Identificação de bactérias

Teste da Catalase

A catalase é uma enzima que catalisa a formação de água e oxigénio, a partir de peróxido de hidrogénio. A presença ou ausência da atividade desta enzima é um teste usado para subdividir os vários géneros de cocos GP. A presença da enzima pode ser verificada através da colocação de uma gota de peróxido de hidrogénio em cima de uma colónia e observar a formação de bolhas de ar. (72,76)

95 Teste da Coagulase

É uma enzima produzida principalmente pelo S.aureus. (72,76) Este teste é usado na identificação presuntiva desta espécie, diferenciando-a das outras espécies não produtoras de coagulase, a partir de colónias isoladas.

No laboratório é utilizado um kit, em que o precipitado formado pela junção do reagente com a colónia, indica a presença da enzima.

Teste da Oxidase

As bactérias que produzem esta enzima apresentam um sistema de transporte de eletrões e as enzimas atuam como elo final na cadeia de respiração aeróbia transferindo eletrões para o oxigénio. É utilizado para diferenciar o género Neisseria (oxidase positivo) de outros cocos GN e para distinguir a família das Enterobacteriáceas (oxidase negativo) de outros bacilos GN. (72,76) É utilizado um corante que substitui o oxigénio como aceitador artificial de eletrões, colocado sobre as colónias, que desenvolvem uma cor azulada caso tenham a atividade da enzima.

Teste da Optoquina

Esta substância inibe o crescimento de Streptococcus pneumoniae. A estirpe em estudo é inoculada numa placa com meio agar sangue e um disco saturado com optoquina, colocado no centro do inóculo. Após incubação, durante cerca de 18h, verifica-se a presença de um halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco. (72,76)

4.2.5.1.Identificação de cocos GP

Staphylococcus spp.

São cocos GP que se apresentam normalmente em cacho/tétradas, mas podem também aparecer como células únicas, pares ou cadeias curtas. São catalase positivos. A maioria dos Staphylococcus são imóveis, anaeróbios facultativos. Estas bactérias estão presentes na pele e membranas mucosas e são importantes patogéneos na medida em que causam um amplo espectro de doenças sistémicas, da pele, intoxicações alimentares, tecidos, trato urinário e infeções oportunistas. Os Staphylococcus crescem rapidamente em meios não seletivos com sangue de carneiro, apresentando colónias grandes e lisas e brilhantes, com cor entre o branco e o amarelo, produzindo hemólise; os meios seletivos

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como o manitol-salgado, podem ser usados para isolar S.aureus (a espécie fermenta o manitol, mas não a maioria das outras espécies). (72,76,79)

As estirpes MRSA produzem infeções graves em pacientes hospitalizados e são identificados no laboratório através do uso de um meio cromogéneo específico (valorização de colónias rosa).

O teste da coagulase é usado para distinguir e identificar a espécie S.aureus (coagulase positivo) dos Staphylococcus coagulase negativos. Estes últimos são identificados através de cartas VITEK para Gram positivos (carta GP).

Streptococcus spp.

Apresentam-se aos pares ou em cadeiras. A maioria das espécies é anaeróbia facultativa e algumas só crescem em atmosfera enriquecida de CO2. São catalase negativos, o que os distingue do género Staphylococcus. (72,76,79)

A identificação das espécies dentro deste género é complicada, pelo que se utilizam as propriedades serológicas-Grupos de Lancefield- que diferencia as estirpes de Streptococcus β-hemolíticos, padrões de hemólise e propriedades bioquímicas. A maioria dos β-hemolíticos e algumas espécies α-hemolíticas possuem antigénios específicos, que podem ser identificados por ensaios imunológicos como o Streptococcus pyogenes (grupo A), causador de faringite e amigadalite bacteriana. Este género é responsável por casos de faringite, infeções da pele, síndrome do choque tóxico estreptocócico, pneumonia, doença neonatal, meningite, entre outras. S. pneumoniae são diplococos Gram positivos com aspeto lanceolado, que podem ser identificados através da prova da optoquina sensível ou através da deteção de antigénio. No exame corado por Gram, a presença de GP aos pares e cadeias em associação com leucócitos é um achado importante. Em cultura, o seu crescimento é ótimo em agar sangue, em que são observadas colónias transparentes ou translúcidas, lisas, com formação de hemólise. (72,76,79)

É utilizado um meio cromogéneo são utilizados para a deteção de S.agalactiae (Grupo B), que não necessita de carta para identificação.

