R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 6 ( 4 ) : 2 2 5 - 2 3 0 , o u t - d e z , 1 9 9 3
G R O W T H A N D D I F F E R E N T I A T I O N O N A T R Y P A N O S O M E
O F T H E S U B G E N U S
S C H I Z O T R Y P A N U M
F R O M T H E B A T
P H Y L L O S T O M U S H A S T A T U S
S ô n i a I . H a m a n a k a a n d A r t u r d a S . P i n t o
T h e e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e , p H , o s m o l a r i t y a n d a e r a t i o n o n l h e g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f a t r y p a n o s o m e o f t h e s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m i s o l a t e d f r o m t h e b a t P h y l l o s t o m u s h a s t a t u s
w e r e s t u d i e d . I n g e n e r a l , t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f l a g e l l a t e w e r e s i m i l a r t o t h o s e o f
T r y p a n o s o m a ( S c h i z o t r y p a n u m ) c r u z i . H o w e v e r , t h e p a r a s i t e d i d n o t g r o w t h a t 3 3 o r 3 7 C . I n c r e a s e in t h e o s m o l a r i t y a n d a e r a t i o n p r o m o t e d g r o w t h a t 3 3 C . S i g n i f i c a n t m e t a c y c l o g e n e s i s w a s d e t e c t e d o n l y in t h e g r o w t h c o n d i t i o n w h e r e m a x i m a l g r o w t h o c c u r e d ( 2 8 C , p H 7 . 3 , 3 8 0 m 0 s / k g , in t i s s u e c u l l u r e f l a s k s ) , a t th e e n d o f t h e e x p o n e n t i a l g r o w t h p h a s e . T h e b e g i n i n g o f t h e m e t a c y c l o g e n e s i s p r o c e s s w a s c o i n c i d e n t w i t h m o s t g l u c o s e u t i l i z a t i o n a n d l o w e s t p H . D u r i n g m e t a c y c l o g e n e s i s b o t h c u l t u r e m e d i u m p H a n d o s m o l a r i t y i n c r e a s e d s t e a d l y .
K e y - w o r d s : S c h i z o t r y p a n u m f r o m P h y l l o s t o m u s h a s t a t u s . G r o w t h . D i f f e r e n t i a t i o n .
T r y p a n o s o m a ( S c h i z o t r y p a n u m ) c r u z i t h e c a u s a t i v e a g e n t o f C h a g a s ’ d i s e a s e i n L a t i n A m e r i c a
c a n b e f o u n d i n s e v e r a l m a m m a l i a n o r d e r s i n c l u d i n g b a t s . T h e l a t t e r a r e a l s o h o s t s o f c o s m o p o l i t a n
t r y p a n o s o m e s o f t h e s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m
w h i c h a r e a l m o s t i n d i s t i n g u i s h a b l e m o r p h o l o g i c a l y
f r o m e a c h o t h e r 12. T h u s , i n r e g i o n s w h e r e t h e y c o e x i s t , k n o w l e d g e w h e t h e r i s o l a t e s a r e T . ( S . )
c r u z i o r n o t , i s o f p u b l i c h e a l t h i n t e r t e s t . S e v e r a l r e p o r t s h a v e b e e n d e s c r i b e d t h e
i n f l u e n c e o f t h e p h y s i c h o c h e m i c a l c o n d i t i o n s , s u c h
a s t e m p e r a t u r e , p H , o s m o l a r i t y a n d a e r a t i o n s u r f a c e o n t h e g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( m e t a c y c l o g e n e s i s ) o f t r y p a n o s o m e s 2 4 7 11 13 17
A l t h o u g h t n o n - i n f e c t i v e s t o c k s o f t r y p a n o s o m e s
o f t h e s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m i s o l a t e d f r o m
b r a z i l i a n b a t s h a v e b e e n c u l t i v a t e d i n a x e n i c
c u l t u r e s 1 8
914,
f e w i n f o r m a t i o n s i s a v a i l a b l e a b o u t t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s a n d m e t a c y c l o g e n e s i sa m o n g t h e s e f l a g e l l a t e s .
