Universidade Estadual de Campinas
Instituto de Física “Gleb Wataghin”
Moniellen Pires Monteiro
Estudo de processos de adesão bacteriana: propriedades mecânicas e
efeitos do microambiente sobre adesão, crescimento e mobilidade da
Xylella fastidiosa
Campinas
2017
Moniellen Pires Monteiro
Estudo de processos de adesão bacteriana: propriedades mecânicas e
efeitos do microambiente sobre adesão, crescimento e mobilidade da
Xylella fastidiosa
Orientadora: Mônica Alonso Cotta
Campinas
2017
Tese apresentada ao Instituto de Física Gleb Wataghin da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em ciências.
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Moniellen Pires Monteiro, e orientada pela professora doutora Mônica Alonso Cotta.
A minha mãe Mônica, por todo amor, paciência e incentivo.
Agradecimentos
A Deus por ter sido meu porto seguro em todos os momentos e por ter me proporcionado alcançar mais essa vitória. A Ele toda honra e toda glória.
A minha mãe Mônica e meu padrasto Mário, pelo apoio incondicional em todos os momentos, por tanta paciência comigo e amor.
A minha orientadora professora Mônica Cotta, por toda paciência diante das minhas dificuldades e limitações, por todo conhecimento transmitido, pela amizade e puxões de orelha. Por ter me tornado uma profissional melhor agradeço.
A pesquisadora Dra. Alessandra Alves de Souza (Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC) pela colaboração durante todo o desenvolvimento deste trabalho. E por fornecer o “material de trabalho”.
Aos professores Varlei Rodrigues e Antônio Riul pela colaboração e frutíferas discussões.
Ao engenheiro João Hermes pelo apoio, conhecimentos transmitidos, conversas e pela amizade.
Aos amigos Duber e Richard, pelos conhecimentos transmitidos e todas as discussões que foram imprescindíveis para este trabalho.
A Maria Luisa, Jacobo e Prasana, pela amizade e colaboração neste trabalho.
Aos amigos que Campinas me deu de presente Rafael, Adinei, Mariana, Bruno, Aldeliane que proporcionaram momentos únicos de muito riso, companheirismo, estudo e conversas construtivas.
A Pedro Júnior meu amigo-irmão, que mesmo de longe sempre me apoiou e me aguentou nos momentos difíceis.
Ao IFGW e UNICAMP pelo aprendizado, apoio e infraestrutura.
Aos técnicos do LAMULT-IFGW e ao Dr. Vitor Pelegatti do INFABIC pela ajuda no uso de equipamentos.
Ao laboratório de microfabricação do LNNano, pelo aprendizado na fabricação de dispositivos microfluídicos.
À Capes pela concessão da bolsa de doutorado.
Resumo
Nesta tese investigamos processos de adesão da Xylella fastidiosa, bactéria gram-negativa, fitopatógena, que forma biofilmes no xilema de plantas. O trabalho teve como objetivos entender alguns aspectos do processo de adesão bacteriana e do mecanismo de transporte de células e biofilmes em sistemas que simulam os vasos do xilema. Consideramos em particular as estratégias utilizadas pela X.fastidiosa para aderir à superfície, dentre elas, a secreção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS), a presença de adesinas fimbriais (pili) e afimbriais (XadA1) e moléculas sinalizadoras de detecção de quórum (relacionadas à formação de agregados).
Como ponto de partida quantificamos as propriedades elásticas do sistema composto pelo EPS e células bacterianas, em diferentes tempos de cultivo bacteriano. Para isso utilizamos medidas de espectroscopia de força e Raman confocal durante os estágios iniciais de adesão celular e formação de agregados. Mostramos que a rigidez do sistema célula/EPS diminui progressivamente com o aumento do tempo de crescimento bacteriano. Verificamos que existe uma mudança no valor de rigidez em diferentes partes da célula, região polar e corpo bacteriano; os menores valores de rigidez encontrados no polo sugerem uma resposta mecânica mais flexível nesta região, associada com o ponto de adesão inicial da célula à superfície.
No estudo de adesão e mobilidade da X.fastidiosa, utilizamos dispositivos microfluídicos modificados quimicamente, via funcionalização de superfície (em microcanais
Polidimetilsiloxano/vidro) e via introdução de molécula de detecção de quórum (em microcanais impressos em poliácido láctico), para tornar o ambiente mais próximo ao do xilema da planta. Foram feitas funcionalizações de superfície com uma celulose sintética, simulando a composição química dos vasos do xilema (majoritariamente composto por celulose), e com a adesina XadA1, e observamos os efeitos sobre a adesão, crescimento e mobilidade celular. Verificamos que a adesina XadA1 aumenta a densidade bacteriana se comparada às demais superficies, além de aumentar a força de adesão bacteriana à superfície. Quanto a inserção de molécula sinalizadora, observamos que a presença destas moléculas no cultivo bacteriano aumenta a densidade celular e altera a forma de pequenos agregados.
Abstract
In this thesis we investigated the adhesion processes of Xylella fastidiosa, a gram-negative, phytopathogenic bacterium that forms biofilms in the xylem of plants. The objective of this work was the understanding of several aspects of the bacterial adhesion process, as well as the mechanism of cell and biofilm transport in systems that simulate xylem vessels. In particular, we considered the strategies used by X.fastidiosa to adhere to a surface; among them, the secretion of extracellular polymeric substances (EPS), the presence of fimbrial (pili) and afimbrial (XadA1) adhesins and quorum detection molecules (related to cluster formation).
As a starting point we quantified the elastic properties of the system composed of EPS and bacterial cells, at different times of bacterial culture. For this purpose, we used force spectroscopy and confocal Raman measurements during the initial stages of cell adhesion and cluster formation. We have shown that stiffness decreases progressively with increasing bacterial growth time. We observed that stiffness values varied along different parts of the cell, polar region and bacterial body. The lower stiffness values found at the pole suggest a more flexible mechanical response in this region, associated with the initial adhesion point of the cell to the surface.
For the investigation on X.fastidiosa adhesion and mobility, we used chemically modified microfluidic devices via surface functionalization (in Polydimethylsiloxane / glass microchannels) and via the introduction of a quorum detection molecule (in microchannels printed on polylactic acid) to make the environment more closely resemble the plant xylem. Surface functionalizations were performed with a synthetic cellulose, simulating the chemical composition of xylem vessels (mainly composed of cellulose), and the XadA1 adhesin, and we observed the effects on cell adhesion, growth and mobility. Our results showed that immobilized XadA1 increased the bacterial density when compared to other surfaces studied; furthermore, it increased the bacterial adhesion force to the surface. Regarding the addition of the signaling molecules, we observed that their presence in the bacterial culture increases cell density and changes the shape of small clusters.