Teste rápido para S.pneumonia

Consiste num teste imunocromatográfico para a deteção do antigénio de S. pneumoniae na urina de pacientes com pneumonia e LCR de pacientes com meningite. (84) A doença pneumocócica ocorre quando a bactéria que coloniza a nasofaringe e

97 orofaringe se espalha para os pulmões, seios paranasais, orelha ou meninges. S. pneumoniae constitui a causa principal de pneumonia adquirida na comunidade, tendo uma taxa de mortalidade elevada, dependendo da idade e outras infeções associadas. A meningite provocada por esta bactéria, leva a danos cerebrais permanentes ou morte e pode ocorrer ou não, como complicação. (76,84)

Uma zaragatoa molhada na amostra de urina ou LCR é inserida no cartão de teste, ao qual se adiciona um reagente. De seguida o cartão é fechado, de modo a colocar a amostra em contacto com a tira de teste. O antigénio presente na amostra reage com o conjugado e estes complexos são capturados pelo anticorpo imobilizado na tira teste, originando a formação de uma linha nesta zona. O resultado é lido após 15 minutos, através da presença ou ausência da linha de teste. A linha controlo deverá ser observada, para validar o resultado. (84)

Teste rápido para Streptococcus do grupo A

Realiza a deteção qualitativa de antigénios de Streptococcus β-hemolíticos do grupo A, em zaragatoas faríngeas, que são a causa principal de infeções do trato respiratório superior, como amigdalite e faringite. (76,85)

O antigénio é extraído da zaragatoa usando os reagentes do kit e esta solução é adicionada ao poço de amostragem da cassete. O antigénio reage com o conjugado para formar complexos, que se deslocam cromatograficamente através da membrana em direção ao anticorpo imobilizado na linha de teste. Caso o antigénio esteja presente, forma-se uma sanduíche (anticorpo/antigénio/conjugado) e é visível uma linha colorida. Deve também ser visível uma linha de controlo para se poder validar o resultado. (85)

Enterococcus spp.

São cocos GP dispostos em cadeias curtas ou aos pares, com morfologia idêntica aos S.pneumoniae. Uma forma de os distinguir é utilizando o teste da optoquina (S.pneumoniae é sensível, os enterococos são resistentes). São catalase negativos e crescem tanto em aerobiose como em anaerobiose. Crescem em meios comuns e não seletivos, nomeadamente no meio com agar sangue de carneiro, apresentando colónias com α, β ou ausência de hemólise, de cor branca ou acinzentada. São responsáveis por bacterémia, endocardite, infeções do trato urinário e feridas, assim como infeções nosocomiais. Algumas estirpes apresentam já resistência múltipla aos antibióticos

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(vancomicina). Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium são as espécies mais importantes e mais frequentemente isoladas, colonizadoras do trato intestinal que se podem disseminar para outras superfícies mucosas. (72,76,79)

No laboratório é utilizado um meio cromogéneo seletivo, destinado à deteção de Enterococcus faecium e E.faecalis nos doentes de risco que apresentam uma resistência adquirida à vancomicina. E.faecium apresenta colónias violeta e E.faecalis apresenta colónias verdes. A identificação das colónias isoladas em meios não cromogéneos é realizada através de cartas VITEK para Gram positivos (carta GP).