I n t h e p r e s e n t s t u d y w e i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s
o f t e m p e r a t u r e , p H , o s m o l a r i t y a n d a e r a t i o n s u r f a c e o n g r o w t h a n d m e t a c y c l o g e n e s i s o f a t r y p a n o s o m e
o f t h e s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m i s o l a t e d f r o m t h e
b a t P . h a s t a t u s .T h i s i s o l a t e w a s p r e v i o u s l y u n a b l e i n p r o d u c e d e t e c t a b l e p a r a s i t e m i a i n m i c e 15.
D ep artam en to de M ic ro b io lo g ia , U niversid ade Federal de M inas G erais, Belo H o rizon te, M G , Brasil.
F inan cial su p p o rt o f C N P q , F IN E P , F A PE M IG and P R Pq/ U F M G .
Addressto:
D r. A rtur da Silveira Pinto. D epto. de M icrobiologia/ IC B /U F M G . C aixa P ostal 2 48 6, 3 016 1 -9 7 0, Belo H orizonte, M G , B rasil.R eceb id o p ara p u b licação em 3 0 /0 6 /9 3 .
M A T E R I A L A N D M E T H O D S
P a r a s i t e . T h e t r y p a n o s o m e s t u d i e d w a s i s o l a t e d f r o m a P h y l l o s t o m u s h a s t a t u s b a t c o l l e c t e d i n
S e r r a n i a , M i n a s G e r a i s , B r a z i l . i s o l a t i o n w a s
p e r f o r m e d b y h e m o c u l t u r e i n B r a i n - H e a r t - I n f u s i o n ( B H I ) m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % ( v / v ) h e a t
i n a c t i v a t e d f e t a l c a l f s e r u m ( F C S ) a n d 2 % o f a 1 0 %
r a b b i t h e m o g l o b i n s o l u t i o n . A f t e r i s o l a t i o n t h e
f l a g e l l a t e w a s p l a t i n g i n t h e s a m e m e d i u m
s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % r a b b i t b l o o d ( v / v ) a n d
0 . 7 5 % a g a r . T h e f l a g e l l a t e w a e m a i n t a i n e d b y s e r i a l p a s s a g e s e v e r y 1 0 d a y s . I t w a s a l s o c r y o p r e s e r v a t e d
i n l i q u i d N i t r o g e n a f t e r a d d i n g 1 0 % g l y c e r o l t o t h e c u l t u r e .
C e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . E x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e a b o v e r e f e r r e d c u l t u r e m e d i u m
a n d t h e f o l l o w i n g g r o w t h c o n d i t i o n s w e r e a s s a y e d :
t e m p e r a t u r e ( 2 5 , 2 8 , 3 3 , 3 7 ° C ) p H ( 6 . 5 , 6 . 3 , 7 . 3 ,
a d j u s t e d w i t h I N H C 1 o r K O H ) , o s m o l a r i t y ( 3 8 0 ,
5 2 0 , 6 2 0 m 0 m / k g H 2 0 , n o a d d i n g o r b y a d d i n g 2 o r
4 % s o r b i t o l ) a n d a e r a t i o n s u r f a c e ( c u l t u r i n g i n
1 8 x 1 8 0 m m ) s c r e w - c a p p e d t u b e s o r i n 2 4 c m 2 s u r f a c e a r e a t i s s u e c u l t u r e f l a s k s ) . C u l t u r e m e d i u m f i n a l
v o l u m e w a s a l w a y s 5 . O m l. I n o c u l a t i o n w a s p e r f o r m e d
w i t h m i d - l o g p h a s e c e l l s k e p t a t 2 8 ° C t o g i v e t h e s t a r t n u m b e r o f 2 . 0 x l 0 5c e l l s / m l . G r o w t h w a s e s t i m a t e d b y c o u n t i n g c e l l s i n a h e m o c y t o m e t e r a f t e r d i f f e r e n t
p e r i o d s o f i n c u b a t i o n ( 4 , 8 , 1 2 , l ó d a y s ) . T o d e t e r m i n e
p e r c e n t a g e s o f e v o l u t i v e s t a g e s o f t h e p a r a s i t e i n
c u l t u r e s , G i e m s a - s t a i n e d w e r e p r e p a r e d . A t l e a s t
2 0 0 o r g a n i s m s w e r e e x a m i n e d o n e a c h p r e p a r a t i o n .