Lista de figuras
Figura 2.1 – Ilustração de etapas de formação do biofilme bacteriano [32]. ... 26
Figura 2.2 - Ilustração do processo de transmissão da X.fastidiosa para os vasos da planta. Figura adaptada [9]. ... 29
Figura 2.3 - Cortes transversais de vasos do xilema da citros, ilustrando o processo de formação do biofilme da X.fastidiosa. Figura adaptada de Alves et al [7,52]. ... 30
Figura 2.4 - Ilustração da regiões da célula citada nesta tese, região polar celular e corpo celular. ... 31
Figura 2.5 - Corpo sólido submetido a força aplicada na direção normal. ... 33
Figura 2.6 – Gráficos ilustrando em (a) Força aplicada (F) versus deformação (δ), e em (b) Tensão-deformação (σ-ε), forma normalizada da curva de força-deformação, para obtenção de parâmetro elástico puramente do material analisado. ... 34
Figura 2.7 - Regimes de fluxo. (a) Fluxo laminar e (b) Fluxo turbulento. ... 37
Figura 2.8 - Ilustração de microcanal retangular com partícula (célula) aderida na parte inferior. Figura adaptada [16]. ... 38
Figura 3.1 - Design do dispositivo microfluídico de PDMS/vidro. ... 43
Figura 3.2 - Etapas do processo de fabricação do dispositivo microfluídico com microcanais comunicantes. ... 44
Figura 3.3 - Dispositivo microfluídico impresso em PLA. ... 45
Figura 3.4- Criação de sítios OH ativos sobre a superfície do vidro. ... 46
Figura 3.5 - Introdução de grupos amina na superfície. ... 46
Figura 3.6 - Reação da CMC com EDC e NHS, para ativar as ligações químicas e gerar a solução ativa para tratamento de superfície [105]. ... 47
Figura 3.7 - Ilustração de funcionamento do microscópio de fluorescência de amplo campo. Figura adaptada [110]. ... 51
Figura 3.8 - Esquema de funcionamento do microscópio de fluorescência confocal. Figura adaptada [110]. ... 52
Figura 3.9 – Níveis de energia envolvidos em espectroscopia Raman. Figura extraída de (https://en.wikipedia.org/wiki/Raman_spectroscopy). ... 53
Figura 3.10 - Esquema de funcionamento do microscópio Raman confocal. Figura adaptada [114]. ... 55
Figura 3.11 - Esquema de detecção óptica de deflexão da alavanca no AFM. Figura adaptada JPK Instruments. ... 56 Figura 3.12 - Comportamento qualitativo da dependência do potencial da força interatômica com a distância entre a ponta de prova e a superfície da amostra. Figura adaptada de Leite et al. [116]. ... 56 Figura 3.13- Esquema para operação do AFM no modo contato. ... 58 Figura 3.14 - Aproximação da alavanca por um sistema massa mola [123]. ... 59 Figura 3.15 – Ilustração da medida de força utilizando a técnica de espectroscopia de força com AFM. Em (a) interação ponta amostra, mostrando a indentação δ provocada pela aplicação de uma dada força F. Em (b) curva de força típica obtida para matéria dura. ... 60 Figura 3.16 – Ilustração de curva de força distância obtida para matéria mole (PDMS) usando a técnica de espectroscopia de força. Adaptada de J. Notbohm, et al. [76]... 61 Figura 3.17 - (a) Imagem da gota sobre a superfície de interesse, θ representa o ângulo de contato medido. (b) Ilustração do perfil da gota em relação ao grau de hidrofobicidade/hidrofilicidade da superfície. ... 62 Figura 4.1 - Diferentes estágios da parte inicial do ciclo de adesão bacteriana. Imagens WFM mostrando a distribuição espacial para amostras com diferentes tempos de crescimento: (a) para dois dias de crescimento, são vistas células alongadas e células únicas bem como agregados; (b) após três dias, predominantemente pequenos agregados e biofilmes; (c) para 5 dias, pequenos agregados e alguns biofilmes. (d) Imagem de maior magnificação de um biofilme da amostra com 5 dias de crescimento, mostrando sua estrutura e cobertura em maior detalhe. As células bacterianas aqui mostradas foram cultivadas em substrato de vidro. ... 65 Figura 4.2 -Espectro Raman confocal para amostra com dois dias de crescimento, cultivada sobre substrato de vidro. O espectro Raman mostra bandas de moléculas orgânicas usualmente presentes em EPS, para um agregado e um biofilme pequenos, localizados na mesma amostra. O espectro foi adquirido com uma excitação em 532nm, tempo de aquisição de 20s, 20 acumulações... 67 Figura 4.3 - Espectro Raman confocal para amostra lavada. O espectro Raman mostra bandas de moléculas orgânicas usualmente presentes em EPS, para um agregado (cluster) pequeno. O espectro foi adquirido com uma excitação em 532 nm, tempo de aquisição de 20 s, 20 acumulações... 68 Figura 4.4 - Imagens WFM de amostras com células submetidas a processo de lavagem para remoção de EPS. Em (a) mostramos somente a emissão do GFP presente nas células bacterianas
e EPS (excitação/emissão ~ 475/509 nm). Em (b) emissão do WGA-Texas red, marcador fluorescente utilizado (excitação/emissão ~ 595/615 nm). ... 69 Figura 4.5 - Diferentes estágios da parte inicial do ciclo de vida bacteriano. Imagens de CLSM mostrando a distribuição espacial das células durante (a) 2 dias, (b) 3 dias, (c)-(d) 5 dias de crescimento. Flechas indicam formas esféricas, com diâmetro em torno de 500nm, que podem representar vesículas. ... 70 Figura 4.6 - Imagens de Microscopia de Força Atômica. (a) Topografia e (b) deflexão vertical de uma amostra de Xylella fastidiosa com 2 dias de crescimento, cultivada sobre substrato de vidro. (c) – (d) Imagens de topografia para culturas de células com 3 e 5 dias de crescimento, respectivamente. As flechas nas imagens (a) e (b) indicam estruturas esféricas nos polos bacterianos. ... 71 Figura 4.7 - Curvas de força de aproximação e retração para as regiões polar (a) e corpo bacteriano (b), para amostra com dois dias de crescimento. ... 73 Figura 4.8 - Curvas de força de aproximação e retração para as regiões (a) de maior altura do biofilme e (b) de menor altura, cultivo com 5 dias de crescimento... 74 Figura 4.9 - Gráficos box plot e análise estatística. Valores de stiffness obtidos em diferentes pontos ao longo das amostras com (a) 2, 3 e 5 dias de crescimento. (b) Valores de stiffness adquiridos nas regiões polar e do corpo bacteriano para amostra crescida por 2 dias. Para todos os box plots foram feitas análises one-way Anova com subsequente teste Tukey post-hoc para comparar os valores de stiffness e sua significância estatística; o asterisco indica o nível de significância, p=0,001(***) e p=0,0001(****). ... 74 Figura 4.10 - Gráfico com ângulos de contato medidos para cada tratamento de superfície, em vidro e PDMS. ... 76 Figura 4.11 - Densidade bacteriana em função do tipo de substrato (plano ou microcanal) e do tipo de funcionalização química de superfície. ... 77 Figura 4.12 - Gráfico da densidade bacteriana em função do tempo que circula meio de cultura à taxa constante, para microcanais com diferentes funcionalizações de superfície. Tensão de cisalhamento τ = 1 dyn/cm2. ... 79 Figura 4.13 – Frames extraídos de um vídeo ilustrando o movimento de translação de células no microcanal funcionalizado com XadA1. Em (a) primeiro frame extraído (instante inicial do movimento); (b) 00:03 segundos após primeiro frame; e em (c) 00:06 segundos após primeiro frame capturado. ... 81
Figura 4.14 - Movimento de oscilação em torno de um polo fixo, para amostra no microcanal controle. A região marcada com um círculo branco ilustra polos que se movem em relação ao polo fixo. Em (a) é ilustrado o instante inicial onde ainda não houve oscilação, e em (b) têm-se linhas de trajetória produzidas pelo movimento oscilatório. ... 82 Figura 4.15 - (a) Imagem WFM de uma seção no meio de um microcanal controle após 39hs de tempo de crescimento, (b) histograma mostrando o deslocamento dos polos, marcados por pontos coloridos com inset para direção de deslocamento destes polos. ... 83 Figura 4.16 – Imagem de WFM ilustrando a distribuição espacial celular para os dispositivos microfluídicos (a) controle e (b) funcionalizado com XadA1. Tempo de crescimento total aproximado de 8 hs, Q= 2 µL/min. ... 86 Figura 4.17 - Gráfico do número de células únicas aderidas à superfície em função da tensão de cisalhamento provocado pelas variações de fluxo. Incerteza experimental ±2 células. ... 87 Figura 4.18 – Imagens WFM de células sendo removidas da superfície. Em (a) células deslizando sobre a superfície antes de serem completamente removidas, valor da tensão de cisalhamento = 160dyn/cm2. Em (b) células sendo removidas abruptamente da superfície, valor da tensão de cisalhamento =320 dyn/cm2. ... 89 Figura 4.19 – Gráfico de barras ilustrando o número de células única removidas abruptamente de cada superfície em função da tensão de cisalhamento. O número total de células removidas nos casos controle e XadA1 foram 30 e 8, respectivamente. ... 90 Figura 4.20 - Gráfico ilustrando os valores calculados de força de arraste correspondentes a cada variação de taxa de fluxo. ... 90 Figura 4.21 - Gráficos de barra ilustrando o número de células únicas que desprendem da superfície em função da força de arraste para os dispositivos (a) controle e (b)XadA1. ... 91 Figura 4.22 - Imagem WFM ilustrando biofilme preso na entrada do microcanal, em dispositivo microfluídico controle. ... 92 Figura 4.23 - Imagens WFM de um biofilme confinado em um microcanal. O biofilme de X.
