Chapitre III Dépôt d’ADN
III. Dépôt d’ADN
III.2. Méthode de la goutte
III.2.2. Caractérisation de l’ADN déposé
III.2.2.3. Densité en fonction du pH
accumulation de l’ADN sur le bord de la goutte. Dans le cas des surfaces fonctionnalisées avec le silane amine, l’ADN se met en boule et s’accumule ainsi au niveau du ménisque. Dans le cas de la surface SiO2 l’ADN semble s’accrocher à l’endroit du ménisque. Lorsqu’on retire la solution, tous ces brins sont étirés, se rejoignent, et forment des cordes. La figure III.14 illustre le phénomène.
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
24 OTS
EDI EDI/MgCl2
106 Densité en cm-2
pH
Tris MES/MgCl2 Tris/MgCl2 MES/EDTA Tris/EDTA
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
0 5 10 15
20 Vitesse de la goutte Rapide Lente
OTS
N
Longueur en µm
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
0 5 10 15 20 25 30
Polystyrène
N
Longueur en µm
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
26 Polystyrène
EDI EDI/MgCl2
106 Densité en cm-2
pH
MES Tris MES/MgCl2 Tris/MgCl2 MES/EDTA Tris/EDTA
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 0
2 4 6 8 10 12 14
16 Fluor
EDI
EDI/MgCl2
106 Densité en cm-2
pH
MES Tris MES/MgCl2 Tris/MgCl2 MES/EDTA Tris/EDTA
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
0 10 20 30 40 50
Fluor
N
Longueur en µm
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 0
5 10 15 20 25 30
35 Vinyle
EDI EDI/MgCl2
106 Densité en cm-2
pH
MES Tris Tris/MgCl2 MES/EDTA Tris/EDTA
10 15 20 25 30 35
0 10 20 30
40 Vinyle
N
Longueur en µm
Figure III.15 : Densité surfacique d’ADN en fonction du pH pour différentes surfaces hydrophobes : Méthyle (silane OTS), Fluor, vinyle, Polystyrène (PS). On représente également l’histogramme des
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 0
10 20 30 40 50
NH2
EDI EDI/MgCl2
106 Densité en cm-2
pH
MES Tris MES/MgCl2 Tris/MgCl2 MES/EDTA Tris/EDTA
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 5
10 15 20 25 30 35 40 45
50 NH2
EDI EDI/MgCL2
106 Densité en cm-2
pH
MES Tris MES/MgCl2 Tris/MgCl2 MES/EDTA Tris/EDTA
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 4
6 8 10 12 14 16 18 20
22 NH2
EDI EDI/MgCl2
106 Densité en cm-2
pH
MES Tris MES/MgCl2 Tris/MgCl2 MES/EDTA Tris/EDTA
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
0 10 20 30 40
50 NH2
N
Longueur en µm
Figure III.16 : Densité surfacique en fonction du pH pour trois lots de surface NH2 différentes. La mesure de densité est faite sur les échantillons pour laquelle la goutte a incubé 4 minutes et a été enlevée. On obtient alors l’ADN en pelote sur la surface. La mesure de longueur de l’ADN a été faite pour les préparations où l’échantillon est incliné et la solution s’écoule sur la surface. Des images des deux méthodes de dépôt sont indiquées en insert.
10 15 20 25 30 35
0 2 4 6 8 10
12 PMMA
N
Longueur en µm PMMA :
Densité inhomogène et très faible. De l’ordre de
quelques centaines de brins par cm2.
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
0 5 10 15
20 SiO2
N
SiO2 :
Densité très faible. De l’ordre de quelques milliers de brins par
cm2.
On a accumulation d’ADN sur le Bord de la
goutte.
III.2.2.3.2. Résultats
La figure III.15 et III.16 donnent les résultats de la densité d’ADN en fonction du pH.
Sur les surfaces PMMA et SiO2 la densité étant très faible, nous n’avons pas pu la mesurer avec une précision suffisante. On a estimé la densité à environ 1000 brins/cm2.
Le niveau de reproductibilité des expériences peut être déduit de la figure III.16. Nous avons fait le dépôt sur trois lots de surface terminées amine. On a des variations du simple au double sur les densités mesurées entre des surfaces terminées amine appartenant à des lots différents. De plus les surfaces de chaque lot ne se comportent pas exactement de la même façon vis-à-vis des différents tampons utilisés. C’est avec la solution Tris/EDTA qu’on a le plus de reproductibilité (cf . figure III.16).
On ne pourra raisonnablement déduire de nos résultats que des tendances. En particulier, pour toutes les surfaces (sauf celle avec une fonction amine), la densité diminue en fonction du pH.
On peut diviser nos surfaces en 3 groupes. On met à part les surfaces SiO2 et PMMA vu la faible densité observée :
(I) Surfaces : terminée Méthyle (OTS) et Polystyrène (II) Surfaces : Fluorée et terminée Vinyle
(III) Surfaces terminées NH2
Pour les trois groupes les densités observées sont de l’ordre de 107 molécules par cm2 (cf. figure III.15 et III.16).
Pour les surfaces du groupe (I) (méthyle et polystyrène), les solutions d’ADN avec du Tris donnent une densité plus importante par rapport aux solutions contenant du MES. La présence de MgCl2 dans le tampon MES augmente la densité d’ADN déposé. En revanche cela ne change rien dans le cas où le tampon est du Tris.
