Manipulation et observation de l’ADN

VI.1. Solutions d’ADN

L’ADN que l’on utilise est le λ-ADN (Roche Biomedicals) et du poly (dG).poly(dC) et poly(dA).poly(dT) (Amersham Pharmacia Biotechnology Inc.). L’ADN que l’on reçoit est décongelé une première fois pour être aliquoté en portion de 5µl puis recongelé.

Les tampons que l’on utilise sont le Tris et le MES de chez Aldrich (cf. Annexe C).

Ces molécules sont représentées dans l’Annexe C. On utilise ce tampon généralement à 10mM. Afin de limiter l’action d’éventuelles enzymes sur l’ADN, on rajoute de l’EDTA à 1mM. On a également préparé des tampons avec du MgCl2. Dans ce cas on ne met pas d’EDTA.

Nous avons préparé 1L de solution à 10mM de la forme basique et acide du tris ainsi qu’une solution de MES. Nous avons également préparée le même jeu de solution avec 1mM d’EDTA en plus. Nous avons donc 6 solutions mères de 1L stockée dans des bouteilles en verre à l’abri de la lumière. Les bouteilles en verre ont été nettoyées avec un piranha et abondamment rincée à l’eau désionisée (une dizaine de fois).

Pour préparer nos tampons de Tris, nous mélangeons les solutions de la forme basique et acide du tampon sachant que le Tris est un acide faible de pKa = 8.1. Nous prélevons un échantillon de cette solution et nous en mesurons le pH. Il est possible surtout s’il y a de l’EDTA (qui a 4 acidités) que le pH de la solution préparée soit loin de celui qu’on attendait.

Dans ce cas on recommence jusqu’à arriver au bon pH.

h=1.873nm h=1.907nm

a) b)

Figure II.38 : Greffage sélectif du silane OTS. On peut constater en b) que la couche n’est pas complète [Breuil 2000]. En a) la monocouche est plus homogène. On attend une hauteur de 2.3nm.

On mesure une hauteur inférieure car la couche que l’on greffe n’est pas complète

chlorhydrique pour ajuster le pH.

Nos solutions sont préparées et stockées dans des flacons de 100ml en plastique. Elles se gardent au moins six mois. Nous avons toujours manipulé ces solutions avec précaution pour éviter toute contamination.

Pour préparer une solution contenant de l’ADN, on verse dans un petit flacon en plastique le tampon on y rajoute 5µl de la solution mère d’ADN. Avec une dilution de 1000 fois on arrive à une concentration d’ADN de 10pM environ. Cette solution est conservée à 4°C. Elles se gardent environ 1 mois. Au delà nous avons constaté une perte de reproductibilité de nos expériences de dépôt.

VI.2. ADN fluorescent

Pour observer l’ADN au microscope, il faut préalablement insérer dans la double hélice des molécules fluorescentes. Nous avons utilisé du YOYO-1 (cf. Annexe C).

Attention : cette molécule s’intercale dans l’ADN. La notice toxicologique précise que cet agent peut être mutagène. Cette molécule est représentée dans l’annexe C.

Cette molécule peut s’intercaler entre les paires de bases de l’ADN. Elle n’est fluorescente qu’une fois intercalée [Matsumoto 1981]. On s’arrange pour avoir une molécule fluorescente tous les 20 paires de base environ. Nous avons constaté que c’était suffisant pour bien distinguer les molécules d’ADN. Lorsqu’on met plus de YOYO-1, on a observé plus de fluorescence parasite. De plus l’intercalation fragilise l’ADN. Sous l’effet du rayonnement lors de l’observation au microscope la molécule d’ADN finit par être coupée.

On a procédé de la manière suivante pour préparer notre solution d’ADN. On dilue la solution mère d’ADN ainsi que la solution mère de YOYO-1 100 fois. On mélange les deux solutions et on laisse incuber quelques heures à 4°C. Une fois cette étape terminée on finit alors de diluer la solution jusqu’à obtenir la concentration de travail.