fluxo simulando os vasos do xilema. A taxa de fluxo foi mantida constante, programada em 56 µL/min. Os frames mostrados foram extraídos de um vídeo e suas intensidades foram normalizadas utilizando a régua de cores e ajustando o máximo e mínimo de todas imagens para a mesma base de valores. ... 93 Figura 4.24 - Ilustração do dispositivo microfluídico impresso, com indicações das regiões dos microcanais. ... 95
Figura 4.25 - Gráficos box plot da porcentagem de área coberta de superfície do microcanal para diferentes tempos de crescimento bacteriano. Em (a) experimento controle, (b) cultivo com inserção da molécula sinalizadora. ... 95 Figura 4.26 - Imagem de WFM ilustrando agregados nos diferentes tempos de cultivo. De (a)-(c) agregados obtidos em imagens feitas no dispositivo controle, (d)-(e) agregados obtidos em imagens feitas no dispositivo com fluxo de DSF. ... 96 Figura 4.27 - Imagens SEM da membrana de policarbonato utilizada como via de comunicação entre os canais no dispositivo impresso em PLA, obtidas por Mariana Zavarize. Em (a) imagem de menor magnificação, ilustrando distribuição não uniforme dos poros, (b) imagem de maior magnificação. ... 98
Lista de Abreviaturas e Siglas
EPS Subtâncias Poliméricas Extra celulares (do inglês
Extracellular Polymeric Substances)
PDMS Polidimetilsiloxano
PIA Adesina intercelular polissacarídica
DNA Ácido desoxirribonucleico
TB-EPS EPS fortemente ligado (do inglês Tightly-bound EPS)
LB-EPS EPS fracamente ligado (do inglês Loosely-bound EPS)
S-EPS EPS solúvel (do inglês Soluble EPS)
QS Detecção de quórum (do inglês Quorum Sensing)
AFM Microscopia de Força Atômica (do inglês Atomic Force
Microscopy)
DSF Diffusible Signal Factor
IA Autoindutores
Acil-HSL Acil-homoserina lactona
CVC Clorose Variegada do Citros
PLA Poliácido láctico
FDM Fused deposition modeling
DMSO Dimetilsulfóxido
CMC Carboxymethyl Cellulose
EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodimide
NHS N-Hydroxysuccinimide
MÊS 2-(N-morpholino)ethanesulfoni acid
XadA1 Proteína de adesão afimbrial da Xylella fastidiosa
PEG Polietilenoglicol
PBS Tampão fosfato-salino (do inglês phosphate buffered saline)
PW Perinwinkle Wilt (meio de cultura)
GFP Green Fluorescent Protein (fluoróforo)
NAG N-acetyl-D-glucosamine
CLSM Microscopia Confocal de Varredura Laser (do inglês Confocal Laser Scanning Microscopy)
WFM Microscopia de fluorescência de amplo campo (do inglês
Wide Field Microscopy)
OMVs Outer Membrane Vesicles
Sumário
Agradecimentos ... 6
Resumo ... 8
Abstract ... 9
Lista de figuras ... 10
Lista de Abreviaturas e Siglas ... 15
1. Introdução... 20
1.1 Apresentação do problema ... 20
1.2 Trabalho realizado e estrutura da tese ... 21
2. Introdução Geral ... 23
2.1 Adesão bacteriana ... 23
2.1.1 Adesinas fimbriais/Pili ... 24
2.1.2 Adesinas afimbriais ... 24
2.2 Formação do biofilme ... 24
2.3 Substâncias Poliméricas Extracelulares – EPS ... 26
2.4 Quorum sensing ... 27
2.5 Xylella fastidiosa ... 28
2.6 Propriedades mecânicas ... 32
2.7 Microfluídica ... 35
2.7.1 Regimes de fluxo ... 36
2.7.2 Dinâmica de fluidos e as forças exercidas sobre partículas aderidas na superfície do microcanal ... 37
2.7.3 Dispositivos microfluídicos e ambiente da planta ... 39
3. Materiais e Métodos ... 41
3.1 Substratos ... 41
3.3 Estirpe bacteriana e condições de cultivo ... 48
3.4 Preparação das amostras ... 48
3.4.1 Placas de Petri e substratos de vidro submetidos ou não à tratamento de superfície ... 48
3.4.3 Dispositivos microfluídicos de PDMS/vidro ... 49
3.4.4 Dispositivos microfluídicos de PLA ... 49
3.5 Procedimentos de lavagem e marcação fluorescente de amostras ... 50
3.5.1 Lavagem para remoção de EPS ... 50
3.5.2 Marcação fluorescente de polissacarídeos ... 50
3.6 Microscopia de fluorescência de amplo campo (Wide Field Microscopy - WFM)50 3.7 Microscopia de fluorescência confocal ... 52
3.8 Espectroscopia Raman Confocal ... 53
3.9 Microscopia de força atômica ... 55
3.10 Modo contato - Imagens de Topografia e Deflexão Vertical ... 57
3.11 Espectroscopia de força ... 58
3.12 Ângulo de contato ... 61
3.13 Tratamento de imagens e análises estatísticas ... 62
4. Resultados e Discussões ... 64
Parte I – Estudo de Propriedades Mecânicas ... 64
4.1 Variações na cobertura de EPS – dependência com o estágio de adesão e do tipo de aglomerado ... 64
4.2 Propriedades mecânicas variam com o tempo ... 69
Parte II – Efeitos do microambiente sobre adesão, crescimento e mobilidade da Xylella fastidiosa ... 75
4.3 Efeito da funcionalização de superfície e do uso de microambiente sobre a densidade bacteriana ... 75
4.5 Efeito da funcionalização da superfície sobre a velocidade das células livres (movimento
de translação) ao longo do tempo ... 83
4.6 Remoção de células únicas da superfície do microcanal provocadas por variações na taxa de fluxo do sistema microfluídico ... 85
4.7 Movimentação de um biofilme num microcanal ... 92
Parte III – Modificações na forma de agregados devido a introdução de molécula sinalizadora ... 94
4.8 Estudos preliminares da DSF (Diffusible Signaling Factor) sobre a forma dos agregados ... 94
5. Discussão Geral dos resultados obtidos ... 99
6. Conclusões ... 102
Referências ... 104
Apêndice 1 – Artigos publicados e aceitos ... 117
a) Nanowire Arrays as Cell Force Sensors To Investigate Adhesin- Enhanced Holdfast of Single Cell Bacteria and Biofilm Stability ... 117 b) Stiffness signatures along early stages of Xylella fastidiosa biofilm formation 118
1. Introdução
1.1 Apresentação do problema
Bactérias no estado planctônico (células isoladas, não aderidas) são mais suscetíveis à ação de antibióticos e menos protegidas contra o sistema de defesa do hospedeiro, podendo assim ser facilmente erradicadas. Por isso, na natureza, a maior parte da vida bacteriana se encontra em comunidades ligadas à superfícies, chamadas biofilmes. Os biofilmes são sistemas densamente empacotados nos quais as células compartilham muitas moléculas segregadas, incluindo enzimas e polímeros extracelulares. A formação do biofilme permite um estilo de vida completamente diferente do estado planctônico, uma vez que a matriz polimérica que envolve as células confere proteção contra biocidas convencionais, tratamentos antimicrobianos e contra respostas do sistema imunológico do hospedeiro [1–3]. Este fato torna os biofilmes uma ameaça por estarem associados a várias doenças humanas.
No processo de adesão bacteriana, precedente a formação do biofilme, as células excretam substâncias poliméricas extracelulares (EPS), que são basicamente um conjunto de polissacarídeos, podendo também incluir proteínas, ácidos nucléicos e lipídios [4]. Estas substâncias exercem um papel fundamental como mecanismo para aumentar a interação com a superfície, e na arquitetura do biofilme por imobilizar e manter as células próximas [1]. Os mecanismos de adesão bacteriana e subsequente formação do biofilme, ainda possuem lacunas a serem elucidadas. Este conhecimento poderia servir de ponto de partida para traçar rotas de prevenção à formação dos biofilmes e, consequentemente, ter mais eficácia no tratamento de infecções. Diante deste cenário, o interesse científico nestas etapas é crescente, tanto para o caso de bactérias humanas quanto fitopatógenas.