A n a l y t i c a l d e t e r m i n a t i o n s . G l u c o s e , p H , a n d o s m o l a r i t y w e r e m o n i t o t r e d i n t h e c u l t u r e m e d i u m
w h e r e b o t h m a x i m a l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n
o c c u r e d . A f t e r d i f f e r e n t p e r i o d s o f i n c u b a t i o n ( 4 , 8 ,
1 2 , 1 6 d a y s ) , c e l l s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f i i g a t i o n
( 2 . 5 0 0 r . p . m / m i n ) a n d t h e s u p p e m a t a n t s t o r e a t
’2 0 ° C u n t i l u s e d . G l u c o s e c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d
b y t h e g l u c o s e o x i d a s e m e t h o d u s i n g a B e c k m a n
D B - G t S p e c t r o p h o t o m e t e r . p H a n d o s m o l a r i t y w e r e m o n i t o r e d w i t h a d i g i t a l p H m e t e r ( M i c r o n a l B 3 8 4 )
a n d a o s m o m e t e r ( A d v a n c e d W i d e - R i n g
O s m o m e t e r ) , r e s p e c t i v e l y .
R E S U L T S
C e l l g r o w t h . F i g u r e 1 r e p r e s e n t s g r o w t h c u r v e s
o f t h e p a r a s i t e w h e n c u l t i v a t e d u n d e r d i f f e r e n t
p h y s i c o c h e m i c a l c o n d i t i o n s . M a x i m a l g r o w t h w a s
d e t e c t e d a f t e r 1 6 d a y s w i t h c e l l s i n c u b a t e d a t 2 8 ° C , p H 7 . 3 , 3 8 0 m 0 s m / k g H 2 0 i n 2 5 c m 2 t i s s u e c u l t u r e
f l a s k s . L o w e r a e r a t i o n s u r f a c e d e c r e a s e d t h e f i n a l
T i m e ( d a y s)
F ig ura 1 - G row th o f a tryp an o so m e o f the subgenus
Schizotrypanum
isolated from the b atP. hastatus
w hen incubed u n d e r different p hysicochem ical conditions. T he parasite w as cultivated in B H I m ed iu m sup plem ented w ith 10% (v/v) fetal c a lf seru m (FC S) and 2% o f a 10% ra b b it h em o g lo b in solu tion . T h e p hy sicochem ical co nditions w ere as follow : ( O ) -2 8 °C ; pH 7 .3 ; 3 8 0 m 0 s m /k g H 20 in 2 5 c m 2tissue cultu re flasks; ( • ) -2 8 °C , p H 6 .3 , 3 8 0 m 0 s m /k g H 20 in 2 5 c m 2 tissu e cu lture flasks;
H a m a n a k a S I , P i n t o A S . G r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o n a t r y p a n o s o m e o f t h e s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m f r o m t h e b a t P h y l l o s t o m u s h a s t a t u s . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 6 : 2 2 5 - 2 3 0 , o u t - d e z , 1 9 9 3 .
n u m b e r o f c e l l s . I n i t i a l p H 6 . 3 r e a d l y a c e l e r a t e d
g r o w t h w h e r e s h a r p s t a t i o n a r y g r o w t h p h a s e s a r o s e
i n t h e 8 * d a y o f i n c u b a t i o n . A l s o h e r e , h i g h e r
a e r a t i o n s u r f a c e p r o m o t e d b e t t e r g r o w t h . L o w e r p H
( 5 . 3 ) r e d u c e d d r a s t i c a l l y t h e f i n a l n u m b e r o f c e l l s ,
i n w h i c h t h e s t a t i o n a r y g r o w t h p h a s e a r o s e e a r l y o n
t h e d a y f o u r o f i n c u b a t i o n . I n c r e a s e s i n t h e
o s m o l a r i t y b y a d d i n g s o r b i t o l , c a u s e d a s l i g h
i n h i b i t i o n o f g r o w t h . I n c u b a t i o n a t 2 5 ° C r e d u c e d
m a r k e d l y t h e g r o w t h r a t e . T h e p a r a s i t e d i d n o t
g r o w t h a t 3 3 o r 3 7 ° C , h o w e v e r , i n c r e a s e i n t h e
o s m o l a r i t y a n d a e r a t i o n p r o m o t e d g r o w t h a t 3 3 ° C .
