com Ph positivo………..139
Figura 12. Gel de agarose para pesquisa do transcrito de fusão BCR-ABL1. Os poços 1-3 correspondem a um controlo, para verificar se o ADNc amplificou. Os dois primeiros são controlos positivos e o terceiro é um controlo negativo, sem ADNc. Os poços 4 e 10 correspondem ao marcador de massas moleculares. Os poços 5- 9 pesquisam o p190 e correspondem a duas amostras, dois controlos positivos para o p190 e um controlo negativo, respetivamente. Os poços 11-15 pesquisam o p210 e correspondem a duas amostras, dois controlos positivos para o p210 e um negativo, respetivamente. A amostra no poço 12 é positiva para o transcrito mais comum (p210)……….……143
xxi
Parte III
O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita
Figura 1. Gametócito e trofozoítos de P. falciparum num esfregaço de sangue……..167 Figura 2. Mosquito do género Anopheles. ………167 Figura 3. Imagem de microscopia eletrónica da libertação de novas partículas víricas de HIV a partir de linfócitos humanos em cultura (in vitro). ………..…………..168 Figura 4. Distribuição mundial da malária. Países endémicos em 2016 (azul), países endémicos em 2000, não endémicos em 2016 (verde).……….170 Figura 5. Prevalência mundial do HIV entre os 15-49 anos em 2016………171 Figura 6. Modelo hipotético da ação da malária na transmissão vertical do HIV……..180 Figura 7. Esfregaço de sangue de um indivíduo com malária. O exame microscópico revela a presença de trofozoítos de Plasmodium falciparum (setas) que infetam alguns dos glóbulos vermelhos intracelularmente……….184 Figura 8. Teste rápido de diagnóstico da malária……….184 Figura 9. Proporção da população em risco protegida por IRS ou ITNs na África subsariana. Dados entre 2010-2015………194 Figura 10. Suscetibilidade a inseticidas por vetores da malária reportada entre 2010-2015. Resistências confirmadas (vermelho), possíveis resistências (amarelo), suscetibilidade (vede)………...….196 Figura 11. Uma enfermeira explica o uso de ITNs a mães locais numa área endémica de malária………...197
xxii
Índice de Tabelas
Parte II
Relatório de Estágio
Tabela 1. Classes de resíduos, segundo o Despacho nº242/96………13 Tabela 2. Parâmetros determinados no exame físico-químico da urina tipo II e respetivo significado clínico………33 Tabela 3. Elementos avaliados no exame microscópico da urina tipo II e respetivo significado clínico………34 Tabela 4. Conjunto de parâmetros que definem o estado ácido-base………..……65 Tabela 5. Intervalos de referência dos parâmetros ácido-base………..…..66 Tabela 6(a). Calibração e Controlo de Qualidade Interno dos equipamentos usados na Bioquímica………...70 Tabela 6(b). Calibração e Controlo de Qualidade Interno dos equipamentos usados na Bioquímica……….…..71 Tabela 7. Meios de cultura sólidos não seletivos……….76 Tabela 8(a). Meios de cultura sólidos seletivos………...…77 Tabela 8(b). Parte II - Meios de cultura sólidos seletivos………78 Tabela 9. Meios líquidos de enriquecimento………...78 Tabela 10. Tipos de atmosferas para cultura microbiológica………..79 Tabela 11(a). Cartas VITEK e antibióticos testados………..104 Tabela 11(b). Cartas VITEK e antibióticos testados………..105 Tabela 12. Características dos meios de cultura usados na Micologia………..107 Tabela 13. Localizações das micoses mais frequentes………..109 Tabela 14. Parasitas possíveis de observação em amostras de fezes……….113
xxiii
Parte III
O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita
Tabela 1. Recomendações para o tratamento de malária………..186 Tabela 2. Recomendações da WHO para o tratamento de HIV na gravidez…………..188 Tabela 3(a). Fases clínicas do HIV em adultos e adolescentes segundo a WHO.…….188 Tabela 3(b). Fases clínicas do HIV em adultos e adolescentes segundo a WHO.…….189
Universidade de Lisboa
Faculdade de Farmácia
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
Catarina Rafaela Jacinto Alves
Orientado pela Doutora Isabel Moutinho e pela Doutora Teresa Porta Nova
Mestrado em Análises Clínicas
3
1.Introdução
O estágio descrito neste relatório faz parte do plano de estudos do Mestrado em Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e foi realizado no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz em Lisboa para seguintes valências: Pré-Analítica, Microbiologia e Bioquímica, orientado pela Dra. Isabel Moutinho e no Laboratório GenoMed – Diagnósticos de Medicina Molecular, para a valência de Genética, orientado pela Dra. Teresa Porta Nova.
A Luz Saúde foi criada em 2000 e é um dos maiores grupos de prestação de cuidados de saúde no mercado português. O Grupo presta serviços através de várias unidades de saúde, na qual se insere o Hospital da Luz Lisboa. Em 2006, a General Lab Portugal iniciou o seu percurso de gestão de laboratórios hospitalares, sendo o primeiro parceiro o Grupo Espírito Santo Saúde, através do outsourcing do Serviço de Patologia Clínica do Hospital da Luz. Este serviço tem como missão diagnosticar de forma rápida e eficaz, no respeito pela individualidade do doente, através de práticas de excelência e inovação. (1)
A GenoMed é uma spin-off do Instituto de Medicina Molecular (iMM), localizado na Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, no campus do Centro Hospitalar Lisboa Norte, que realiza prestação de serviços na área da Medicina Molecular e além disso, investigação e desenvolvimento. A prestação de serviços inclui ainda testes não clínicos, como a investigação biológica de paternidade e estudos de ancestralidade e genealogia. (2) O estágio decorreu nas duas unidades e em todas as áreas com a duração de 22 dias úteis.