4.2.5.2.Identificação de bacilos GN

Enterobacteriáceas

A família das Enterobacteriáceas é composta por dezenas de géneros de bacilos GN. A maioria destes organismos são ubiquitários, habitando no aparelho gastrointestinal humano e de outros animais e no meio ambiente. São responsáveis por bacterémias, infeções do trato urinário e gastrointestinais, entre outras patologias e estão associados a infeções nosocomiais. Os membros desta família podem ser ou não, móveis com flagelo ou produtores de esporos. No exame direto apresentam-se como cocobacilos ou bacilos retos, com extremidades arredondadas. Podem ser anaeróbios ou aeróbios facultativos. São catalase positiva e oxidase negativa e podem crescer numa variedade e meios seletivos e não seletivos. As características das colónias em diferentes meios são usadas para distinguir membros da família. Por exemplo, Escherichia e Klebsiella são fermementadoras da lactose, visível pela mudança de cor no meio agar MCK, ao contrário de Proteus, Salmonella, Shigella e Yersinia (colónias incolores). (72,76,79)

Nas cropoculturas são usados meios seletivos, como o meio Hektoen que permite pesquisar Salmonella e Shigella. A identificação das colónias isoladas destas bactérias realiza-se através das cartas VITEK GN.

Caso o género Salmonella spp. seja identificado, é feito um teste de aglutinação com soro polivalente para fazer a distinção entre “Typhi” e “não-Typhi” e é posteriormente enviado para o laboratório central para identificação do serotipo.

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Campylobacter

O género Campylobacter consiste em bacilos GN pequenos, móveis, em forma de “S”. São catalase e oxidase positivos. A maioria das espécies necessitam de atmosfera reduzida de oxigénio (microaerofilia) e a cultura requer o uso de um meio seletivo com vários dias de incubação. As espécies mais comumente isoladas são Campylobacter jejuni e Campylobacter coli, responsáveis por gastroenterites e septicémias. (76,79)

No laboratório, é utilizado o meio CAM. Neste meio, as colónias são não hemolíticas, achatadas, acinzentadas e irregulares. Caso estas colónias estejam presentes, é realizado um esfregaço corado com fucsina durante 10 segundos, para observação das formas espiraladas. A identificação das colónias através do sistema automatizado não é realizada no laboratório; caso se verifique crescimento de colónias características, a placa é enviada para o laboratório central.

Pseudomonas spp.

Organismos oportunistas, associados a infeções nosocomiais, em que a P.aeruginosa é a espécie mais importante. São bacilos GN, pequenos, oxidase positivo, normalmente dispostos aos pares, não fermentadores da lactose. São aeróbios com necessidades nutricionais simples, crescendo em meios usuais como CLED, agar sangue e MCK. A sua morfologia em colónia, pigmentação, odor, tamanho, e alguns testes bioquímicos como a oxidase são suficientes para a sua identificação preliminar. Provocam patologias como infeções do trato respiratório, urinário, pele e tecidos, ouvido e olhos, assim como bacterémia e endocardite e são resistentes a muitos antibióticos (produtoras de β-lactamases). (72,76,79)

A identificação das colónias isoladas realiza-se através das cartas VITEK GN.

Vibrio spp.

Bacilos GN com morfologia curva, anaeróbios facultativos, fermentadores. Ao contrário das Enterobacteriáceas, são oxidase positivos. A espécie mais importante que causa doença em humanos é o Vibrio cholerae, que origina gastroenterite e bacterémia. São diagnosticados através da microscopia e cultura de fezes, podendo crescer numa variedade de meios simples como agar sangue e MCK (não fermentadores da lactose). (72,76,79)

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4.2.5.3.Identificação de cocobacilos GN

Haemophilus spp.

São bacilos GN pequenos ou cocobacilos, anaeróbios facultativos. As espécies deste género fazem parte da flora habitual do aparelho respiratório superior humano e dos animais. A maior parte necessita de exigências nutricionais fastidiosas. Haemophilus influenzae, a espécie mais comum, é responsável por quadros de meningite, epiglotite, pericardite e pneumonia principalmente em crianças. Podem ser identificados em microscopia e a cultura é realizada em agar chocolate. Podem ter reação variável nos testes da oxidase e catalase. (72,76,79)

A sua identificação é feita através de um Api-NH.

Moraxella spp.