Nous avons constaté que si on mélange directement l’ADN et le YOYO-1, on forme une sorte de précipité. Inversement, si on utilise des solutions trop diluées, on a constaté qu’il faut laisser incuber la solution plus longtemps pour que tout le YOYO-1 réagisse avec l’ADN.

Enfin, lors du mélange des deux solutions il faut agiter pour qu’elle se mélange rapidement.

En effet dans le cas contraire, on a observé que les brins d’ADN n’ont pas tous le même niveau de fluorescence. L’explication viendrait du fait que sans agitation, on a une inhomogénéité de concentration de YOYO-1. Par conséquent on peut s’attendre à ce que les molécules n’aient pas la même quantité de molécules fluorescentes intercalées.

VI.3. Observation au microscope

Nous utilisons un microscope (Leica DMLS) pour observer l’ADN dans lequel on a inséré les molécules de YOYO-1 (oxazole homodimer). L’excitation se fait à une longueur d’onde de 491nm (bleu). On récupère le signal à une longueur d’onde de 509nm (vert). La sélection de la fréquence de travail et le filtre de coupure constitue sont placés respectivement sur le trajet aller et d’observation de la lumière (cf figure II.39).

une fluorescence parasite importante. On a certainement un relargage du YOYO-1 dans la solution.

Lorsqu’on observe l’ADN continûment on constate que le signal de fluorescence diminue. On parle de photoblanchiement. On peut utiliser du mercaptoéthanol que l’on rajoute à 4% dans la solution d’ADN. Cela limite l’effet de photoblanchiement. De plus, la molécule finit par être abîmée au cours de l’observation. Elle est en général coupée [Kang 2001]. En effet la désexcitation de la molécule fluorescente peut se faire par voie chimique au lieu de se faire par émission de photons. En particulier, le squelette phosphate peut être coupé.

La coupure des deux brins rompt définitivement la molécule. On peut observer ce phénomène au microscope.

On utilise un objectif Leica DML/HCX-PL Fluotar (× 100) à immersion dans l’huile.

L’ouverture numérique de l’objectif est de 1.3. Cela signifie qu’on récupère quasiment toute la lumière émise. L’éclairage pour l’observation en fluorescence doit être de bonne qualité. Il faut éclairer l’échantillon avec une intensité suffisante pour pouvoir observer de faible niveau de fluorescence. La lampe qu’on utilise est une lampe au mercure à haute pression.

L’émission de la lumière se fait sur une zone d’environ 1 mm de diamètre. Les ampoules qu’on utilise ont une durée de vie de 100 heures. Au-delà, il y a un risque d’explosion de l’ampoule.

Le microscope est muni d’une caméra noir et blanc (Coolsnap – photometrics). Le détecteur est refroidi par effet peltier. Cette caméra est d’une sensibilité légèrement supérieure à l’œil.

Huile

Filtres

Excitation : 491nm (bleu) Retour : 509nm (vert)

Caméra refroidie par effet Peltier

Lampe Mercure 100W haute

pression

Figure II.39 : Schéma d’un microscope à fluorescence. L’objectif est à immersion à grande ouverture numérique. L’éclairage provient d’une lampe à mercure haute pression. Un jeu de filtre permet de sélectionner la longueur d’onde d’excitation du YOYO – 1 (509nm). Un deuxième filtre sélectionne la longueur d’onde d’émission (491nm). Une caméra refroidie par effet Peltier est reliée au microscope pour l’acquisition des images. Pour les échantillons de petite taille, on utilise une lamelle qui plaque

diamètre), nous avons adapté la plateforme du microscope pour maintenir l’échantillon à l’aide d’une lamelle en verre. De plus comme l’échantillon n’est pas en contact avec l’huile, on peut ensuite l’observer à l’AFM (cf. figure II.39).