Ambos os laboratórios adotaram um Sistema de Gestão da Qualidade, no qual são aplicados e cumpridos os requisitos da Norma 9001 da Organização Internacional de Normalização (ISO, do inglês, International Organization for Standardization), Normas para o Laboratório Clínico da Ordem dos Farmacêuticos e do Manual de Boas Práticas Laboratoriais.
Neste relatório faço um resumo da experiência e conhecimento adquiridos nas diversas áreas, ao longo de cerca de sete meses, 1080 horas, divididas da seguinte forma: 110 horas na Fase Pré-Analítica, 446 horas na Microbiologia, 348 horas na Bioquímica e 176 horas na Genética.
4
Os objetivos da realização do estágio passam por promover a integração no meio profissional, aplicando os conhecimentos adquiridos ao longo do mestrado e desenvolver capacidades como organização, trabalho em equipa e capacidade crítica. Este relatório descreve a metodologia utilizada em cada área, o controlo de qualidade e os parâmetros analisados, bem como o seu significado clínico e a identificação dos produtos biológicos necessários à sua execução.
5
2.Fase Pré-Analítica
A fase pré-analítica engloba as seguintes fases: pedido da análise pelo médico, preparação do paciente, identificação do mesmo, colheita da amostra biológica, triagem, armazenamento e transporte. É a fase mais importante do processo analítico, pois também é aquela em que ocorrem mais erros. São fontes comuns de erro na fase pré-analítica as prescrições ilegíveis, má preparação do utente, amostras inadequadas, erros na identificação de utentes ou na introdução de dados e erros na colheita, transporte, triagem e armazenamento das amostras. Devem ser estabelecidos pelo laboratório métodos efetivos para monitorizar e controlar estas variáveis. (3)
Nesta valência aprendi a diferenciar e identificar os contentores a colher, para os diferentes produtos biológicos, verificar e identificar os tubos a colher com os respetivos códigos de barras antes da colheita, bem como conferir a prescrição médica com a inscrição do utente e envio das amostras para a triagem.
Os resultados dos exames dependem de uma análise correta, que passa desde início por uma correta identificação da amostra. As amostras devem ser identificadas nos recipientes que as contêm e nunca na tampa. Deve também ser colocado o nome do utente, nº do processo, nº tubo ou código de barras, o serviço, tipo de produto biológico e data e hora da colheita. (3,4)
A preparação do doente permite minimizar os fatores biológicos controláveis que possam variar os analitos, nomeadamente o jejum (não realizado altera os valores de glicose, triglicéridos, colesterol), postura, exercício, variação circadiana e influência de certos estimulantes como a cafeína, nicotina ou álcool. É importante fornecer informações ao utente, quando aplicável, para que a colheita seja feita com conformidade e verificar, aquando da colheita, se estas indicações foram cumpridas. Caso o utente entregue produtos, é necessário verificar que estes foram bem colhidos (exemplo: urina de 24h) e conservados. (3,4)
Deve ser questionado, ou adicionado ao processo, informação sobre terapêutica antimicrobiana em curso ou administrada nos dias anteriores à colheita, medicação que possa interferir em análises como anticoagulantes, o estado imunológico do doente (transplantado, imunodeprimido), presença de material protésico, nomeadamente catéteres e algálias e local anatómico da colheita. (3,4)
6
Indiscutivelmente, o transporte e conservação das amostras são de igual importância. (3,4)
2.1.Procedimentos de colheita
2.1.1.Aparelho urogenital
Urina
A amostra ideal para realização da análise de urina tipo II é a primeira urina da manhã, que deve ser realizada em jejum, de modo a poderem ser detetadas substâncias que poderão não estar presentes numa amostra aleatória. A urina para diagnóstico microbiológico não necessita de jejum. A colheita deve ser feita após limpeza da zona (sem antisséticos), desprezar o primeiro jato e colher 10-20 ml para recipiente estéril. Nunca colher urina de arrastadeiras, urinol ou saco de algália. No caso do doente algaliado, o procedimento passa por clampar a algália durante 10-15 minutos, desinfetar a zona a puncionar (borracha do tubo coletor) e colocar a urina aspirada com seringa num recipiente estéril. Nas crianças é aplicado um saco coletor estéril, após lavagem da zona com soro fisiológico. Caso após 30 minutos ainda não tiver urinado, troca-se o saco. De seguida, transfere-se a urina para recipiente estéril. No caso das urinas a tempo determinado, durante 24h fazer toda a urina para um frasco de 24h. Começar na segunda urina da manhã e terminar na primeira urina do dia seguinte. O transporte deverá ser imediato ou até 2h à temperatura ambiente (TA). Se não for possível, refrigerar 2-8ºC até 24h. (4)
Exsudado vaginal e cervical
Para a realização desta colheita, a mulher não deve estar menstruada e deve evitar colocar cremes vaginais no dia e no dia anterior e não efetuar irrigações vaginais nas 24h que precedem a colheita. Após introdução do espéculo, com a mulher em posição ginecológica, deve colher-se o exsudado da mucosa vaginal com 3 zaragatoas. A primeira zaragatoa é introduzida em meio de transporte com carvão. As outras duas, introduzidas em tubos sem meio de transporte. O transporte deve ser imediato ou a TA até 2h. Nunca refrigerar. No caso do exsudado cervical, são colhidas secreções no canal