Agente mais comum é a Moraxella catarrhalis, que causa infeções pulmonares na comunidade, estando também descritos casos de endocardite e meningite. São diplococos GN, aeróbios, oxidade e catalase positivos. O seu isolamento faz-se em gelose chocolate em atmosfera de CO2. A maioria dos isolados produz β-lactamases e são resistentes às penicilinas. (72,79)

A sua identificação é feita através de um Api-NH.

Neisseria spp.

São diplococos GN, fastidiosos, em pares ou cadeias curtas. Crescem melhor em atmosfera suplementada com CO2 (capnofilia). São oxalase e catalase positivas. O género Neisseria é composto por várias espécies, sendo duas delas organismos patogénicos estritos em humanos, Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, A primeira é responsável por uma doença transmitida sexualmente (gonorreia) e a segunda é a segunda maior causadora de meningite em adultos, sendo este género responsável também por outro tipo de patologias, nomeadamente conjuntivite, faringite, uretrite. A coloração de Gram assiste no diagnóstico, mas a cultura é sensível e específica. Estas espécies crescem em agar chocolate ou meios seletivos com o VCA. (72,76,79)

101 API®_NH

Corresponde a um sistema padronizado para identificação de Neisseria, Haemophilus e Moraxella catarrhalis. Estas bactérias apresentam exigências nutritivas e são cultivadas em gelose chocolate em atmosfera enriquecida em CO2.

A galeria de identificação é composta por microtubos, que efetuam testes de identificação (reações enzimáticas ou fermentações de açúcares). Durante o período de incubação, ocorrem mudanças de cor espontâneas ou que são reveladas através da adição de reagentes. (86)

Procedimento

É necessário um inóculo ajustado a 4 de McFarland, pelo que se efetua uma suspensão com as colónias a estudar. A partir da suspensão, enchem-se os poços da galeria de identificação e é adicionada parafina aos poços indicados. A galeria é fechada numa caixa e incubada a 37ºC em aerobiose. Para observar os resultados, é necessário ler as reações espontâneas, em que pode ser necessário adicionar reagentes. Através da atribuição de (+) ou (-), consoante as cores obtidas em cada reação, obtém-se um perfil numérico, que corresponde a uma identificação na lista do folheto informativo. (Ex: o perfil numérico 1001 corresponde a Neisseria gonorrhoeae). (86)

Acinetobacter spp.

Grupo de bacilos GN, aeróbios estritos, oxidase positiva, não fermentativos, que como as Pseudomonas, utilizam carbohidratos, álcoois e aminoácidos como fontes de energia. Acinetobacter baumanni é a espécie mais comum e são responsáveis por infeções nosocomiais (infeções urinárias, respiratórias, bacterémia, feridas e tecidos). No Gram apresentam-se como cocobacilos. Crescem em meios culturais como MCK e GS. (72,76,79)

As colónias isoladas são identificadas usando cartas VITEK.

Género Legionella

Bacilos GN finos ou cocobacilos curtos, pleomórficos. São nutricionalmente fastidiosos e são difíceis de corar por Gram. Causam infeções hospitalares e são responsáveis pela doença dos legionários (pneumonia severa) e febre de Pontiac (semelhante à gripe). O teste de diagnostico de escolha requer o uso de meios de cultura

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com L-cisteína e sais de ferro. Os imunoensaios são utilizados para detetar antigénios específicos do sorotipo 1 de Legionella excretados na urina de pacientes infetados. (76,79)

Teste rápido para Legionella

Teste rápido imunocromatográfico para a deteção qualitativa do antigénio de Legionella pneumophila (serogrupo 1), em urina de pacientes com sintomas de pneumonia. Esta patologia é caracterizada por pneumonia grave com quadro febril, que pode ser fatal. (76,87)

O procedimento passa por molhar uma zaragatoa na amostra de urina e inseri-la no cartão de teste. É adicionado um reagente e o cartão é fechado, de modo a colocar a amostra em contacto com a tira de teste com os anticorpos. O resultado é interpretado após 15 minutos, através da presença ou ausência das linhas de teste. A linha de controlo também deverá ser observada. (87)