C e l l d i f f e r e n t i a t i o n . F i g u r e 2 s u m m a r i z e s
o b s e r v a t i o n s o n t h e p e r c e n t a g e s o f t h e p a r a s i t e
s t a g e s i n c u l t u r e s a f t e r 1 6 d a y s o f i n c u b a t i o n .
I n c r e a s e i n t h e p e r c e n t a g e o f t r y p o m a s t i g o t e f o r m s
w a s o n l y d e t e c t e d w i t h c e l l s c u l t i v a t e d a t 2 8 ° C , p H
7 . 3 , 3 8 0 m 0 s m / k g H 2 0 i n t i s s u e c u l t u r e f l a s k s . I n
t h i s c o n d i t i o n , t h e p e r c e n t a g e o f t r y p o m a s t i g o t e s
i n c r e a s e d s t e a d l y a f t e r 1 2 d a y s o f i n c u b a t i o n ,
r e a c h i n g a b o u t 5 1 % a t t h e e n d o f t h e o b s e r v a t i o n
t i m e ( F i g u r e 3 )
C h a n g e s i n t h e c u l t u r e m é d i u m d u r i n g
g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . D u r i n g t h e e x p o n e n t i a l
g r o w t h p h a s e , g l u c o s e u t i l i z a t i o n w a s p a r a l l e l t o
i n c r e a s e s i n t h e e p i m a s t i g o t e n u m b e r a n d d e c r e a s e
in p H . I n t h i s g r o w t h p h a s e t h e p e r c e n t a g e o f t h i s
p r o l i f e r a t i v e s t a g e s r e m a i n e d p r a c t i c a l y u n a l t e r a t e d .
T h e s t a r t o f t h e m e t a c y c l o g e n e s i s p r o c e s s w a s
c o n c o m i t a n t w i t h m o s t g l u c o s e u t i l i z a t i o n , l o w e s t
p H , a n d t h e e n d o f t h e e x p o n e n t i a l g r o w t h p h a s e .
D u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n , t h e c u l t u r e m e d i u t n p H
i n c r e a s e d fir o m 6 . 7 t o 7 . 4 a n d t h e o s m o l a r i t y c h a n g e d
f r o m 3 8 0 t o 4 2 2 m O s m / k g H 2 0 . T h e s e r e s u l t s a r e
s h o w n ij i F i g u r e 3 .
Temperot ure ( °C)
pH
Osm o |o r it y(m Osm /Kg H 2O)
A er at io n su r f ace
7,3 7,3 6,3 5,3 7,3 7,3 7,3 6,3 7,3
3 8 0 3 8 0 3 8 0 3 8 0 5 2 0 6 2 0 3 8 0 3 8 0 6 2 0
SCT SCT SCT SCT SCT SCT TCF TCF TCF
F ig u re 2 - P ercentag e o f ( O ) ep im astig ote, ( • ) transitional epim astigote, (□ ) tryp om astigote an d ( ■ ) spherom astigote fo rm s in th e cu lture o f a tryp an o so m e o f the subgenus
Schizotrypanum
isolated fro m the b atP. hastatus,
afte r 16 d ays o f incu b ation u n d e r d ifferent phy sicochem ical conditio ns. T h e parasite w as cultiv ated in th e B H I m edium supplem ented w ith 10% (v/v) fetal bov in e seru m (F C S ) and 2% o f a 10% rabb it h em o glob in solution. V aiues are m eans o f th ree replicates.* S crew -cap ped tu bes; ** T issu e cu lture flasks.
T
im
e
(
d
a
y
s
)
Co! I r, [ % , e p i m a s t i g o t e s ( © ) ,
t r ypomast i got es ( G) J
T o TE [TH
ITõ-o
o
o
o
ü i cn ~si
jçi_____________\ 0_____________lÇJi_____________ j O ________
pl-l ( A )
H a m a n a k a S I , P i n t o A S . G r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o n a t r y p a n o s o m e o f t h e s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m f r o m t h e b a t P h y l l o s t o m u s h a s t a t u s . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 6 : 2 2 5 - 2 3 0 , o u t - d e z , 1 9 9 3 .
D I S C U S S I O N
I n g e n e r a l , t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s p r e s e n t e d
b y t h e p a r a s i t e s t u d i e d w h e n c u l t i v a t e d u n d e r
d i f f e r e n t p h y s i c o c h e m i c a l c o n d i t i o n s w e r e s i m i l a r
t o t h o s e o f T . ( S . ) c r u z i2 1 0 1 3 1 7. H o w e v e r , i n o u r
s t u d y t h e f l a g e l l a t e d i d n o t g r o w t h a t 3 3 o r 3 7 ° C .