endocervical, com 2 zaragatoas secas que se introduzem cerca de 1cm no canal cervical, com movimentos rotativos. A primeira zaragatoa é introduzida em meio de transporte com carvão. A segunda num tubo sem meio de transporte. O transporte deve ser imediato
7 ou a TA até 2h (até 6h no caso de pesquisa de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum). (4)
Exsudado uretral
A colheita deve ser feita idealmente antes da primeira micção. Se não for possível, 2-4h após a última micção. A uretra é pressionada de modo a estimular a descarga purulenta e são introduzidas duas zaragatoas finas e flexíveis de alumínio na uretra. A colheita do exsudado é realizada com movimentos rotativos. A primeira zaragatoa é colocada em meio com carvão e a segunda colocada em tubo seco. O transporte deve ser imediato ou a TA até 2h (até 6h no caso de pesquisa de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum). (4)
2.1.2.Aparelho circulatório
Hemoculturas
Para a colheita de hemoculturas, após desinfetar a rolha de borracha do frasco de hemocultura e a pele no local da punção com álcool a 70% e solução iodada, colhe-se sangue de uma veia proximal periférica e introduz-se o sangue nos frascos. Faz-se inversão dos frascos para misturar o sangue com o meio de cultura. Para os recém-nascidos (RN) e crianças colhe-se sangue para frasco de aerobiose. Nos adultos, uma hemocultura corresponde à colheita de sangue, para inoculação de um par de frascos aeróbio/anaeróbio. Devem ser colhidas duas a três hemoculturas em 24h, com intervalo de 1h, de locais de punção diferentes. O transporte deve ser imediato. Se não for possível, conservar a TA até 2h. Nunca refrigerar. (4)
Sangue por punção venosa
A colheita realizada mais frequentemente é a punção venosa. O uso de sistemas baseados em tubo de extração a vácuo para colheita de sangue, tornam mais fácil a colheita de múltiplas amostras com uma única punção venosa, para além de reduzirem o risco de exposição direta ao sangue. (5)
Após identificação do utente, faz-se a preparação do material necessário à punção: luvas, algodão, álcool etílico a 70%, garrote, tubos etiquetados e adaptador para colheita por vácuo, seringa ou butterfly. Os tubos mais usados são os de tampa amarela (bioquímica), que possui um gel ativador da coagulação e de onde se obtém soro; tampa
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roxa (hematologia), tubo que contem anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para se obter sangue total; e tampa de cor azul (coagulação), com anticoagulante (citrato de sódio). Dependendo das análises a efetuar, pode ser necessário que o paciente esteja em jejum ou não.
O procedimento de colheita por punção venosa é o seguinte: após aplicação do garrote, selecionar a veia a puncionar. Desinfetar com algodão embebido em álcool, associar a agulha ao adaptador e fazer a punção, adicionando os tubos um a um ao adaptador sendo que a ordem correta de colheita de sangue em vácuo é: tubo de coagulação, seguido de tubo de bioquímica e por fim de EDTA. Homogeneizar os tubos. Desgarrotar quando o sangue começa a fluir, tendo o cuidado de não deixar o garrote mais do que 30 segundos. Retirar a agulha e descartar. Pedir ao utente que faça pressão sobre o local da punção com algodão e aplicar um penso rápido. Os tubos são levados para a sala de triagem logo de seguida. (4,5)
2.1.3.Aparelho digestivo
Fezes
Evitando o contacto com a urina, é transferida uma pequena porção de fezes para recipiente esterilizado de boca larga limpo e seco. Colher três amostras em dias consecutivos, se possível. O transporte deve ser imediato. Se não for possível, refrigerar a 2-8ºC, até 2h para coprocultura ou até 72h para exame parasitológico ou pesquisa de antigénios bacterianos, parasitários e virais nas fezes. Para pesquisa de toxina do Clostridium difficille (apenas em fezes diarreicas), refrigerar no máximo até 24h. (4)
2.1.4.Aparelho respiratório
Exsudado nasal
A colheita de exsudado nasal é feita através da inserção de uma zaragatoa estéril nas fossas nasais (pode ser seca ou humedecida com soro fisiológico), rodando contra a mucosa nasal. Com a mesma zaragatoa, repetir para a outra narina. Colocar a zaragatoa em meio de transporte. O transporte deve ser imediato. Se não for possível manter as amostras a TA até 2h. (4)
9 Exsudado orofaríngeo
Deve pedir-se ao doente para respirar fundo com a boca aberta e passar a zaragatoa nas áreas de exsudação, membranas ou locais de evidente inflamação e nas criptas amigdalinas, evitando tocar nas paredes laterais da boca. Tocar e rodar a zaragatoa nas amígdalas e na parte posterior da faringe, se não se observar pús ou inflamação. Colocar a zaragatoa em tubo com meio de transporte. O transporte deve ser imediato. Se não for possível manter as amostras a TA até 2h. (4)
Expetoração/ Secreções brônquicas/ Aspirado brônquico
A colheita de expetoração, secreções brônquicas e aspirado brônquico deve ser realizada sob vigilância do médico, do terapeuta ou enfermeiro e deve ser, preferivelmente, colhida a primeira amostra da manhã em jejum, após higiene da boca. É importante que o utente saiba que a colheita é de expetoração profunda e não de saliva (neste caso, a amostra é desprezada). Recolher a amostra para recipiente estéril, evitando contacto com a superfície exterior. O transporte é imediato. Se não for possível, refrigerar (2 a 8ºC) até 24h. (4)
2.1.5.Pele e tecidos
Exsudado purulento superficial e aspirados subcutâneos
