Estudos preliminares da DSF (Diffusible Signaling Factor) sobre a forma dos agregados

Nesta parte do trabalho fizemos um estudo preliminar do efeito causado pela inserção da molécula sinalizadora da X.fastidiosa que ataca espécies citros (DSF-citros) sobre a forma de pequenos agregados em cultivos bacterianos com pouco tempo de crescimento.

Utilizamos os dispositivos microfluídicos impressos para o cultivo bacteriano. Estes nos possibilitaram modificar a geometria do dispositivo e introduzir a molécula sinalizadora em um canal diferente de onde circulavam as células e meio de cultura; uma membrana permeável permitiu a comunicação entre os dois canais. Desta forma, poderíamos ter o perfil difusivo associado à diluição da molécula no ambiente microfluídico, independente do fluxo do meio de cultura que mantinha as atividades celulares. Considerando o esquema do dispositivo ilustrado na Figura 4.24, a molécula sinalizadora foi introduzida no Inlet 2. Com isso, deveríamos ter um gradiente de concentração da molécula sinalizadora ao longo de todo microdispositivo [79,138]. Além disso, teríamos um transporte do tipo convectivo-difusivo [87], devido ao regime de fluxo laminar a que os fluidos estão submetidos [87,139].

Figura 4.24 - Ilustração do dispositivo microfluídico impresso, com indicações das regiões dos microcanais.

Fizemos dois experimentos, um controle onde não inserimos a DSF e outro onde após 6hs iniciais de cultivo introduzimos a DSF. Observamos que havia no dispositivo submetido a presença da DSF uma maior densidade de agregados, biofilmes e células únicas nas regiões do inlet2 e do meio se comparada as demais regiões do dispositivo. No microcanal controle, a densidade de células era praticamente uniforme ao longo de todo o dispositivo. Este pode ser um indicativo de que a distribuição de células ao longo do dispositivo era afetada pela presença da DSF.

Para tentar quantificar nossas observações, verificamos se havia variação na área coberta da superfície do microcanal por agregados, biofilmes e células únicas. Para isso, utilizamos a ferramenta de marcação de grãos do software ImageJ, delimitando as áreas de interesse de cada imagem e excluindo o background, para posteriormente calcular a área. Com os dados obtidos plotamos os gráficos para o caso controle e para a DSF, ilustrados na Figura 4.25.

Figura 4.25 - Gráficos box plot da porcentagem de área coberta de superfície do microcanal para diferentes tempos de crescimento bacteriano. Em (a) experimento controle, (b) cultivo com inserção da molécula sinalizadora.

Vimos que no caso do microcanal controle a porcentagem de área coberta não apresentava variações significativas com o tempo de cultivo, dado o relativamente curto tempo de observação para a Xylella fastidiosa. Já o microcanal com a DSF apresentou um aumento de área coberta para maiores tempos de crescimento (20 hs). Devido à complicações experimentais

que inviabilizavam experimentos com tempos longos de observação, não temos medidas em intervalos de tempo maiores que 20hs de crescimento bacteriano.

Observamos nas imagens de WFM que os agregados no microcanal do experimento com DSF apresentavam pequenas diferenças na distribuição espacial, como ilustrado na Figura 4.26.

Figura 4.26 - Imagem de WFM ilustrando agregados nos diferentes tempos de cultivo. De (a)-(c) agregados obtidos em imagens feitas no dispositivo controle, (d)-(e) agregados obtidos em imagens feitas no dispositivo com fluxo de DSF.

Como mencionado anteriormente, a concentração de células não responde ao perfil difusivo como esperávamos inicialmente. Apesar disso, tentamos quantificar a diferença na morfologia dos agregados através de sua dimensão fractal. Nesta análise consideramos somente os agregados que estavam na região central do dispositivo microfluídico. Obtivemos os valores na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2 – Valores de dimensão fractal de agregados nos microcanais controle e com DSF para diferentes tempos de crescimento bacterianos.

6hs 10hs 20hs Dimensão Fractal (controle) 1,61±0,07 1,48±0,03 1,54±0,05 Dimensão Fractal (DSF) 1,52±0,09 1,47±0,02 1,49±0,06

A dimensão fractal foi calculada para agregados em cada situação; desses valores, foi extraído o valor médio e calculado o desvio padrão. Analisando os valores obtidos, praticamente não há distinção entre eles quando considerada a incerteza. No entanto, Beaulieu et al. [17] reportam que a introdução de DSF em culturas de X.fastidiosa, estirpe Temecula, pode promover a expressão de genes envolvidos na agregação célula-célula. Este fato poderia explicar a modificação de forma dos agregados vista nas nossas imagens, que a dimensão fractal não consegue captar em termos quantitativos.

É importante notar que o perfil difusivo poderia ser obtido apenas pela justaposição dos dois canais em fluxo laminar, porém a presença da bactéria planctônica poderia perturbar o perfil de composição. A membrana escolhida, com poros de ~30 nm, impediria a passagem de células, porém não a de moléculas DSF. O perfil do canal foi realizado com base na experiência anterior do grupo do Prof. Varlei Rodrigues, porém simulações da mistura de soluções não chegaram a ser realizadas. Por outro lado, a membrana utilizada era razoavelmente inomogênea, como pode ser visto na imagem de microscopia eletrônica (Scanning Electron Microscopy – SEM, neste caso utiliza-se um feixe de elétrons para varrer a superfície e obter imagens) na Figura 4.27, obtida por Mariana Zavarize. Estes fatos podem ter contribuído para que o experimento não tenha sido conclusivo. De fato, para um estudo mais detalhado da influência da DSF seriam necessários mais experimentos, também para caracterização do perfil difusivo na estrutura de microcanais, além de uma análise estatística mais detalhada da forma e distribuição dos agregados nos cultivos. Contudo podemos inferir que a DSF afeta a distribuição espacial de agregados, bem como sua forma.

Figura 4.27 - Imagens SEM da membrana de policarbonato utilizada como via de comunicação entre os canais no dispositivo impresso em PLA, obtidas por Mariana Zavarize. Em (a) imagem de menor magnificação, ilustrando distribuição não uniforme dos poros, (b) imagem de maior magnificação.

Como encontramos vários problemas para a obtenção de dispositivos viáveis para o experimento, não foram feitos muitos testes prévios para otimização dos parâmetros de fluxo. Em outras condições, poderíamos ter feitos experimentos testes com fluoróforos ao invés da DSF para observarmos a difusão das moléculas, e para encontrar parâmetros para o fluxo que criassem o perfil difusivo necessário, utilizando a mesma membrana.