Género Brucella

Composto por organismos zoonóticos que ocasionalmente causam doença em seres humanos. São cocobacilos GN muito pequenos, oxidase positivos, aeróbios, que requerem incubação prolongada, podendo crescer em meios de cultura enriquecidos com sangue. A brucelose pode ser difícil diagnosticar porque tem sintomas iniciais não específicos e pode progredir para envolvimento sistémico (trato gastrointestinal, ossos, articulações, trato respiratório e outros órgãos). A serologia é utilizada para confirmação do diagnóstico. (72,76)

No laboratório, é utilizado um teste de aglutinação em carta (Antigénio Rosa Bengala) para a confirmação serológica do género Brucella em amostras de soro. Num dos círculos de uma carta, é colocado antigénio homogeneizado e amostra a testar, misturando e agitando a carta durante 4 minutos. No caso de uma reação positiva, é verificada aglutinação, indicando a presença de anticorpos específicos no soro testado. (88)

4.2.5.4.Identificação de bacilos GP

Género Clostridium

São organismos ubiquitários e fazem farte da flora gastrointestinal. A maioria é saprófita, mas alguns provocam patologias como diarreias, colite, tétano, septicémias.

103 São bacilos GP grandes, móveis ou não, produtores ou não de toxinas. As espécies mais isoladas são C.perfringens e C.difficile, causadores de patologias gastrointestinais. Estes organismos podem ser identificados microscopicamente e crescem rapidamente em meios de cultura usuais. (76,79)

No laboratório está disponível um teste rápido que consiste num ensaio imunoenzimático para a deteção simultânea do antigénio glutamato desidrogenase (para avaliar a presença da bactéria) e das toxinas A e B do Clostridium difficile em amostras de fezes. (83)

Caso este teste tenha um resultado duvidoso, é utilizado o aparelho GenomEra CDX™ system, que realiza um teste de PCR para identificar a presença de Clostridium difficile toxinogénico numa amostra de fezes. Este teste deteta de forma rápida e específica o gene tcdB, que codifica a toxina B. (75)

Género Bacillus

São bacilos GP, longos e finos, isolados ou em cadeia. São aeróbios e anaeróbios facultativos, formadores de esporos e toxinas. O Bacillus cereus é a espécie mais isolada, que provoca gastroenterites, infeções oculares, sepsis e doença pulmonar. Estas espécies crescem rapidamente e são facilmente detetadas pela coloração de Gram. (76,79)

Género Listeria

A espécie mais comum é a L.monocytogenes, presentes na flora intestinal do homem e na flora comensal de outros animais e no ambiente. São bacilos GP, móveis à temperatura ambiente, anaeróbios facultativos, que podem ocorrer isolados, em pares ou em cadeia curta. São catalase positiva. A microsocopia não é sensível, pois podem ser confundidos com S. pneumoniae e Enterococcus. Quando cultivado em placa de agar sangue de carneiro apresenta β-hemólise fraca. Esta espécie é causadora de meningite, doenças neonatais e sépsis. Causa infeções mais frequentemente na mulher grávida, recém-nascidos e imunocomprometidos. (72,76,79)

4.2.5.5.Género Mycobacterium

Este género consiste em bacilos aeróbios, imóveis, não formadores de esporos. São bactérias muito fastidiosas e crescem muito lentamente, sendo a cultura ainda o método de referência para o diagnóstico de infeções provocadas por este organismo. M.

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tuberculosis será a espécie patogénica mais conhecida, responsável não só, mas principalmente por infeção pulmonar grave. A parede celular é rica em lípidos, o que torna a superfície hidrofóbica e a micobactéria resistente a várias colorações comuns de laboratório, como Gram. (76,79)

Para a pesquisa deste género de bactérias é realizado exame direto corado com Kinyon, em que as amostras podem ser variadas (expetoração, urina, LBA, etc.). Amostras com pedido de exame cultural são enviadas para fora.