É necessário referir o local da colheita. Primeiramente é feita a limpeza do local com soro fisiológico estéril. Separam-se os bordos da lesão (usando luvas) e removem-se os exsudados superficiais e/ou tecidos desvitalizados. Faz-se a colheita do material purulento ou exsudado da profundidade da ferida por aspiração com agulha e seringa ou colhe-se com zaragatoa previamente humedecida com soro fisiológico estéril e é colocada em tubo com meio de transporte. O transporte é imediato. Se não for possível manter a TA até 2h. (4)
Exsudados oculares e auriculares
Para o exsudado ocular, é introduzida uma zaragatoa ao longo da conjuntiva, na parte interna da pálpebra inferior e colhido assim o exsudado da mucosa oral. É colhida uma zaragatoa para cada olho e colocada em meio de transporte (no RN, zaragatoa com carvão para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae). A colheita deve ser realizada antes da aplicação de antibióticos, colírios, ou outros produtos. O exsudado auricular deve ser
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colhido ao nível do canal auditivo externo com zaragatoa colocada em meio de transporte. A amostra deve ser transportada de imediato, ou mantida a TA até 2h. (4)
Pele e tecidos adjacentes para exame micológico
É feita a limpeza do local com soro fisiológico estéril. São recolhidos pedaços de unha que apresentem lesão, ou é feita raspagem das zonas internas da lesão e por baixo do leito ungueal. No caso do cabelo, com pinça são arrancados vários cabelos e raspadas escamas da periferia da lesão. Para a colheita de pele (escama cutânea): com um bisturi raspar o bordo da lesão e recolher as escamas cutâneas. Passar por toda a zona lesada com zaragatoa humedecida e enviar sem meio de transporte. A amostra é colocada em contentor estéril, devidamente identificado, com indicação do produto e localização e deve ser enviada até 24h a TA. (4)
Para pesquisa de dermatófitos, aquando da colheita é preenchido um inquérito que questiona o utente sobre a sua etnia, local de lesão, se teve contacto com animais ou pessoas com lesões semelhantes e se está a tomar terapêutica antifúngica.
2.2.Triagem
Na área da triagem, são recebidas as amostras vindas das diversas unidades de saúde do hospital, bem como de outros laboratórios do grupo.
O laboratório possui um sistema informático, Appolo. Esta rede informática engloba todas as áreas. Todas as amostras que entram no laboratório são identificadas através de etiquetas de código de barras, coladas nos tubos /recipientes e posteriormente registadas no sistema informático Appolo. É também realizado um registo em papel, dando-se entrada dos produtos nas folhas de receção de amostras, bem como indicação das amostras em falta e é conferido se o produto colhido corresponde às análises pedidas. A triagem engloba a receção das amostras, o processamento e a distribuição pelas diversas áreas analíticas. (3)
O processamento das amostras passa pela centrifugação dos tubos, quando aplicável. Os tubos de bioquímica, para obtenção de soro, são centrifugados a 3600-3800rpm, durante 7-10 minutos. O coágulo deve estar totalmente formado antes da centrifugação, para prevenir o aparecimento de fibrina nas amostras de soro. O tempo de coagulação pode aumentar devido a terapêutica trombolítica ou anticoagulante.
11 As urinas são centrifugadas a 1500 rpm, 5 minutos. Para as urinas de 24h insere-se o volume no sistema e reparte-insere-se para contentores mais pequenos que são depois enviados para o laboratório central.
Dos produtos recolhidos na área das colheitas (externos) apenas são realizadas análises a produtos marcados como “urgentes”, os outros são enviados para a central, bem como produtos do internamento e da urgência que tenham pedidas análises que o laboratório não realiza.
É também responsabilidade da triagem fazer a rejeição de amostras, caso se verifique que não estão conformes, de acordo com o manual de colheitas. As amostras hemolisadas, em que ocorre rutura da membrana dos eritrócitos que libertam o seu conteúdo para o plasma, podem originar de colheita mal executada ou agitação brusca e alteram alguns resultados analíticos, como o lactato desidrogenase ou o potássio, resultando numa amostra não representativa do estado do paciente. Amostras com formação de coágulo (rede de fibrina que captura os elementos celulares do sangue), devido a má homogeneização ou colheita difícil, podem entupir os equipamentos e interferir nos resultados analíticos. Os critérios de rejeição definidos pelo Laboratório de Patologia Clínica são os seguintes: amostras mal identificadas ou não identificadas; amostras sem prescrição em papel ou/ e informática; colheitas que não obedeçam às condições referidas no manual de colheitas; amostras cujo contentor esteja danificado, conspurcado ou a extravasar produto biológico; pedidos de anaeróbios de amostras que estiveram em contacto com o oxigénio ou que foram transportados em recipiente sem meio de transporte adequado; produtos entregues com seringa e agulha (retirar a agulha e fechar a seringa). (4)
2.3.Conservação das amostras
As amostras de plasma e soro podem ser refrigeradas a uma temperatura entre 2 – 8 °C durante alguns dias. Para conservar durante um período de tempo superior, as amostras podem ser congeladas a uma temperatura de -20 °C ou inferior (até -70ºC). É de evitar a congelação e descongelação repetidas. O tempo de armazenamento ocorre pelo menos até à impressão do boletim de análises completo.