I n p r e v i o u s r e p o r t t h e p a r a s i t e s t u d i e d w a s u n a b l e t o
i n f e c t n o r m a l o r i r r a d i a t e d C 3 H m i c e 15. T h e
s e n s i b i l i t y t o h i g h e r t e m p e r a t u r e s m a y b e a
c h a r a c t e r i s t i c w i d e l y d i s t r i b u t e d a m o n g
t r y p a n o s o m e s o f t h e s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m f r o m
b a t s a n d m i g t h b e u s e f u l t o d i s c r i m i n a t e w h e t e r
i s o l a t e s f r o m b a t s a r e T . ( S . ) c r u z i , o r n o t .
M e t a c y c l o g e n e s i s i s b e l i e v e d t o b e a p r o c e s s
t h a t p r e a d a p t h e t r y p a n o s o m e s t o t h e v e r t e b r a t e
h o s t . I n o u r s t u d y , t h i s m o r p h o g e n e t i c p r o c e s s o n l y
o c c u r e d i n t h e g r o w t h c o n d i t i o n w h e r e m a x i m a l
g r o w t h o c c u r e d . O u r r e s u l t s a r e i n a g r e e m e n t w i t h
t h e S t e i n e r t s t a t e m e n t t h a t a p r e c i s e p e r i o d o f
g r o w t h i s c r i t i c a i b e f o r e m e t a c y c l o g e n e s i s p r o c e s s
s t a r t 16. I n a d d i t i o n , t h e p h y s i o l o g i c a l e v e n t s d e t e c t e d
d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n w e r e v e r y s i m i l a r t o t h o s e
f o u n d f o r T . ( S . ) c r u z i 1 1 . A t t h e p r e s e n t t i m e , i t i s
w e l l k n o w n t h a t e p i m a s t i g o t e s o f T . ( S . ) c r u z i
d u r i n g t h e e x p o n e n t i a l g r o w t h p h a s e , u t i l i z e g l u c o s e
v i a g l u c o l i s i s , a n d s u c c i n a t e , a c e t a t e a n d C 0 2 , a r e
t h e m a i n e n d p r o d u c t s e x c r e t e d 5 . A f t e r m o s t o f
g l u c o s e i s c o n s u m e d a s h i f t t o a m i n o a c i d c a t a b o l i s m
w i t h C 0 2 a n d a m o n i a p r o d u c t i o n , o c c u r s 3 .
A d i t i o n a l l y , s o m e o f t h e s e c o m p o u n d s o r o t h e r
e x c r e t i o n p r o d u c t s m a y a c t s a s o s m o a c t i v e
s u b s t a n c e s . I t w a s f o u n d t h a t L e i s h m a n i a m a j o r
p r o m a s t i g o t e s e x c r e t s t h i s k i n d o f s u b s t a n c e s i n t h e
c u l t u r e m e d i u m , m a i n l y a l a n i n e 6 .
M o r e s t u d i e s a b o u t o n t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s
a n d m e t a c y c l o g e n i s i s o f t r y p a n o s o m e s o f t h e
s u b g e n u s S c h i z o t r y p a n u m i s o l a t e d f r o m b a t s
c o l l e c t e d o v e r a l a r g e g e o g r a p h i c a r e a , a r e n e e d e d .
F i n a l l y , t h e e n i g m a w h y t r y p a n o s o m e s o f t h i s
s u b g e n u s f r o m b a t s , o t h e r t h a n T . ( S . ) c r u z i , a r e
h o s t r e s t r i c t e d t o b a t s o n l y , r e m a i n s t o b e a n s w e r e d .
