Mesure des hauteurs à l’AFM

Une des principales caractéristiques que l’on mesure en microscopie électronique est le diamètre de l’ADN. En microscopie champ proche, on a accès à la troisième dimension, la hauteur.

On donne figure I.21 un résumé des principaux résultats obtenus en microscopie champ proche sur la hauteur de l’ADN. Elle n’a pas été mesurée systématiquement dans les articles traitant du dépôt d’ADN. Il est vrai que les premières tentatives d’imagerie donnaient des inversions de contraste [Thundat 1992], mettant en doute la validité de ces mesures. Même avec l’amélioration des techniques d’imagerie la hauteur attendue de 2nm n’est jamais mesurée bien qu’un certain nombre d’auteurs s’en rapprochent [Bensimon 1998] [Mou 1995]. Dans ce cas l’explication principale de cette sous-évaluation de la hauteur est d’une part l’effet de convolution de la pointe, d’autre part la contrainte mécanique qu’impose la pointe de l’AFM sur l’ADN en mode contact [Vesenka 1992]. Bien entendu le déficit de hauteur peut s’expliquer en partie par ces artefacts de mesure de l’AFM mais cela n’explique pas tout.

Sur une surface recouverte d’une fonction amine l’ADN a une hauteur d’environ 0.5nm, soit 25% de la hauteur attendue [Muir 1998]. De plus des triplex d’ADN et des quadruplex ont une hauteur de respectivement 50% et environ 100% de leur hauteur cristallographique [Muir 1998]. Ce résultat est indépendant de la technique utilisée (AFM, LCSTM,…). La conclusion qui s’impose est que l’ADN a tendance à être écrasé sur la surface. L’effet du substrat est moins important pour les structures plus importantes (triplex et quadruplex d’ADN). Dans ce cas les interactions qui stabilisent la structure l’emportent.

La figure I.22 propose un modèle de l’ADN déposé sur la surface amine.

Figure I.22 : Modèle d’écrasement de l’ADN. Les cations divalents pontent l’ADN à la surface chargée négativement du mica. Cette force est à l’origine de l’écrasement de l’ADN. Le quadruplex d’ADN n’est pas perturbé par le substrat. [Muir 1998]

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0 20 40 60 80 100

Avec un taux d'humidité variable

En solution

Condition ambiante

Sous vide

Humidité relative

hauteur de l'ADN en nm

Mica Mica / Sous vide AP-Mica (Lyubchenko) Mica (Schulz) HOPG (Keller) AP-Mica

bicouche lipidique (Mou) Vinyle (Bensimon)

Mica sans pentylamine (Kasumov) Mica avec pentylamine (Kasumov)

Humidité croissante

Figure I.21 : Mesure de la hauteur de l’ADN. La plupart des mesures sont en désaccords avec la valeur cristallographique attendue de 2nm. La hauteur mesurée est plus importante lorsque l’échantillon est hydraté [Schulz 1998] [Lyubchenko 1997] [Mou 1995]. Lyubchenko et Schulz ont fait des mesures en l’AFM à l’air et en solution. Kasumov [Kasumov 2002] obtient une hauteur qui dépend du traitement de surface. De plus, il obtient pour un des traitements une hauteur compatible avec le diamètre de la forme B de l’ADN. Les deux mesures de Kasumov sont indiquées par une flèche. Les données de la littérature sont dûes à [Muir 1998] [Keller 1989] [Vesenka 1992] [Cherny 1998]

[Bustamante 1992] [Coury 1995] [Coury 1997] [Margeat 1998] [Hansma 1996] [Uchihashi 2000]

[Maeda 1999] [Nony 2001] [Bensimon 1994]

La figure I.21 reprend un certain nombre de mesures de la littérature. Les mesures sont majoritairement inférieures à 1 nm. Il y a tout de même une forte dispersion entre les différents auteurs et pour un même auteur [Bustamante 1992]. La surface pour laquelle il y a le plus de mesures est le mica. Les techniques utilisées pour faire ces mesures sont l’AFM (en mode contact et tapping) à l’air, sous atmosphère inerte et en solution, en non contact AFM sous vide, ainsi que du STM à l’air.

On peut constater que plus le taux d’humidité augmente, et plus la hauteur mesurée a tendance à augmenter. Les mesures faites en solution donnent toutes une hauteur de l’ordre de 1.5 à 2nm [Schulz 1998] [Lyubchenko 1997] [Mou 1995]. Lyubchenko et Schulz ont mesuré sur un même échantillon la hauteur à l’air et en solution. Ils observent une diminution de la hauteur mesurée lorsque la solution est enlevée.

Cette tendance paraît logique puisque l’ADN en solution (ou lorsque le taux d’humidité augmente) va s’entourer d’une couche d’hydratation plus importante. De plus, la présence de l’eau peut stabiliser une forme moins contrainte de la molécule.

Les mesures de Keller (au STM) et Mou (AFM en phase liquide) qui donnent une hauteur proche des 2nm sont particulières. Dans les deux cas, l’interaction entre les molécules d’ADN est importante et impose un certain ordre sur la surface [Keller 1989]

[Mou 1995].

Dans le cas de Keller (une image est donnée figure I.15), les molécules d’ADN sont très proches les unes des autres et forment une structure cristalline. Il est étonnant que la molécule d’ADN soit imagée en STM et donne les bonnes caractéristiques géométriques. On peut suspecter que l’ADN soit plus conducteur dans ce cas par rapport à d’autres résultats où il apparaît en creux [Bottomley 1992]. Cette éventualité de molécules d’ADN parfois conductrices souvent isolantes a été envisagée vers les années 1990 face aux difficultés rencontrées pour imager l’ADN au STM [Dunlapp 1996] [Amrein 1989] [Keller 1989].

Dans le cas de Mou, les molécules d’ADN sont espacées d’environ 5nm. Cette proximité des molécules doit certainement stabiliser les molécules d’ADN. L’interaction entre les brins entre en compétition avec l’interaction avec la surface. A cela il faut rajouter les conditions d’imagerie favorables en solution.

Une mesure récente dû à Kasumov et al. [Kasumov 2002] est intéressante car ils obtiennent de manière reproductible une hauteur de respectivement 1.11±0.2nm et 2.4±0.5nm selon le traitement de surface. Les surfaces qu’ils utilisent sont le mica et le platine évaporé sur une partie de la surface.

Les échantillons qui donnent la hauteur de 2.4nm sont préalablement traités par un plasma avec comme gaz de la pentylamine. A part cela la technique qu’ils utilisent est très

« classique ». L’ADN est déposé en présence de cations Mg²⁺.

La conclusion de cette partie est que l’ADN est généralement contraint sur la surface sur laquelle on le dépose. Il est finalement heureux et étonnant qu’avec un traitement approprié il soit possible d’avoir un dépôt avec la bonne hauteur de la molécule.