As alíquotas de urinas tipo II são conservadas refrigeradas durante 24h a 2-8ºC. No caso de urinas para pesquisa de drogas de abuso são congeladas durante dois meses, se positivas, caso contrário, refrigeradas até 4 dias.
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Relativamente ao líquido cefalorraquidiano (LCR) para exame bioquímico, as amostras conservadas a 2-8ºC permanecem estáveis durante quatro dias. Após esse tempo, o LCR é congelado até 2 meses, se existir quantidade suficiente.
Produtos para exame microbiológico, exceto LCR e hemoculturas, são guardados até validação, refrigerados a 2-8ºC.
LCR e hemoculturas para exame microbiológico são guardados na estufa a 37ºC, até validação.
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Gestão de Resíduos
A classificação dos resíduos encontra-se na tabela 1, de acordo com o Despacho nº242/96 de 5 de Julho. (6)
Tabela 1. Classes de resíduos, segundo o Despacho nº242/96. Adaptado de (6).
Classes de resíduos Descrição
Grupo I - Resíduos equiparados a urbanos Não têm exigências especiais, são resíduos provenientes de serviços gerais. Grupo II - Resíduos hospitalares não
perigosos
Material não contaminado e sem vestígios de sangue ou reagentes.
Grupo III - Resíduos com risco biológico Resíduos contaminados ou em que há suspeita de contaminação provenientes de salas de colheitas e salas de trabalho: algodões com sangue, luvas, meios de cultura, entre outros.
Grupo IV - Resíduos com elevado risco biológico
Resíduos constituídos por materiais cortantes ou perfurantes provenientes das salas de colheitas e salas de trabalho, nomeadamente agulhas e vidros.
Os resíduos do grupo I e II são eliminados para sacos pretos e colocados em contentores de lixo comum. Os resíduos do grupo III são eliminados em contentores revestidos por sacos brancos. Duas vezes por dia, os sacos são fechados e colocados num contentor de resíduos do grupo III, recolhidos por pessoal autorizado. Os resíduos do grupo IV são colocados diretamente em contentores de plástico específicos para o efeito, devidamente identificados. Quando o conteúdo do contentor chega ao nível assinalado, este é fechado e colocado num contentor de resíduos do grupo IV, que será depois recolhido por empresa certificada na gestão de resíduos.
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3.Bioquímica
A Bioquímica Clínica é uma das várias secções pertencentes à fase analítica, que permite a determinação de variados parâmetros no soro, plasma, urina ou outros líquidos biológicos, através de técnicas químicas, imunológicas e cinéticas, contribuindo para o diagnóstico e monitorização de processos patológicos. É importante referir que os parâmetros referidos neste capítulo são apenas aqueles determinados no laboratório em que o estágio foi realizado.
3.1.Equipamentos
3.1.1GEM Premier 3000 – Gasimetrias
Trata-se de um equipamento (figura 1) que mede uma variedade de parâmetros em sangue total heparinizado. Mede potencial de hidrogénio (pH), pressão parcial de dióxido de carbono (ρCO2), ião sódio (Na+), ião potássio (K+)e ião cálcio (Ca2+) usando sensores potenciométricos. (7) Para além destes, mede uma série de outros parâmetros derivados dos referidos anteriormente, como é o caso do ião bicarbonato (HCO3-).
Figura 1. GEM Premier 3000. Adaptado de (8)
Os métodos potenciométricos medem a força eletromotriz (fem) de células galvânicas, em que o potencial de um dos componentes do par eletrolítico é tomado como resposta às concentrações de espécies iónicas presentes em solução. As condições analíticas são controladas para que a fem dependa apenas da espécie iónica em estudo.
15 Consiste num método eletroquímico em que é medida a diferença de potencial elétrico entre dois elétrodos em condições estáticas (sem passagem de corrente). É feita a medição do potencial de um elétrodo indicador, o de interesse (cátodo) em relação a um elétrodo de referência (ânodo), através de um potenciómetro. (9)
Através de um elétrodo amperimétrico mede também pressão parcial de oxigénio (ρO2), glucose e lactato. (7) A amperometria é uma técnica eletroquímica em que ambos os elétrodos estão ligados a uma fonte de tensão externa. Esta corrente é aplicada ao elétrodo de medição, que faz com que as moléculas do analito em estudo sejam atraídas para esse elétrodo, dando origem a uma reação química. A corrente da célula eletroquímica é medida e é proporcional à concentração de analito presente na amostra. (9)
O aparelho tem cartuchos com todos os componentes necessários para operar, que inclui sensores, soluções, bolsa de descarte e agulha de aspiração. Para além disto, apresenta um sistema de Controlo de Qualidade inteligente (iQM™, do inglês, intelligent Quality Management) de modo a garantir que produz resultados fiáveis sem necessidade de intervenções pelo usuário. (7) O modo de funcionamento é muito simples: após leitura do código de barras, a amostra é aspirada da seringa pelo aparelho e os resultados vão automaticamente para o software.