A bactéria Xylella fastidiosa é causadora de severas perdas econômicas para agroindústria em diversas partes do mundo, na indústria de vinhos [5], azeite [6], citros [7] e cafeicultura [8]. Sua transmissão ocorre por meio de um vetor (inseto) que injeta a bactéria nos vasos do xilema da planta ao se alimentar da seiva ali presente. Portanto, a patogenicidade da X.fastidiosa está associada à formação de biofilmes nos vasos do xilema, que diminuem ou impedem totalmente o fluxo de água e nutrientes para a planta [9,10].
Vários autores têm se dedicado ao estudo dos fenômenos que vão da transmissão da bactéria [11,12], aos estágios iniciais de adesão bacteriana que precedem a formação do biofilme [13–16], além dos mecanismos de sinalização utilizados pelas células para se comunicarem [9,17], na tentativa de compreender os gatilhos responsáveis pela formação destes sistemas complexos que são os biofilmes. Na literatura são encontrados ainda trabalhos utilizando dispositivos microfluídicos (cujos detalhes serão discutidos no capítulo 2) para investigação da mobilidade bacteriana [18,19] e do efeito de minerais (por exemplo, íons de Cu, Zn, Mg, Ca) sobre a adesão, formação de biofilme e virulência da X.fastidiosa, em condições de fluxo. Vale salientar que em nenhum destes estudos foi feita a aproximação para o ambiente encontrado pela bactéria nos vasos do xilema, do ponto de vista de composição química das paredes dos vasos.
1.2 Trabalho realizado e estrutura da tese
Este trabalho teve por objetivo caracterizar as propriedades mecânicas do sistema célula/EPS que forma o biofilme bacteriano, para preencher algumas lacunas encontradas na literatura, como o papel do EPS nos estágios iniciais de adesão bacteriana. Foi reportado por Janissen et al. [13] que as células de X.fastidiosa aderem à superfície pela região polar (extremidades da célula), e que apresentam nessa região um acúmulo de EPS. Como parte das nossas investigações, caracterizamos as propriedades elásticas da região polar em relação ao corpo bacteriano. Além disso, estudamos a adesão, crescimento e mobilidade da bactéria Xylella fastidiosa em superfícies funcionalizadas, com uma celulose sintética (para simular a composição dos vasos onde a bactéria se aloja) e com uma adesina (produzida pela célula e presente nos estágios iniciais de adesão, inclusive em vesículas secretadas pela bactéria), que aproximam o ambiente da planta.
Outro aspecto original deste trabalho foi o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico impresso com impressora 3D com uma geometria diferenciada, consistindo de dois microcanais comunicantes por meio de uma membrana permeável. Na literatura são reportados trabalhos com Xylella fastidiosa e microfluídica [16,19–21], mas em dispositivos convencionais de PDMS que apresentam algumas limitações, dentre elas a comunicação entre canais que é feita via introdução de uma camada de hidrogel, ao invés de membrana porosa comercial. Os dispositivos microfluídicos desenvolvidos em colaboração com o professor
Varlei Rodrigues (IFGW-UNICAMP) abrem novas perspectivas para estudos de microrganismos em ambiente microfluídico.
Os resultados mostrados neste trabalho foram divididos basicamente em duas partes. A primeira onde caracterizamos o grau de rigidez (stiffness) do sistema célula/EPS utilizando diversas técnicas de microscopia. Neste caso investigamos diferentes tempos do estágio inicial de adesão bacteriana em amostras secas cultivadas sobre vidro, substrato que permitiu fazer as diversas caracterizações no mesmo conjunto de amostras. Na segunda etapa utilizamos dispositivos microfluídicos convencionais, fabricados em PDMS e vidro, para estudar a adesão, crescimento e mobilidade celular em condições de fluxo constante e variável. Aproximamos o ambiente de cultivo com o encontrado nos vasos do xilema, utilizando funcionalização química de superfície. Dando continuidade aos estudos em ambiente microfluídico utilizamos os dispositivos impressos para verificar alterações fenotípicas causadas pela inserção de moléculas sinalizadoras da X.fastidiosa.
Deste modo, abordamos os principais conceitos físicos e biológicos utilizados nesta tese no capítulo 2. A metodologia experimental está descrita no capítulo 3, enquanto os resultados são mostrados e discutidos no capítulo 4. No capítulo 5 é apresentada uma discussão geral de todos resultados obtidos. Por fim as conclusões são apresentadas no capítulo 6.
2. Introdução Geral
2.1 Adesão bacteriana
A habilidade de células bacterianas de aderirem à uma superfície e interagir entre si, para eventualmente formar um aglomerado é crucial para a sobrevivência de qualquer microrganismo em ambientes complexos. Como resultado, diferentes estratégias destinadas a proporcionar interações específicas ou não específicas entre a célula bacteriana e a superfície foram desenvolvidas pelas próprias células.
Inicialmente é importante conhecer as forças envolvidas na interação entre a célula e a superfície. Em superfícies abióticas, as interações são não-específicas (por exemplo, hidrofóbicas), enquanto a adesão ao tecido vivo é realizada por meio de moléculas específicas (lectina, ligantes ou adesinas) que atuam como mecanismos de receptor-ligante [22]. Em ambos os casos, as interações são originárias das mesmas forças físico-químicas: ligações covalentes, forças de Van der Waals, forças eletrostáticas e interações ácido-base. A adesão forte entre uma bactéria e uma superfície ocorre se estes dois elementos são capazes de formar ligações covalentes, ou iônicas ou metálicas. Isso não impede que forças mais fracas, como as interações polares, de ligações de hidrogênio ou Van der Waals se tornem mais relevantes quando um grande número de contatos estiver envolvido [23,24].
No processo inicial de adesão celular à superfície, as bactérias são submetidas a forças repulsivas. Estas podem ser de origem eletrostática, devido à carga negativa presente no envelope celular e sua interação com a superfície, ou de origem hidrodinâmica quando a bactéria está no líquido próxima à superfície, no limiar de contato. Para ultrapassar estas duas barreiras repulsivas, as bactérias utilizam tipicamente organelas, tais como flagelos ou pili, que atuam como hélice ativa ou como gancho de fixação [25,26].
Após a célula ter se aderido à superfície fracamente, ela pode tornar a ligação à superfície mais forte através de adesinas específicas e / ou não específicas para eventualmente desencadear uma ligação irreversível. Esta ligação irreversível é fortemente influenciada por fatores ambientais (pH, salinidade, ...), pelas propriedades físico-químicas da superfície (
hidrofobicidade, carga, ...) e pela presença de filme condicionante na superfície, camada de contaminantes orgânicos e inorgânicos adsorvidos sobre a superfície e que alteram suas propriedades físico-químicas [24].
Para aprimorar o processo de adesão irreversível à superfície sob tais condições variáveis, as células bacterianas desenvolveram uma série de adesinas capazes de facilitar a adesão sob várias condições ambientais [27,28]. Todas as bactérias produzem múltiplas adesinas e algumas são reguladas ao nível da transcrição, permitindo que os organismos mudem de formas sésseis para planctônicas sob diferentes influências ambientais. Um exemplo é a S. epidermidis, que produz uma adesina intercelular polissacarídica (PIA) essencial para a adesão célula-célula e subsequente formação de biofilme [22].
2.1.1 Adesinas fimbriais/Pili
Adesinas fimbriais podem ser encontradas tanto em bactérias gram-positivas quanto gram-negativas. Também referidas como pili de ligação, estas fibras poliméricas estão envolvidas em um conjunto de funções, incluindo ligação a superfícies bióticas e abióticas, mobilidade, transferência de DNA e formação de biofilme. Visíveis na superfície celular usando microscopia eletrônica, adesinas fimbriais são complexos apêndices que muitas vezes exigem um grande número de proteínas para sua montagem adequada [24].
