Substratos

Nesta seção serão descritos os diferentes tipos de substratos que foram utilizados ao longo deste trabalho para estudos de adesão, crescimento e mobilidade da Xylella fastidiosa. Cada um deles foi escolhido de acordo com a investigação que seria realizada. Nos experimentos que envolviam amostras secas, utilizamos substratos planos ou placas de Petri. Já nos experimentos que envolviam cultivos ex-vivo em meio líquido, foram utilizados dispositivos microfluídicos.

i. Placas de petri

Placas de petri (35mm) estéreis com lamínulas de vidro (10mm de diâmetro, espessura 0,13 – 0,16mm – Mattek Corporation Ashland, M.A, EUA) foram utilizadas para os experimentos relacionados ao estudo de propriedades mecânicas (microscopia de fluorescência amplo campo e confocal, microscopia de força atômica, espectroscopia Raman confocal).

ii. Vidro

Lamínulas de vidro quadradas (2,4cm x 2,4cm, espessura 0,13 – 0,16mm – Kasvi, USA) foram utilizadas como substrato para experimentos de testes de tratamento químico de superfície (medida de ângulo de contato, microscopia de fluorescência de amplo campo)

Foram fabricados dispositivos de PDMS/vidro para estudos de adesão, crescimento e mobilidade da Xylella fastidiosa em condições de fluxo. Cada dispositivo possuía 10 canais, cada um deles com 20 µm de largura, 50 µm de altura e 1 mm de comprimento (Figura 3.1); os tubos de entrada (inlet) e saída (outlet) tem diâmetro interno 1mm. O processo de confecção do dispositivo de PDMS sobre vidro consiste de várias etapas; a maioria delas foi realizada no Laboratório de Microfabricação do LNNano. De forma simplificada temos os seguintes passos: a. O layout da máscara foi desenhado utilizando o software AUTOCAD 2007. A

gravação do molde foi feita utilizando o sistema de litografia a laser µPG 101, do LAMULT-IFGW.

b. Os moldes de replicação foram obtidos através da aplicação de uma camada espessa do fotoresiste SU-8 sobre lâminas quadradas de vidro.

c. Uma mistura de agente de cura e monômero (proporção mássica 1:10) do kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184 (Dow Corning, Midland, MI, USA) foi vertida sobre as máscaras de replicação e deixada em um dissecador por 40 minutos para remoção de bolhas de ar.

d. Em seguida, o processo de cura do polímero foi conduzido por uma hora em chapa aquecida a 100 °C.

e. Após a cura foram conectadas as mangueiras de entrada e saída do dispositivo microfluídico, através de perfurações na camada de PDMS. Agulhas de 0,7 mm de espessura foram utilizadas como conectores.

f. O último passo foi a selagem entre a lâmina de vidro e o PDMS com os canais microfluídicos, que é feita através da oxidação da superfície do PDMS e da limpeza das lâminas de vidro via oxidação por plasma de O2 (Barrel Asher

Plasma Technology SE80, potência ajustada em 100W, durante 30 segundos). Após o tratamento com plasma, a camada de PDMS e a lâmina de vidro foram manualmente alinhadas e pressionadas uma contra a outra. Com isso, obtivemos o dispositivo final.

Figura 3.1 - Design do dispositivo microfluídico de PDMS/vidro.

Cada dispositivo foi limpo com álcool 70% e água deionizada; em seguida foi seco com fluxo de nitrogênio e esterilizado com luz ultravioleta (UV) por 20 minutos (para garantir que a superfície do dispositivo esteja estéril).

iv. Microcanais de PLA (Poliácido Láctico)/vidro via impressão 3D

Esta etapa consistiu na fabricação de um dispositivo impresso, possuindo dois microcanais comunicantes por meio de uma membrana permeável, para estudar o efeito da inserção da molécula sinalizadora da bactéria sobre a formação de aglomerados e biofilmes em condições de fluxo. A membrana semipermeável utilizada foi de policarbonato, adquirida da Sigma Aldrich (diâmetro 19 mm e poro de 30 nm, Whatman Nuclepore WHA 8003007 – USA). Este tipo de membrana têm sido amplamente utilizada como parte de dispositivos microfluídicos de PDMS [98–100] para bioensaios.

Foram fabricados dispositivos impressos utilizando uma impressora 3D, construída pelo professor Varlei Rodrigues (IFGW-Unicamp) [101], baseada no projeto aberto RepRap de hardware. Em particular, utilizamos uma impressora do tipo Prusa Mendel, fused deposition modeling (FDM). O filamento utilizado na impressão foi de Poliácido Láctico (PLA), com diâmetro de 1,75 mm, de cor natural, adquirido da empresa 3DX filamentos. Este polímero é comumente utilizado como matéria prima para impressão de dispositivos microfluídicos devido à sua biocompatibilidade, baixo custo e semi-transparência

[102,103].O dispositivo fabricado possuía uma lamínula de vidro no fundo, adquirida da Knittel Glass (de dimensões 1,2 cm x 2,4 cm - Deckglässer Cover Slips), e acima desta ocorria a impressão em PLA. O processo de fabricação consistiu basicamente em duas etapas: tratamento químico da superfície do vidro e impressão.

No primeiro caso, o objetivo do tratamento químico no vidro que seria utilizado no fundo do dispositivo é aumentar a densidade de sítios ativos do grupo OH, tornando o vidro mais hidrofílico. Para isto utilizou-se o protocolo de oxidação com base piranha:

- Lamínulas previamente lavadas com acetona, isopropanol e água deionizadas, foram introduzidas numa solução de Hidróxido de amônio (NH4OH): água oxigenada (H2O2) : água DI (H2O) / (1:1:5) por 15 min à 85ºC (base piranha). Após este tempo as lamínulas foram lavadas com água deionizada e secas com fluxo de nitrogênio.

Com as lamínulas já tratadas, iniciava-se a impressão do microcanal inferior. Foi feito um contorno com PLA onde seria colocada a lamínula de vidro (Figura 3.2a). Na sequência o microcanal inferior era impresso sobre a lamínula (Figura 3.2b). Após esta etapa, uma pausa na impressão servia para a introdução da membrana semipermeável (Figura 3.2c). A impressão era então retomada para a finalização do dispositivo com o microcanal superior e tubos de entrada (Inlet 1 e Inlet 2) e saída (Outlet 1 e Outlet 2).

Quanto as dimensões dos microcanais, os dois canais possuíam as mesmas medidas de largura e altura, 200 µm e 600 µm, respectivamente; o comprimento do canal inferior era de 30,8 mm e o superior 15,8 mm.

O dispositivo final obtido, era montado acrescentando tubos de silicone que se encaixavam nos construídos em PLA, para que fosse possível conectar as mangueiras ao dispositivo final. A Figura 3.3 ilustra o dispositivo após a inserção dos tubos e mangueiras de silicone nas entradas e saídas. Os diâmetros internos dos tubos e mangueiras eram de 2,5mm e 1mm, e os externos 5 mm e 2 mm. Os tubos e mangueiras do dispositivo foram limpos com álcool 70% e água deionizada, em seguida foram secos com fluxo de nitrogênio. O dispositivo completamente montado foi esterilizado com luz ultravioleta (UV) por 40 minutos.

Figura 3.3 - Dispositivo microfluídico impresso em PLA.