R E S U M O
F o r a m e s t u d a d o s o s e f e i t o s d a t e m p e r a t u r a , d o p H , d a o s m o l a r i d a d e e d a a r e a ç â o s o b r e o c r e s c i m e n t o e a d i f e r e n c i a ç ã o d e u m t r i p a n o s o m a d o s u b g e n ê r o
S c h i z o t r y p a n u m , i s o l a d o d o m o r c e g o P h y l l o s t o m u s h a s t a t u s . E m g e r a l , a s c a r a c t e r í s t i c a s d o c r e s c i m e n t o d o
f l a g e l a d o f o r a m s e m e l h a n t e s à q u e l a s d o T r y p a n o s o m a ( S c h i z o t r y p a n u m ) c r u z i . E n t r e t a n t o , o p a r a s i t a n ã o d e d e s e n v o l v e u a 3 3 o u 3 7 ° C . O a u m e n t o n a o s m o l a r i d a d e e a r e a ç â o e s t i m u l o u o c r e s c i m e n t o a 3 3 ° C . M e t a c i c l o g ê n e s e s i f h i f i c a t i v a f o i d e t e c t a d a s o m e n t e n a c o n d i ç ã o d e c r e s c i m e n t o , o n d e o c o r r e u d e s e n v o l v i m e n t o m á x i m o ( 2 8 ° C , p H 7 . 3 , 3 2 0 m 0 / k g H 2 0 , e m f r a s c o s d e c u l t u r a d e t e c i d o ) , n o f i n a l d a f a s e d o c r e s c i m e n t o e x p o n e n c i a l . O i n í c i o d o p r o c e s s o d e m e t a c i c l o g ê n e s e c o i n c i d i u c o m m a i o r u t i l i z a ç ã o d e g l u c o s e e m e n o r p H . D u r a n t e a m e t a c i c l o g ê n e s e , o p H d o m e i o d e c u l t u r a e a o s m o l a r i d a d e a u m e n t a r a m c o n s t a n t e m e n t e .
P a l a v r a s - c h a v e s : S c h i z o t r y p a n u m d o m o r c e g o
P h i l l o s t o m u s h a s t a t u s . D e s e n v o l v i m e n t o . D i f e r e n c i a ç ã o .
R E F E R E N C E S
1 . B a k e r J R , M i l e s M A , G o d f r e y D G , B a r r e t T V .
B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n f o s o m e s p e c i e s o f
T r y p a n o s o m a ( S c h i z o t r y p a n u m ) f r o m b a t s ( M i c r o c h i r o p t e r a ) T h e A m e r i c a m J o u r n a l o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 2 7 : 4 8 3 - 4 9 1 , 1 9 7 8 . 2 . C a m a r g o E P . G r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n i n
T r y p a n o s o m a c r u z i . O r i g i n o f m e t a c y c l i c t r y p a n o s o m e s i n l i q u i d m e d i a . R e v i s t a d o I n s t i t u t o d e M e d i c i n a T r o p i c a l d e S ã o P a u l o 6 : 9 3 - 1 0 0 , 1 9 6 4 .
3 . C a n n a t a J J B , C a z z u l o J J . T h e a e r o b i c f e r m e n t a t i o n o f g l u c o s e b y T r y p a n o s o m a c r u z i . C o m p a r a t i v e B i o c h e m s t r y a n d P h y s i o l o g y 7 9 B . 2 9 7 - 3 0 9 , 1 9 8 4 . 4 . C a s t e l l a n i O , R i b e i r o L V , F e r n a n d e s J F .
D i f f e r e n t i a t i o n o f T r y p a n o s o m a c r u z i i n c u l t u r e . J o u r n a l o f P r o t o z o o l o g y 1 4 : 4 4 7 - 4 5 1 , 1 9 6 7 . 5 . C a z z u l o J J , C a z z u l o B M F , E n g e l J C , C a n n a t a n J J B .
E n d p r o d u c t s a n d e n z y m e l e v e i s o f a e r o b i c g l u c o s e f e r m e n t a t i o n i n t r y p a n o s o m a t i d s . M o l e c u l a r
B i o c h e m i c a l P a r a s i t o l o g y 1 6 : 3 2 9 - 3 4 3 , 1 9 8 5 . 6 . D a r l i n g T V , B u r r o w s C M , B l u m J J . R a p i d s h a p e
c h a n g e a n d r e l e a s e o f n i n h y d r i n - p o s i t i v e s u b s t a n c e s
b y L e i s h m a n i a m a j o r p r o m a s t i g o t e s i n r e s p o n s e t o h y p o o s m o t i c s t r e s s J o u r n a l o f P r o t o z o o l o g y 3 7 : 4 9 3 -4 9 9 , 1 9 9 0 .