2.1.2 Adesinas afimbriais
Ao contrário das adesinas fimbriais, que possuem cadeias poliméricas longas, as adesinas não fimbriais são estruturas monoméricas (apenas uma cadeia polipeptídica) ou triméricas (três cadeias polipeptídicas) curtas. Este tipo de adesina está amplamente presente em bactérias e está envolvido na ligação de células a superfícies abióticas e / ou células hospedeiras, nas interações célula-célula e agregação celular. Além disso, também é mostrado que este tipo de adesina interage com vários componentes da matriz extracelular do biofilme, ligando as bactérias à matriz e mantendo a arquitetura do biofilme [24].
Na natureza a maior parte da vida bacteriana é encontrada em comunidades ligadas à superfície, chamadas biofilmes. Os biofilmes consistem basicamente de colônias envolvidas por uma matriz [29]. Esta é representada por um aglomerado de diferentes tipos de biopolímeros, e conhecida pelo nome substâncias poliméricas extracelulares (EPS). A matriz de EPS forma uma estrutura tridimensional com formas similares à de um cogumelo [30] ou de um tapete [31], e que é responsável pela adesão à superfície e coesão no biofilme [1].
A formação do biofilme permite às células um estilo de vida completamente diferente do estado planctônico, uma vez que a matriz polimérica confere proteção contra biocidas convencionais, tratamentos antimicrobianos e contra respostas do sistema imunológico do hospedeiro [32]. Com isso, são responsáveis pela colonização de uma grande variedade de dispositivos médicos e estão associados com várias doenças humanas, tais como endocardite nativa da válvula, infecções de queimaduras, otite média crônica com efusão e fibrose cística [2,32].
O processo de formação do biofilme é composto por diferentes estágios, iniciando-se pela adesão na superfície, seja de natureza biótica ou abiótica, proliferação bacteriana dentro de microcolônias e expansão, formando estruturas altamente organizadas. O modelo mais aceito atualmente divide a formação do biofilme em cinco etapas, ilustradas na Figura 2.1. A etapa 1 corresponde a adesão reversível das células na superfície (onde as células podem ser facilmente removidas por simples processos de lavagem); na etapa 2 ocorre a adesão irreversível que é mediada principalmente por interações moleculares específicas; em 3 inicia-se a primeira fase de maturação do biofilme, caracterizada pelo início do desenvolvimento de sua arquitetura; a segunda fase de maturação, ilustrada na etapa 4, corresponde ao biofilme totalmente maduro, com alta densidade celular e arquitetura de forma complexa; a etapa 5 corresponde à desestruturação do biofilme, normalmente por falta de nutrientes em seu interior, resultando na dispersão das células [32].
Figura 2.1 – Ilustração de etapas de formação do biofilme bacteriano [32].
2.3 Substâncias Poliméricas Extracelulares – EPS
As substâncias poliméricas extra celulares (EPS) são basicamente um conjunto de polissacarídeos, podendo também incluir proteínas, ácidos nucléicos e lipídios [4]. Estas substâncias produzidas pelas células bacterianas tem papel fundamental na arquitetura do biofilme por imobilizar e manter as células próximas. Isto permite que a força de interação entre células seja aumentada, propiciando a comunicação célula-célula [1].
No processo de adesão bacteriana, as células excretam EPS como mecanismo para aumentar a interação com a superfície. Dessa forma, o EPS também é responsável por mediar as transições de adesão reversível para irreversível de células únicas [33], e de facilitar a aderência de bactérias planctônicas [1,34,35]. A matriz polimérica também serve como fonte de nutriente para as células, além de protegê-las contra mecanismos de defesa do hospedeiro, ação de biocidas, antibióticos e radiação ultravioleta [1].
Ao longo das investigações feitas sobre essa matriz polimérica foram verificadas mudanças de composição e distribuição espacial, assim algumas classificações foram propostas. Os dois principais tipos foram originalmente considerados relativos a sua distribuição espacial: EPS capsular, associado ao recobrimento de células únicas e EPS slime, considerado como um fluido [36]. Atualmente, o EPS é classificado em três tipos, EPS fortemente ligado (tightly bound EPS/ TB-EPS), EPS fracamente ligado (loosely-bound EPS/ LB-EPS) e EPS solúvel (soluble EPS/ S-EPS), considerando as distribuições espacial e temporal e composição ao longo do ciclo bacteriano [13,34,37].
Considerando a distribuição espacial o TB-EPS está presente na cápsula que recobre as células, o LB-EPS na matriz do biofilme e o S-EPS na forma de fluido [37]. Quanto a composição, não é possível identificar um conjunto de moléculas que classifique uma composição característica de cada tipo de EPS. Porém, podemos encontrar assinaturas para alguns tipos de EPS utilizando espectroscopia Raman. Este é o caso do LB-EPS, onde são identificadas bandas correspondentes a vibração molecular de DNA e aminoácidos aromáticos (tirosina e triptofano), no intervalo Raman (1470-1620 cm-1) [13].
Outras bandas Raman são encontradas nas diferentes etapas do ciclo bacteriano, não estando diretamente relacionadas a um tipo de EPS. Este é o caso das bandas associadas a vibrações moleculares da Amida I em 1660 cm-1 [38] e Amida III em 1247 cm-1 [38,39], fortemente associadas à formação de EPS. Alguns trabalhos apresentam também bandas genéricas que podem estar associadas a deformações de mais de uma molécula orgânica, como a banda em 1451 cm-1 que pode ser associada a deformações em proteínas, carboidratos e lipídios [38,40,41], e a banda em 1247 cm-1 que pode ser associada a deformações do tipo δ(CH
2) em carboidratos [42].
2.4 Quorum sensing
Em geral, o biofilme apresenta uma alta densidade de células se comparada à população de células planctônicas flutuantes, ocupando um mesmo volume. Uma consequência disso é o surgimento de níveis elevados de subprodutos metabólicos, metabólitos secundários e outros fatores microbianos secretados ou excretados pelas células no ambiente do biofilme. Particularmente, podem ser encontradas as moléculas de Quorum Sensing (QS).
QS é um termo usado para descrever a sinalização intercelular em bactérias. Considerado um fenômeno dependente da densidade celular, isto é, os microrganismos sentem a densidade celular em seu entorno, julgam se a densidade celular é suficiente para uma resposta coordenada e, posteriormente, alteram a expressão genética para dar essa resposta.
Os microrganismos formam agregados celulares, passando de células isoladas a comunidades tridimensionais (3D). Esta estrutura agregada influencia a comunicação célula-célula, afetando tanto as propriedades de transferência de massa das moléculas de sinalização como a distribuição espacial das células. A transferência de massa de moléculas de sinalização
determina especificamente a capacidade dos microrganismos para detectar a concentração local de autoindutores (IAs) e influencia significativamente o QS bacteriano [43].
Embora se conheçam vários sistemas de QS, talvez os dois sistemas mais completamente descritos sejam os sistemas de acil-homoserina lactona (acil-HSL) de muitas espécies negativas e os sistemas de sinalização baseados em peptídeos de muitas espécies Gram-positivas [44,45]. Diversas investigações têm sido feitas nesses sistemas para relacionar a formação de biofilmes e agregados ao QS.
Como os biofilmes geralmente consistem em agregados de células, pode-se argumentar que eles representam um contexto ambientalmente relevante para a detecção de quorum. Muitos grupos têm se dedicado ao estudo do papel das moléculas de QS na formação do biofilme e seu desenvolvimento. Para algumas espécies, há evidências de que QS é importante para a construção e/ou dissolução de comunidades de biofilmes [44]. Estudos recentes em Pseudomonas aeruginosa, bactéria gram-negativa responsável por doenças em seres humanos, reportaram que o quorum sensing é crucial para formação do biofilme [45]. Em investigação da distribuição celular sobre o QS em Vibrio harveyi, bactéria gram-negativa e patógeno oportunista de animais marinhos, verificou-se que os agregados celulares exibiram uma capacidade QS muito mais forte do que as células com uma distribuição uniforme [43].