3.1.2.Dimension
®Integrated Chemistry System
O laboratório usa um sistema de diagnóstico in vitro (figura 1) que mede uma variedade de analitos nos fluidos humanos. O aparelho usa um sistema de cartuchos de reagentes para operar e é constituído por quatro módulos: espetrofotometria, módulo de imunoensaio heterogéneo (HM) módulo QuickLyte® para testar eletrólitos e o módulo de imunoensaios homogéneos de alta sensibilidade (LOCI®). Utiliza técnicas de espetrofotometria, turbidimetria, imunoturbidimetria, quimioluminescência e tecnologia multisensor seletiva de iões para aplicações químicas e imunoquímicas de uso clínico em urina, plasma, soro e LCR. (10)
16
Figura 2. Dimension® Integrated Chemistry System. Adaptado de (11).
A espetrofotometria é definida como uma medida da intensidade da luz a um determinado comprimento de onda e baseia-se na capacidade de absorção da radiação. As reações enzimáticas, de oxidação-redução ou colorimétricas, que provoquem uma alteração na absorvância podem ser detetadas por espetrofotometria. (9)
Os imunoensaios baseiam-se na reação entre um antigénio e um anticorpo específico para esse antigénio. O módulo HM realiza imunoensaios enzimáticos, baseados no princípio de sandwich. LOCI® é um módulo automatizado de imunoensaios associado à tecnologia quimioluminescente. (10)
A turbidimetria mede a luz dispersa, em que o aumento da turvação, causada pela presença de partículas em suspensão, causa uma alteração na intensidade da radiação incidente. Assim, a concentração do analito presente na amostra em estudo é tanto maior quanto menor for a quantidade de luz medida. Pode ser utilizada associada a uma reação de imunoprecipitação (imunoturbidimetria), medindo a quantidade de luz que consegue atravessar a amostra na presença de imunocomplexos. (9)
As medições dos eletrólitos utilizam a Tecnologia do Multisensor Integrado (IMT, do inglês, Integrated Multisensor Technology) de deteção indireta das amostras - QuikLYTE® - para desenvolver um potencial elétrico proporcional à atividade de cada ião específico presente na amostra. Os elétrodos estão incorporados no QuikLYTE® Integrated Multisensor e são seletivos para os iões de sódio, potássio e cloreto. No multisensor, é também incorporado um elétrodo de referência. Depois de uma amostra ser posicionada no sensor, os iões estabelecem um equilíbrio com a superfície do elétrodo. É gerado um potencial que é proporcional ao logaritmo da atividade da substância a analisar na amostra. O potencial elétrico gerado numa amostra é comparado com o
17 potencial elétrico gerado numa solução padrão e é calculada a concentração dos iões pretendidos. (12)
O sistema alerta para os índices de hemólise (pode ocorrer elevação de alguns resultados analíticos como o potássio, magnésio, lactato desidrogenase e podem ocorrer interferências analíticas devido à cor da hemoglobina), icterícia (tonalidade amarelada do soro ou plasma devido à bilirrubina, que pode levar à alteração de alguns resultados analíticos) e lipémia (leva à turvação do soro e pode interferir nas técnicas analíticas como a turbidimetria).
As amostras são colocadas no suporte e o equipamento lê o código de barras e processa os testes de modo aleatório. Não é necessário pré-tratamento de reagentes ou da amostra. Os resultados são impressos automaticamente pela impressora acoplada ao aparelho e também enviadas para o sistema de validação do laboratório.
3.1.3.Clinitek Atlas
®O equipamento Clinitek Atlas® (figura 3) é um espetrofotómetro de dispersão que mede a luz refletida para realizar análise química e física da urina. Cada embalagem de reagente contem um rolo de tiras de reagente com zonas reativas independentes, impregnadas com substâncias químicas, que analisam os seguintes parâmetros: glicose, bilirrubina, cetona (ácido acetilacético), sangue oculto, pH, proteínas, urobilinogénio, leucócitos e nitritos. O equipamento analisa por espetrofotometria de refletância, a comprimentos definidos, a cor e intensidade da luz refletida por uma zona reativa após a reação. (13)
18
A determinação da gravidade específica da amostra faz-se através do método do índice de refração, em que é determinado o grau de desvio de um feixe de luz que atravessa a solução (índice de refração), proporcional à concentração dos solutos da amostra. A clareza é determinada através da medição da transmissão e dispersão da luz que passa através da amostra. (13)
O scanner de código de barras lê as etiquetas e cada uma é lida no momento em que a amostra no tubo é analisada.
3.1.4.VIDAS
®É um imunoanalisador automático (figura 4) composto por um módulo analítico com cinco secções e com seis posições em cada uma, que permite a realização de diversos testes e parâmetros em simultâneo.
Figura 4. Aparelho VIDAS®. Adaptado de (15).
Funciona da seguinte forma: após identificação do doente através da leitura do código de barras, é inserido na posição da secção escolhida, o cone (fase sólida da reação, sensibilizado com antigénios ou anticorpos) e a barrete de reagente, ao qual se adiciona o soro a testar.