7 . D e a n e M P , K i r c h n e r E . L i f e - c y c l e o f T r y p a n o s o m a c o n o r h i n i . I n f l u e n c e o f t e m p e r a t u r e a n d o t h e r f e c t o r s o n g r o w t a n d m o r p h o g e n e s i s . J o u r n a l o f
P r o t o z o o l o g y 1 0 : 3 9 1 - 3 9 9 , 1 9 6 3 .
8 . D i a s E . S o b r e u m S c h i z o t r y p a n u m d e m o r c e g o d o B r a s i l . M e m ó r i a s d o I n s t i t u t o O s w a l d o C r u z 2 7 : 1 3 9
-1 5 5 , -1 9 3 3 .
9 . D i a s E . R e v i s ã o g e r a l d o s h e m o f l a g e l a d o s d e c h i r ó p t e r o s . E s t ú d i o e x p e r i m e n t a l d o S c h i z o t r y p a n u m
d e P h y l l o s t o m u s h a s t a t u s : i d e n t i d a d e c o m
S c h i z o t r y p a n u m c r u z i . O g r u p o v e s p e r t i l l o n i s . 9 a R e u n i ã o d e l a S o c i e d a d A r g e n t i n a d e P a t o l o g i a
R e g i o n a l ( M e n d o n ç a a n t . 1 9 3 5 ) . M e m ó r i a s d o I n s t i t u t o O s w a l d o C r u z 1 : 1 0 - 8 8 , 1 9 3 6 .
1 0 . F e r n a n d e s J F , C a s t e l l a n i O . G r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f T r y p a n o s o m a c r u z i .
E x p e r i m e n t a l P a r a s i t o l o g y 1 8 : 1 9 5 - 2 0 2 , 1 9 6 6 .
1 1 . F e r n a n d e s J F , C a s t e l l a n i O , K i m u r a E . P h y s i o l o g i c a l e v e n t s i n t h e c o u r s e o f g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f
T r y p a n o s o m a c r u z i . G e n e t i c s 6 1 ( S u p p l ) : 2 1 3 - 2 2 6 , 1 9 6 9 .
1 2 . H o a r e C A . T h e t r y p a n o s o m e s o f m a m m a l s . A z o o l o g i c a l m o n o g r a p h . B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s , O x f o r d a n d E d i n b u r g , 1 9 7 2 . 1 3 . O s u n a A , A d r o h e r F J , L u p i a n e z J A . I n f l u e n c e o f
e l e c t r o l y t e s a n d n o n - e l e c t r o l y t e s o n g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f T r y p a n o s o m a c r u z i• C e l l
d i f f e r e n t i a t i o n a n d D e v e l o p m e n t 3 0 : 8 9 - 9 5 , 1 9 9 0 . 1 4 . P i n t o A S , B e n t o D N C . T r y p a n o s o m a c r u z i - l i k e
b l o o d s t r e a m t r y p o m a s t i g o t e s i n b a t s f r o m t h e S t a t e o f P i a u í , N o r t e a s t e r n B r a z i l . R e v i s t a d a S o c i e d a d e
B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 1 9 : 3 1 - 3 4 , 1 9 8 6 . 1 5 . P i n t o A S , R e n a u l t C P , T a f u r i W L , C h i a r i E .
T r y p a n o s o m a c r u z i - l i k e t r y p a n o s o m e s i s o l a t e d f r o m t h e b a t P h y l o s t o m u s h a s t a t u s . M e m ó r i a d o I n s t i t u t o O s w a l d o C r u z 8 2 ( S u p l ) : B I - 1 0 , 1 9 8 6 .
1 6 . S t e i n e r t M . É t u d e s s u r l e ’ d é t e r m i n i s m e d e l a m o r p h o g é n e s e d ú n t r y p a n o s o m e . E x p e r i m e n t a l C e l l R e s e a r c h 1 5 : 5 6 0 - 5 6 9 , 1 9 5 8 .
1 7 . U c r o s H , G r a n g e r B , K r a s s n e r S M . T r y p a n o s o m a c r u z i: e f f e c t o f p H o n in v i t r o f o r m a t i o n o f m e t a c y c l i c t r y p o m a s t i g o t e s . A c t a T r o p i c a 4 0 : 1 0 5 - 1 1 2 , 1 9 8 3 .