2.5 Xylella fastidiosa
Para investigar as propriedades mecânicas do sistema célula/EPS e os efeitos do microambiente sobre adesão, crescimento e mobilidade, escolhemos como modelo a bactéria Xylella fastidiosa. Esta bactéria, gram-negativa e habitante do xilema, é responsável por doenças economicamente importantes em várias fitoculturas [8,46,47]. No Brasil, ela causa a clorose variegada do citros (CVC), uma doença que causa perdas anuais de aproximadamente US$100 milhões para a agroindústria de citros. Por esta razão, a Xylella fastidiosa foi o primeiro fitopatógeno com genoma completo sequenciado, atividade realizada por consórcio de pesquisadores brasileiros [10]. A causa geralmente aceita para os sintomas induzidos por esta bactéria nas plantas é a oclusão vascular dentro dos vasos, levando a planta a estresse hídrico. Foi demonstrado que esta bactéria cresce como biofilme [48] e que este pode ser um fator importante para sua patogenicidade [49].
A bactéria Xylella fastidiosa tem a forma de bastão com dimensões variáveis, aproximadamente 300-500 nm de diâmetro e comprimento entre 1-3,5 µm [50], podendo ser observadas células alongadas/filamentadas de até 50 µm [13]. Esta bactéria apresenta mecanismo de locomoção lento, devido à ausência de flagelos [18]. Uma consideração relevante diz respeito ao crescimento celular, que se caracteriza por apresentar uma taxa de crescimento lenta (processo de divisão 5-48 hs) [51].
A transmissão da X.fastidiosa ocorre por meio de um vetor para as plantas, a cigarrinha Cicadellidae [10]. Quando o vetor entra em contato com a planta para se alimentar da seiva bruta do xilema das plantas, ocorre a transmissão para os vasos, conforme ilustrado na Figura 2.2. A bactéria fica limitada ao xilema; por essa razão sua sobrevivência depende essencialmente da migração pelos vasos da planta hospedeira.
Figura 2.2 - Ilustração do processo de transmissão da X.fastidiosa para os vasos da planta. Figura adaptada [9].
A Figura 2.3 ilustra o processo de colonização dos vasos do xilema, após a transmissão da bactéria pelo vetor. Em (A) as células bacterianas ocupam os vasos do xilema da planta, aderindo inicialmente às suas paredes com algumas poucas células únicas e aglomerados; aos poucos inicia-se o processo de formação do biofilme bacteriano. O biofilme se desenvolve dentro do vaso da planta, com o aumento do número de células e produção de EPS até chegar a etapa final de maturação Figura 2.3 (B-C). Em Figura 2.3 (D) é ilustrada a etapa de oclusão do vaso, onde a passagem de nutrientes e água está completamente obstruída.
Figura 2.3 - Cortes transversais de vasos do xilema da citros, ilustrando o processo de formação do biofilme da X.fastidiosa. Figura adaptada de Alves et al [7,52].
De maneira geral, os mecanismos usados pelas células para migrar de um vaso a outro no xilema da planta não foram ainda inteiramente determinados [53]. Contudo, observações do movimento de células únicas e biofilmes foram reportadas em estágios iniciais de adesão mediada por EPS [54–56], bem como o movimento de agregados desprendendo do biofilme, em estágios de dispersão celular [57].
Na literatura são relatadas duas estruturas presentes no xilema da planta, que podem ser responsáveis pela comunicação entre os vasos e, consequentemente, migração de células. As estruturas são as pit membranes, ilustradas na Figura 2.2, e os vasos escalariformes. O movimento das células é um processo ativo e parece ser dependente da habilidade das pit membranes de interrompê-lo. Para que seja possível a migração de células de um vaso a outro, a bactéria produz enzimas capazes de degradar essas estruturas [9,12]. Já os vasos escalariformes, estão localizados em regiões mais internas do xilema [7]. Eles permitem que as células migrem mais facilmente entre os vasos [12].
Vários estudos têm sido feitos para entender os mecanismos de adesão da X.fastidiosa em condições estáticas de observação. Janissen et al. [13] mostraram que a adesão se inicia pela região polar da célula (Figura 2.4), onde o EPS acumula primeiro. Neste ponto de contato da célula bacteriana com a superfície foram identificadas estruturas na forma de discos, utilizando
imagens de microscopia eletrônica e medidas de potencial de superfície. Através de marcações químicas específicas para polissacarídeos, estes discos foram associados a presença de EPS solúvel. Possivelmente, essa camada de EPS funcionava como estratégia para aumentar a adesão no ponto de contato. Observaram também que existia uma diferença na assinatura elétrica da região polar se comparada com o corpo bacteriano, indicando diferença na composição química dessas duas regiões.
Figura 2.4 - Ilustração da regiões da célula citada nesta tese, região polar celular e corpo celular.
Quanto ao processo de formação e desenvolvimento do biofilme, Janissen et al. [13] mostraram que a estrutura inteira do biofilme é ancorada a superfície somente por um número relativamente baixo de células, e que estas em sua maioria estavam aderidas pela região polar conforme descrito acima.
Na seção 2.1 discutimos que existem alguns mecanismos desenvolvidos pelas próprias células para favorecer a adesão à superfície, como adesinas fimbriais e afimbriais. No genoma da X.fastidiosa foram encontrados vários genes associados a adesão bacteriana, e foram identificados vários tipos de adesina. Estas proteínas fimbriais incluem pili de comprimento variável entre 0,4 µm e 1 µm, que aparecem como filamentos nas extremidades das células. Entre as adesinas afimbriais podemos citar a XadA1 [15].
Caserta et al. [58] observaram que a adesina XadA1 para X.fastidiosa da estirpe citros apresenta alta expressão durante toda a formação do biofilme, inclusive em estágios iniciais, indicando o envolvimento desta proteína tanto na adesão célula-superfície quanto na adesão célula-célula. Sahoo et al. [54] também contribuíram para o estudo da adesina XadA1, identificando a distribuição espacial desta em cultivos da X.fastidiosa estirpe citros. Através da marcação fluorescente específica para adesina XadA1, verificou-se que a adesina se encontra na membrana da X.fastidiosa da estirpe citros e em vesículas presentes nos cultivos. Os nanofios
foram utilizados como sensor de força de adesão; foram medidos valores 2 vezes maiores na superfície com XadA1 do que os obtidos na superfície não tratada de InP, indicando que esta adesina de fato aumenta a adesão bacteriana.
Vale salientar que todos estudos de adesão bacteriana da X.fastidiosa foram feitos em meio estático, portanto sem considerar as forças devido ao fluido às quais as células são submetidas em ambiente real (nos vasos do xilema). Neste trabalho tivemos como objetivo estudar a adesão, crescimento e mobilidade celular em condições de fluxo, de forma a simular o ambiente em que as bactérias estão inseridas na planta.
2.6 Propriedades mecânicas
A biomecânica de células humanas e biomoléculas têm sido alvo de estudo por diversas razões. O corpo humano é constantemente exposto à diversas fontes de stress físico. Interações biofísicas dele decorrentes ocorrem em diferentes níveis, dos macroscópicos, como no sistema músculo-esqueleto, até níveis celulares e moleculares. Deste modo, a investigação sobre processos biomecânicos fornece informações quantitativas sobre mudanças nas propriedades físicas de células e biomoléculas que permitem, por exemplo, mapear a progressão de certas doenças cardíacas [59] e câncer [46].
As propriedades mecânicas de células vivas têm sido quantificadas utilizando vários métodos, tais como micropipeta de aspiração, pinças ópticas e magnéticas [60,61], nanofios semicondutores [62] ou micropilares de PDMS [63], e nanoindentação. As limitações e especificidades de cada técnica orientam a escolha para uma dada aplicação, assim como a melhor maneira de obter a resposta de uma dada região da amostra [64].
Nesta seção será dada ênfase a técnica de nanoindentação, utilizada neste trabalho. Comparando com as demais técnicas de medida, a nanoindentação traz como vantagens o mapeamento da amostra em alta resolução, um bom controle da posição da ponta de prova sobre a região de interesse da amostra, além da flexibilidade de usar pontas de prova de diferentes geometrias (cônica, esférica, piramidal) para obtenção de respostas mecânicas específicas de cada região de interesse da amostra [65].
A técnica de nanoindentação pode ser aplicada utilizando um nanoindentador ou um microscópio de força atômica (AFM). Os nanoindentadores são em geral utilizados para medir
propriedades mecânicas de materiais rígidos, como cerâmicas [66]. Já o AFM é mais utilizado na análise de matéria mole [67–69], pois pode operar com forças menores se comparadas as forças utilizadas nos nanoindentadores [70]. Em ambas as técnicas obtemos curvas que relacionam a força aplicada e a profundidade de penetração. A partir delas, é possível obter os parâmetros que caracterizam as propriedades mecânicas do material.