A tecnologia utilizada, que é adaptável a uma ampla gama de ensaios, combina o método ensaio imunoenzimático (EIA, do inglês, enzyme immunoassay) com uma leitura final de fluorescência: tecnologia conhecida como ELFA (do inglês, enzyme linked fluorescent assay). Inicialmente, os anticorpos/antigénios presentes no soro ligam-se aos anticorpos/antigénios fixados no cone. Após uma etapa de lavagem, o conjugado fixa-se aos anticorpos/antigénios específicos presentes no cone, seguido de outra etapa de lavagem que elimina o conjugado não fixado. Na etapa final, a enzima do conjugado
19 catalisa a reação de hidrólise de um substrato, resultando na emissão de fluorescência, proporcional à quantidade analito presente na amostra. (16)
3.2.Metabolismo dos hidratos de carbono
Glicose
A fonte principal de energia do organismo, glicose, é originada através do metabolismo dos glícidos. Nas células, a glicose é metabolizada para produzir trifosfato de adenosina (ATP) e fornecer intermediários metabólicos que são necessários em vários processos biossintéticos. Vários sistemas no organismo permitem que independentemente da quantidade de glicose ingerida, a concentração se mantenha constante, não existindo situações de carência ou excesso não compatíveis com a vida. No entanto, situações de desequilíbrio ocorrem quando estes mecanismos falham. A patologia mais preocupante originada do metabolismo dos hidratos de carbono é a diabetes mellitus, sendo a glicémia o parâmetro fundamental do diagnóstico e monitorização. Esta doença metabólica causa hiperglicemia, poliúria, polidipsia e polifagia e pode dar origem a complicações como nefropatia e neuropatia. Outro desequilíbrio na concentração de glicose pode originar hipoglicémia, caracterizada por baixas concentrações sanguíneas de glicose. (17)
A concentração de glicose no sangue varia entre limites estreitos e depende de vários fatores, nomeadamente o estado físico, jejum, medicação. A glicose é filtrada pelos glomérulos e quase totalmente reabsorvida pelos túbulos renais. Quando a sua concentração atinge o limiar renal, aparece na urina. A glicosúria é também um parâmetro importante, na medida em que em condições fisiológicas normais, a glicose não é excretada na urina. (17)
Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System Amostra: soro, plasma, urina e LCR.
Interferentes: a amostra hemolisada pode diminuir o resultado. Por outro lado, a lipémia e bilirrubina não conjugada podem aumentar o resultado. Alguns medicamentos também podem alterar o valor de glicose. A glicólise diminui os níveis séricos de glicose entre 5 a 7% por hora em sangue normal coagulado não centrifugado, à temperatura ambiente. (18)
20
A determinação é realizada através do método da hexoquinase (HK). A absorvância devida à forma reduzida de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), que é proporcional à quantidade de glicose na amostra, é determinada utilizando uma técnica bicromática de ponto final (340 e 383nm). (18)
HK
Glicose + ATP → Glicose-6-fosfato + ADP Mg2+
Glicose-6-fosfato desidrogenase
Glicose-6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogliconato + NADH + H+
Legenda: hexoquinase (HK); trifosfato de adenosina (ATP); difosfato de adenosina (ADP); ião magnésio (Mg2+); nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+); nicotinamida adenina dinucleótido reduzido (NADH); ião hidrogénio (H+)
Valores de referência: Soro: 74 – 106 mg/dL LCR: 40 – 70 mg/dL
Urina, aleatória: 1 – 15 mg/dL
Valores críticos: valores de glicémia em idade superior a um ano ≤55 mg/dL ou ≥500 mg/dL ou em idade inferior a um ano ≤30mg/dL ou ≥200 mg/dL e um valor de < 40 mg/dlL no LCR, são comunicados de imediato ao médico.
A Associação Americana de Diabetes (ADA, do inglês, American Diabetes Association) recomenda os seguintes critérios para o diagnóstico de diabetes: (19)
1. Sintomas de diabetes e glicose aleatória ≥ 200 mg/dL OU
2. Glicose em jejum ≥ 126 mg/dL
3. Valores de prova de tolerância à glicose oral (PTGO) às 2h ≥ 200 mg/dL Um parâmetro positivo não é suficiente, sendo necessário repetição do mesmo para confirmação. Indivíduos que apresentem valores de glicose aumentados, mas não
21 superior ao valor de referência são incluídos noutra categoria que apresenta risco elevado para diabetes e doenças cardiovasculares futuras, segundo a norma da DGS (Direção-Geral da Saúde) (20):
a) Anomalia da Glicemia de Jejum (AGJ): glicemia de jejum ≥ 110 e < 126 mg/dl b) Tolerância Diminuída à Glicose (TDG): glicémia às 2 horas na PTGO ≥ 140 e < 200 mg/dl.