Pour les surfaces du groupe (II) (fluor et vinyle), les solutions qui contiennent du MES ne permettent pas de déposer d’ADN. Les densités mesurées sont faibles. Avec comme tampon le Tris, la densité diminue en fonction du pH de manière comparable aux surfaces du groupe (I). C’est sur ces surfaces du groupe (II) qu’on a eu le plus de problème de fluorescence parasite. Elle est parfois très importante à tel point qu’on distingue mal l’ADN.
En revanche on a pas eu ce problème avec les surfaces du groupe (I) et (III).
La solution EDI (préparée par simple dilution de la solution commerciale d’ADN-λ de chez Aldrich 250µg/ml jusqu’à avoir une concentration de 10pM) donne de mauvais résultats du point de vue de la densité de molécules déposées. Si on rajoute un sel divalent Mg2+ (par l’ajout de MgCl2), on observe une densité beaucoup plus importante (cf. figure III.15).
On distingue les surfaces des groupes (I) et (II) par rapport à la surface terminée amine (groupe (III)) vis-à-vis du comportement par rapport au cation divalent Mg2+. En effet avec la solution EDI/MgCl2, on a une densité proche de celle observée pour les solutions Tris/EDTA, Tris, Tris/MgCl2 pour les surfaces des groupes (I) et (II). En revanche, ce n’est pas le cas pour la surface terminée amine. On gagne pour cette surface un facteur allant de 2 à 6 sur la densité mesurée lorsqu’on rajoute du sel divalent alors qu’on gagne un facteur de presque 100 pour les surfaces du groupe (I) et (II).
On notera que les courbes de densité (pour les surfaces hydrophobes) des solutions qui contiennent du MES ont l’air décalées par rapport au solution qui contiennent du Tris. On le voit bien sur la figure III.15 dans le cas de l’OTS. Cette observation est moins évidente sur les autres surfaces.
III.2.2.3.3. Interprétation
La dépendance de la densité en fonction du pH correspond à ce qu’ont observé d’autres auteurs [Allemand 1998] [Kang 2001].
La charge des surfaces terminées méthyle, vinyle et fluor, est peu affectées par le pH de la solution. Il n’y a que la surface terminée amine qui est sensible au pH. En effet il y a une fonction acide dont le pKa est de 9.0. Par conséquent au pH où on travaille, cette surface est toujours chargée positivement.
Toutes nos observations sont cohérentes avec cette forte attraction entre l’ADN et la surface terminée amine. En effet, lorsqu’on fait couler la solution le long de l’échantillon, l’ADN est étiré par le gradient de vitesse et dés que la molécule touche la surface elle se fixe immédiatement. En revanche lorsqu’on laisse incuber la goutte, l’ADN se dépose en pelote.
Dans ce cas le mécanisme de fixation de l’ADN ressemble plus à une sorte de « projection » sur la surface de la molécule. L’observation à l’AFM de nos échantillons confirme cette hypothèse [Rivetti 1996]. Enfin, nous verrons au III.2.2.5. que la dépendance en fonction du temps de la densité d’ADN est en accord avec une forte attraction de l’ADN sur la surface qui une fois fixé ne bouge plus [Rivetti 1996].
On peut considérer les charges par leur effet d’écran (cas linéaire de Huckel Debye.
Cf. Chapitre I). Dans ce cas, on peut expliquer les courbes de densité qu’on observe pour les surfaces hydrophobes par un écrantage des interactions électrostatiques.
Tout d’abord on peut expliquer pourquoi on dépose très peu de molécules lorsque la solution d’ADN contient très peu de sels. En effet, les interactions électrostatiques sont peu écrantées. Or, l’ADN lorsqu’il s’approche de la surface va être repoussé par sa charge image [Allemand 1998] [Jackson]. En présence de sels qu’il soit divalent ou monovalent, les interactions sont écrantées. Dans ce cas, l’ADN peut s’approcher de la surface et s’y fixer.
Cela permet d’expliquer pourquoi on retrouve le même niveau de densité avec la solution EDI/MgCl2, qu’avec les solutions Tris, Tris/EDTA, et Tris/MgCl2.
On peut expliquer également pourquoi les courbes du MES sont décalées par rapport aux courbes du Tris. En effet, la quantité d’ions dans la solution dépend du pH, puisqu’on a des acides faibles (le Tris et le MES) dans la solution. Lorsque le pH diminue, on obtient la forme acide du Tris (respect. MES) en dessous de pH = pKaTris = 8.1 (respect. pH = pKaMes = 6.1).
Dans le cas du Tris la forme acide est chargée positivement alors que pour le MES elle est neutre (la forme basique est chargée négativement). De ce fait pour le Tris, la charge positive dans la solution va augmenter en dessous de pH = 8.1. En revanche, pour le MES ça ne change pas grand-chose puisque cette molécule n’est pas chargée positivement et ne peut pas écranter les charges positives. On peut expliquer ainsi pourquoi le MES est un tampon beaucoup moins intéressant pour déposer l’ADN que le Tris.
Bien que l’approche de l’ADN près de la surface dépend de l’écrantage des
surface, il est peu probable que l’interaction soit de type électrostatique.
En conclusion de cette section on a pu constater que c’est la solution de Tris/EDTA qui donne les résultats les plus reproductibles.
Les expériences que nous avons effectuées sur les surfaces SiO2 ne sont pas concluantes. Il aurait certainement mieux valu utiliser des surfaces fraîchement préparées. On peut espérer de meilleurs résultats. Ce travail est en cours.
III.2.2.4. Longueur de l’ADN