Para definir esses parâmetros podemos considerar um exemplo simples de um corpo sólido submetido a uma dada força aplicada e a deformação gerada por esta força (Figura 2.5).
Figura 2.5 - Corpo sólido submetido a força aplicada na direção normal.
O stiffness (k) é a medida da força aplicada necessária para induzir uma dada deformação no material. Considerando a curva de força aplicada versus deformação mostrada na Figura 2.6a, k é determinado pelo coeficiente angular da curva. Este parâmetro não caracteriza unicamente o material, pois é obtido como uma resposta elástica do material e da sonda de prova de forma conjunta. Assim, é usado para comparar materiais de forma qualitativa, fornecendo a informação do grau de rigidez. São encontrados diversos trabalhos na literatura que utilizam o stiffness para caracterizar o grau de rigidez de células cancerígenas [71,72] e de células bacterianas [73].
Figura 2.6 – Gráficos ilustrando em (a) Força aplicada (F) versus deformação (δ), e em (b) Tensão-deformação (σ-ε), forma normalizada da curva de força-deformação, para obtenção de parâmetro elástico puramente do material analisado.
Já o módulo de Young (E) fornece a resposta elástica do material analisado. É dado pelo coeficiente angular do gráfico normalizado da força aplicada pela deformação. Neste caso, a força aplicada (F) é normalizada pela área (A), ou tensão (σ); e a deformação (δ) é normalizada pelo comprimento original do sólido (L0), ou deformação (ε) [74].
Para o calcular o módulo de Young é necessário conhecer os parâmetros relacionados a área deformada e utilizar modelos teóricos para processar as curvas de força-deformação. Existem basicamente quatro modelos teóricos para este tipo de tratamento e cada um deles responde a algumas condições de contorno específicas relacionadas ao tipo de superfície (se é mais adesiva ou não) e a geometria da sonda utilizada (esférica, cônica, piramidal).
As leis de indentação e adesão são altamente não-lineares. Hertz foi o primeiro a formular as de interação de um corpo esférico com uma superfície plana (1881). Este modelo é bastante simplificado por não considerar a presença de forças adesivas ou quaisquer outras de longo alcance. As curvas de força-indentação são ajustadas pela seguinte equação [70]:
𝐹𝐿 =4 3𝐸
∗√𝑅∗𝑖3⁄2 (1)
FL é a força na curva de aproximação (load force), E* é o módulo de Young reduzido 𝐸∗ = 𝐸 (1−𝜗2) (𝜗 é a razão de Poisson), R * é o raio reduzido 1 𝑅∗ = 1 𝑅𝑡𝑖𝑝+ 1 𝑅𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓í𝑐𝑖𝑒, e i é a profundidade de indentação.
Já o modelo DMT (Dejargin-Muller-Toporov) é o mais próximo da teoria de Hertz, tendo como diferença o fato de considerar a adesão na junção [75]. Engloba um termo adicional na equação (1), que é a força adesiva de desprendimento da sonda da superfície Fpull-off.
𝐹𝐿 =4 3𝐸
∗√𝑅∗𝑖3⁄2 + 𝐹
𝑝𝑢𝑙𝑙−𝑜𝑓𝑓
(2)
Nos dois casos anteriores considerava-se o contato entre uma sonda esférica e a superfície. O modelo de JKR (Johnson-Kendall-Roberts) é utilizado para ajustar a mecânica de contato de sondas cônicas ou piramidais, em superfícies de alta adesividade. Nele são consideradas as forças de atração dentro da área de contato causadas pela energia de superfície [76]. Este modelo não possui solução explícita para FL. Para ajustar as curvas experimentais de força-indentação, é necessário utilizar as seguintes equações paramétricas:
𝑖(𝑎) = 𝑎 2 𝑅∗− √ 2𝜋𝑎𝑤𝑎𝑑ℎ 𝐸∗ (3) 𝐹𝐿(𝑎) =4𝐸 ∗𝑎3 𝑅∗ − 2√2𝜋𝐸∗𝑤𝑎𝑑ℎ𝑎3 (4)
a é o raio de contato entre a sonda e a superfície, wadh a energia de adesão (por unidade de área) de interação entre sonda e superfície. Esta energia pode ser calculada usando:
𝑤𝑎𝑑ℎ = − 2 3( 𝐹𝑝𝑢𝑙𝑙−𝑜𝑓𝑓 𝜋𝑅∗ ) (5)
O modelo Oliver-Pharr, assim como o de Hertz, ignora a presença de forças adesivas entre sonda e superfície [77]. É utilizado para sondas que possuem forma arbitrária. A descrição matemática deste modelo é bastante complexa se comparada às demais, possuindo dependência de muitas variáveis [70].
O ponto importante sobre os modelos teóricos apresentados é que à medida que inserimos variáveis para torná-los mais próximos do experimento (por exemplo, considerando forças adesivas), o grau de complexidade de suas equações cresce. Assim, muitas vezes apenas o stiffness é utilizado para descrever a rigidez de um material de forma comparativa, minimizando o problema de mecânica de contato. Nesta tese utilizamos o stiffness para caracterizar as propriedades elásticas do sistema formado por células e EPS.
2.7 Microfluídica
A microfluídica é caracterizada pelo estudo e manipulação de fluidos em escalas de comprimento submilimétricas [78]. Na microescala as leis da física permanecem as mesmas
que nos sistemas macroscópicos, mas o fator de escala pode dar predominância a forças diferentes. Por exemplo, no caso do escoamento de fluido, a redução do tamanho reduz a influência das forças de inércia em comparação com as forças de atrito, conduzindo à formação de fluxo laminar em canais microfluídicos. Além disso, a redução do tamanho tem uma influência direta sobre o tempo característico do sistema, como o tempo necessário para a difusão de uma molécula, que diminui como o quadrado do comprimento característico [79].
O uso da microfluídica tem ganhado bastante destaque em estudos biológicos e clínicos, pois permite o estudo de mecanismos de resposta como a quimiotaxia e a citotoxicidade [80,81], além de possibilitar o desenvolvimento de novas técnicas de isolamento e cultivo de células microbianas e animais [82]. Quando acoplada a técnicas de biofotônica, a microfluídica pode ser usada para avaliar a cinética de reações em tempo real, reduzindo o tempo de ensaios [83], e proporcionando grandes avanços nas áreas biológica e médica.
Nos anos 80 e 90, os dispositivos microfluídicos eram fabricados principalmente em substratos de silício. Essas tecnologias exigem instalações limpas e uma série de outros equipamentos caros. No final dos anos 90, a introdução de litografia macia utilizando moldagem de polímero permite a fabricação de dispositivos microfluídicos baratos que têm vantagens adicionais devido às características físicas desses polímeros. A tecnologia mais utilizada atualmente para a fabricação de dispositivos microfluídicos para aplicação biológica de células baseia-se na litografia suave de polidimetilsiloxano (PDMS). PDMS é um elastômero que através de procedimentos de moldagem simples serve de matéria prima para obtenção de dispositivos microfluídicos. Seu amplo uso neste tipo de aplicação é devido a algumas características deste material como as suas propriedades mecânicas, que facilitam a integração de válvulas fluídicas, elementos essenciais para o dispositivo microfluídico. Além disso, o PDMS é transparente, biocompatível e permeável ao gás, o que explica o grande interesse da comunidade científica em usar este material para fabricar dispositivos microfluídicos para estudos de biologia celular [79].
2.7.1 Regimes de fluxo
Os dispositivos microfluídicos possuem uma série de atrativos para aplicações de biologia celular. Estes dispositivos sempre possuem fluxo laminar [84](Figura 2.7a), em oposição ao
fluxo turbulento que é de natureza estocástica e marcado pela presença de "redemoinhos" que interrompem as linhas de corrente paralelas (Figura 2.7b).
Figura 2.7 - Regimes de fluxo. (a) Fluxo laminar e (b) Fluxo turbulento.