A glicose também pode ser determinada em sangue arterial (sangue total heparinizado) no equipamento GEM Premier 3000, com os seguintes valores de referência: 60 – 95 mg/dL (7)
PTGO
A prova de tolerância à glicose oral avalia a clearance da glucose em circulação após uma sobrecarga (administração oral de glucose) de 75gr de glucose anidra. A medição de glicose é realizada às 0h, 1h e 2h após ingestão. É realizada para deteção de diabetes mellitus gestacional (DMG) e para detetar a tolerância diminuída à glicose. Apesar de ser mais sensível que a determinação da glicose em jejum, a prova é afetada por vários fatores que resulta em pobre reprodutibilidade do teste. A prova deve ser realizada novamente para confirmação de resultados anormais. (17)
Segundo a norma da DGS esta prova deve ser realizada a todas as grávidas, excluindo aquelas a quem tenha sido previamente diagnosticada DMG ou provável diabetes prévia. (21)
O diagnóstico de DMG faz-se quando um ou mais valores forem iguais ou superiores aos valores de referência:
• Em jejum (mínimo 8h, máximo 14h) ≥92 mg/dL • Na primeira hora ≥180 mg/dL
• Na segunda hora ≥153 mg/dL
A prova deve ser feita sem dieta restritiva, com atividade física regular nos três dias anteriores e durante a prova, o paciente deve manter-se em repouso.
22 Lactato
O lactato, um intermediário no metabolismo dos hidratos de carbono, existe no músculo esquelético, cérebro e eritrócitos. Cerca de 30% do lactato formado é utilizado no fígado, principalmente para a produção da glicose, através da gliconeogénese. (7,17)
Privação severa de oxigénio nos tecidos devido a choque, descompensação cardíaca, problemas hematológicos e insuficiência pulmonar, problemas hepáticos, entre outras condições clínicas, leva a acidose láctica, associada com um aumento significativo do lactato no sangue. (7)
Equipamento: GEM Premier 3000 Amostra: sangue arterial heparinizado Método: amperometria
Valores de referência: 5 – 20 mg/dL
3.3.Metabolismo dos lípidos
Colesterol total
Cerca de 90% do colesterol endógeno é sintetizado no fígado e intestino e as células e órgãos necessitam deste colesterol que lhes chega através das lipoproteínas. Após a sua síntese, o colesterol é transportado no sangue, 2/3 sob a forma de éster e 1/3 na forma livre, pelas lipoproteínas. A sua determinação é muito importante, na medida em que o colesterol total (livre e esterificado) está associado ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, uma das principais causas de morte, através da sua deposição nas paredes do endotélio vascular, formando placas de ateroma que podem originar um enfarte agudo do miocárdio (EAM). (9)
Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System Amostra: soro, plasma
Interferentes: oxalato de potássio, fluoreto de sódio e heparina de lítio podem diminuir os resultados de colesterol total, bem como bilirrubina conjugada e não conjugada e uma amostra hemolisada. (22)
23 O produto final da reação é um cromóforo que absorve a 540nm, cuja concentração é proporcional à concentração de colesterol total. (22)
CE
Ésteres de colesterol → Colesterol + Ácidos gordos CO Colesterol + O2 → Colest-4-eno-3-ona + H2O2 HPO 2 H2O2 + DEA-HCI/AAP → 4 H2O + DEA-HCI/AAP oxidada
Legenda: esterase do colesterol (CE); oxidase do colesterol (CO); oxigénio(O2); peróxido de hidrogénio (H2O2); peroxidase de rábano silvestre (HPO); N,N-dietilanilina-HCl/4-aminoantipirina (DEA-HCl/AAP); oxigénio (O2); peróxido de hidrogénio (H2O2); água (H2O)
Valores de referência:
Segundo o Painel de Tratamento de Adultos III do Programa Nacional de Educação sobre o Colesterol (NCEP – ATP III, do inglês, National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III) (22,23):
• Desejável <200 mg/dL
• Acima da média 200 – 239 mg/dL • Elevado ≥240 mg/dL
Triglicéridos
São os ésteres do glicerol mais prevalentes da dieta e encontrados em predominância no plasma. São hidrolisados a glicerol e ácidos gordos pelas lípases e após absorção, são ressintetizados ao combinar-se com o colesterol e apolipoproteína B48 para formar as quilomicras. (9)
As medições obtidas são utilizadas no diagnóstico e tratamento de distúrbios cardiovasculares, endócrinos, doenças do metabolismo dos lípidos, doentes com nefrose, obstrução hepática. (24)
24
Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System Amostra: soro, plasma
Interferentes: devido à lipólise natural, podem existir pequenas quantidades de glicerol livre em amostras de sangue. O glicerol livre pode também sofrer aumentos devido a stress ou doença. Uma amostra hemolisada e bilirrubina não conjugada aumentam o valor dos triglicéridos. (24)
Método: ensaio enzimático
A concentração do produto final da reação, quinoneimina é proporcional à quantidade de glicerol e percursores, e é medida através de medições de absorvância utilizando uma técnica bicromática de ponto final (510, 700nm). (24)
LPL
Triglicéridos → Glicerol + Ácidos gordos GK Glicerol + ATP → Glicerol-3-fosfato + ADP GPO Glicerol-3-fosfato + O2 → Fosfato de Di-hidroxiacetona + H2O2 POD 2H2O2 + Aminoantipirina + 4-Clorofenol → Quinoneimina + HCl + 4H2O
Legenda: lipoproteína lípase (LPL); glicerol quinase (GK); trifosfato de adenosina (ATP); difosfato de adenosina (ADP); glicerol-3-fosfato-oxidase (GPO); oxigénio (O2); peróxido de hidrogénio (H2O2); peroxidase (POD); ácido clorídrico (HCl); água (H2O);
Valores de referência:
Quatro categorias foram estabelecidas pelo NCEP – ATP III (23,24): • Normal < 150 mg/dL
• Acima da linha limite 150 – 199 mg/dL • Elevada 200 – 499 mg/dL