O número de Reynolds (Re) é um parâmetro adimensional usado para determinar a transição de regimes laminares para turbulentos. Este número é dado por:
𝑅𝑒 = 𝑢𝑑
𝜈
(6)
u é a velocidade do fluxo, ν é a viscosidade cinemática e d é o diâmetro do canal. O fluxo é considerado laminar em canais cilíndricos se Re < 2100 [84]. Em condições microfluídicas típicas, tomando canais pequenos (<100µm) e baixa velocidade do fluido (1 cm/s), o número de Reynolds é quase sempre baixo (Re < 1) [85,86]. Os fluxos laminares possuem uma grande limitação que é o fato de apenas produzirem uma mistura difusiva de forma relativamente lenta. Em aplicações que requerem uma rápida homogeneização do fluxo, esta limitação é corrigida utilizando diferentes tipos de misturadores integrados [87–89].
2.7.2 Dinâmica de fluidos e as forças exercidas sobre partículas aderidas na superfície do microcanal
Uma grande variedade de fenômenos físicos pode ser encontrada em dispositivos microfluídicos. Os modelos matemáticos utilizados para descrever o escoamento de fluidos nesses dispositivos seguem os mesmo princípios da macroescala. Desta forma, o escoamento de fluidos pode ser modelado utilizando as equações diferenciais de Navier-Stokes [90,91].
Existem várias abordagens para descrever a dinâmica de fluxos em tubos cilíndricos e retangulares. Nesta seção serão descritas de forma simplificada as equações utilizadas neste trabalho, para um microcanal de forma retangular. Estas equações de força são específicas para a condição de contorno, de células aderidas na parte inferior do microcanal, conforme ilustrado na Figura 2.8.
Figura 2.8 - Ilustração de microcanal retangular com partícula (célula) aderida na parte inferior. Figura adaptada [16].
Uma célula aderida na parte inferior do canal está sujeita a atuação de forças devido ao fluido circulando no canal, dentre elas a tensão de cisalhamento, definido como a componente da força exercida pelo fluido paralela à partícula.
De acordo com o modelo de fluxo de Poiseuille [90,91], que descreve o movimento do fluido como resultado do gradiente de pressão em um tubo, os valores de cisalhamento são determinados pela relação entre a taxa de fluxo volumétrica (Q), a viscosidade do fluido (µ) e a diferença de pressão ΔP entre a entrada e a saída do microcanal. Tomando a solução analítica de um perfil de fluxo em um canal quadrado, a equação que descreve o cisalhamento na parede inferior do canal é dada por [16]:
𝜏 =6𝜇𝑄
ℎ2𝑤
(7)
µ é a viscosidade do fluido circulando; h e w, são respectivamente, altura e largura do microcanal; Q é a taxa de fluxo volumétrica.
As equações de Stokes são uma linearização das equações de Navier-Stokes e podem ser generalizadas para descrever o movimento de esferas na presença de paredes, para objetos elipsoidais (bastões cilíndricos, caso limite) ou até para o caso mais simples, onde uma esfera
sólida é trocada por uma gota de outro fluido. Em nossos estudos utilizamos a aproximação de bastão cilíndrico para modelar a força atuando sobre a célula aderida à superfície do canal [92].
Nesta tese, desejamos calcular a força de arraste (FD), a qual uma partícula cilíndrica é submetida em condições de fluxo. A equação que descreve esta força possui um termo que depende da tensão de cisalhamento que o fluido exerce sobre a partícula, e outro relativo a diferença de pressão atuando sobre ela. A força de arraste é então dada por [92]:
𝐹𝐷 = 4𝜋𝜇𝐿𝑈
[𝑙𝑛(𝐿 𝑅⁄ ) − 0,5]
(8)
L e R são parâmetros da partícula, respectivamente, comprimento e raio. U é a velocidade do fluido ao longo da linha central da partícula (no nosso caso bactéria); que depende da taxa de fluxo volumétrica e da área da seção reta do canal (U=Q/A).
2.7.3 Dispositivos microfluídicos e ambiente da planta
Os dispositivos microfluídicos atuam como sistemas fechados com condições hidrodinâmicas (por exemplo, o cisalhamento devido ao fluxo) controladas, permitindo modelamento do problema utilizando as equações de dinâmica de fluidos [93]. Utilizando tais dispositivos foi possível obter uma aproximação mais real do ambiente da planta, onde células, agregados e biofilmes convivem em condições hidrodinâmicas.
Para modelar o estudo da dinâmica das células bacterianas em condições de fluxo é necessário conhecer os parâmetros relacionados a geometria dos vasos do xilema e a velocidade do fluido que circula por eles. No caso específico dos vasos do xilema de espécies citros, o diâmetro médio dos vasos do xilema é 15 µm, e a velocidade de fluido pode variar entre 3-300µL/h [55,56].
Os vasos do xilema são constituídos basicamente por celulose, hemicelulose, pectinas e proteínas [94]. Como uma adaptação do microambiente para torná-lo mais real do ponto de vista de composição química das paredes do microcanal, propusemos neste trabalho funcionalizações de superfície com uma celulose sintética e a adesina XadA1, presente em vários estágios do ciclo de vida bacteriano, particularmente nos iniciais [58] e em vesículas [95].
A bactéria Xylella fastidiosa usa um sistema de comunicação célula-célula consistindo de um fator de sinal difusivo (Diffusible Signal Factor - DSF). Na literatura são reportados alguns resultados da interação da DSF com cultivos de X.fastidiosa estirpe Temecula, que tratam de alterações nos mecanismos de adesão e mobilidade celular. Beaulieu et al. [17] observaram que a DSF suprime genes envolvidos na mobilidade e em enzimas relacionadas a hidrólise (enzimas hidrolíticas) que interrompem as pit membranes dos vasos do xilema, facilitando o movimento celular de um vaso para outro. Além disso, a DSF promove a expressão de genes envolvidos na agregação célula-célula e na adesão à superfície [17]. Caserta et al. [96] observaram que a DSF aumenta a produção de adesinas e suprime a expressão de enzimas extracelulares, fator que pode reduzir a virulência da X.fastidiosa porque essas células mais aderentes exibem menos movimento ao longo e entre vasos do xilema da videira [96]. Nenhum teste, porém, foi feito em ambientes microfluídicos. Em todos os casos reportados na literatura de nosso conhecimento, a DSF era introduzida em uma cultura em tubos falcon, e após o tempo de interação pré-determinado entre os cultivos e a DSF, os aspectos de interesse eram analisados [17,96,97]. Propusemos nesta etapa do trabalho utilizar a DSF da espécie citros para verificar sua influência sobre agregados e biofilmes, nos cultivos em condições similares ao ambiente da planta.
3. Materiais e Métodos
Neste capítulo será apresentada a metodologia detalhada dos experimentos realizados nesta tese. Serão descritos desde os tipos de substratos utilizados (substratos planos e dispositivos microfluídicos) aos processos de tratamento químico a que estes foram submetidos antes do cultivo bacteriano. Também discutiremos os procedimentos de cultivo, lavagem de marcação fluorescente de material orgânico, bem como as técnicas utilizadas para caracterização do objeto de estudo.
3.1 Substratos
Nesta seção serão descritos os diferentes tipos de substratos que foram utilizados ao longo deste trabalho para estudos de adesão, crescimento e mobilidade da Xylella fastidiosa. Cada um deles foi escolhido de acordo com a investigação que seria realizada. Nos experimentos que envolviam amostras secas, utilizamos substratos planos ou placas de Petri. Já nos experimentos que envolviam cultivos ex-vivo em meio líquido, foram utilizados dispositivos microfluídicos.
i. Placas de petri
Placas de petri (35mm) estéreis com lamínulas de vidro (10mm de diâmetro, espessura 0,13 – 0,16mm – Mattek Corporation Ashland, M.A, EUA) foram utilizadas para os experimentos relacionados ao estudo de propriedades mecânicas (microscopia de fluorescência amplo campo e confocal, microscopia de força atômica, espectroscopia Raman confocal).
ii. Vidro
Lamínulas de vidro quadradas (2,4cm x 2,4cm, espessura 0,13 – 0,16mm – Kasvi, USA) foram utilizadas como substrato para experimentos de testes de tratamento químico de superfície (medida de ângulo de contato, microscopia de fluorescência de amplo campo)
