Discussion

III.4.1. Point de fixation de l’ADN sur la surface

L’objectif de cette partie est de mettre en évidence que l’ADN se fixe à la surface au niveau de quelques points seulement. Un des points de fixation de l’ADN est en général l’extrémité de la molécule [Kang 2001]. Mais les molécules peuvent également se fixer au niveau de la molécule.

On peut observer cela facilement au microscope optique à fluorescence. En effet, dans ce cas, il suffit d’observer suffisamment longtemps une molécule d’ADN pour qu’elle finisse par être clivée photo chimiquement [Kang 2001]. Dans ce cas, la molécule se rétracte jusqu’à son point d’ancrage le plus proche. C’est sur la surface polystyrène que l’on a observé le plus fréquemment ce phénomène. L’ADN est très peu fixé sur la surface.

On peut également observer les points de fixation en soumettant l’ADN déposé sur la surface à un étirement dans la direction perpendiculaire. On obtient un résultat indiqué sur la figure III.21. La molécule reste fixée à ses points d’attaches. Lorsqu’on la soumet à une contrainte perpendiculaire, les parties qui ne sont pas fixées sont emmenées par le fluide. On obtient alors des boucles entre deux points d’attache. On peut constater que la molécule est fixée en un petit nombre de points.

Toutes nos surfaces ont données ce genre de résultats sauf la surface terminées amine.

Dans ce cas l’ADN déposé est insensible aux traitements ultérieurs avec nos solutions.

L’ADN est fixé par interaction électrostatique tout le long de la molécule.

Cette différence de comportement entre le point de fixation de l’ADN et le reste de la molécule est assez étonnante. On peut l’expliquer par une différence de structure. On propose sur la figure deux modèles de fixation de l’ADN sur les surfaces hydrophobes par l’intermédiaire des paires de base. La molécule s’ouvre localement pour exposer les paires de base vers la surface. Dans le cas des surfaces chargées (comme la surface terminée amine), l’interaction se fait plutôt avec les groupements phosphates [Nony 2001].

a) b)

Figure III.22 : Modèle pour l’accrochage de l’ADN sur la surface. En a) accrochage aux extrémités. En b) accrochage d’un segment par ouverture de la double hélice. Les bases peuvent interagir directement avec la surface. Ce modèle est surtout valable pour les surfaces hydrophobes. En effet les surfaces chargées interagissent principalement électrostatiquement avec le groupement phosphate de la molécule.

Figure III.21 : Fixation de l’ADN par des segments et aux extrémités. On observe fréquemment une accumulation de matière plus ou moins importante au point de fixation de l’ADN. Ce n’est pas systématique. Les images a) et b) sont obtenues en microscopie à fluorescence. L’image c) est obtenue à l’AFM en mode tapping. L’ADN sur l’image c) à une longueur d’environ 20µm.

-CH3

200nm PMMA

60µm SiO2

a)

b) c)

III.4.2. Structure de l’ADN sur la surface

Nous avons étudié jusqu’à présent la densité et la longueur de l’ADN déposé. Cette partie est consacrée à tenter d’expliciter la structure de l’ADN, en particulier savoir si deux molécules peuvent former des plectonèmes sur la surface (cf. chapitre I). Les images que nous présentons ont principalement été obtenues en AFM. Ce microscope est intéressant pour l’observation de l’ADN puisqu’il n’est pas nécessaire de traiter la molécule pour pouvoir l’observer comme c’est le cas pour la microscopie à fluorescence (intercalant fluorescent entre les paires de base) ou la microscopie électronique (traitement avec des protéines, ou des sels d’uranium, ou bien métallisation en biais pour augmenter le contraste).

Les brins d’ADN que nous observons à l’AFM et au microscope sont rarement seuls.

Ils forment des cordes composées de quelques unités à plusieurs milliers. Dans le cas d’un petit nombre d’ADN, l’AFM permet dans certaines situations (substrat très plat, bonne pointe,…) de distinguer la formation de pléctonème. Il est vrai que l’observation de telles structures est à la limite de résolution de l’appareil, mais il est fort probable que sur l’image obtenue sur SiH (cf. figure III.23) on ait effectivement un plectonème. De plus nous avons observé de telles structures sur d’autres surfaces (-NH2, méthyle). La périodicité de l’enroulement va de 30nm à 50nm. Thundat a observé des plectonèmes en mode contact [Thundat 1992] sur des molécules d’ADN circulaires.

Sur la figure III.23 le brin d’ADN est fixé en trois endroits de la surface SiH. Le sens du peignage est indiqué par la flèche. Lorsque deux brins se croisent il y a deux possibilités.

Soient ils restent l’un à coté de l’autre. Soit ils s’enroulent l’un sur l’autre et forme un plectonème.

Les deux hypothèses sont représentées sur la figure III.23. La mesure de la hauteur des brins est en accord avec la formation d’un plectonème. En effet, si les brins étaient côte à côte, on ne verrait pas de changement de hauteur (cf. point a, b et c sur la figure III.23).

Inversement, il est possible que cette image nous donne un artefact puisque l’ADN donne également des ondulations à des endroits où il n’y a qu’une seule molécule d’ADN. On peut également avoir un mixage des deux configurations. C’est certainement le cas de notre molécule puisque l’ondulation et la hauteur sont plus faibles sur la fourche (cf. zoom sur la figure III.23).

De toute manière on ne peut espérer voir de pléctonème que sur des molécules d’ADN soumise à une contrainte de torsion [Bednar 1994] [Sottas 1999]. Si le brin se fixe en plusieurs endroits, le nombre de tour d’hélice est fixé entre les deux points d’attache. C’est au moment du peignage que la contrainte peut se retrouver localisée à un endroit et provoquer la formation d’un plectonème.

Figure III.23 : Structure de l’ADN déposé sur une surface de SiH. On a certainement un plectonème sur une partie au moins de la zone où il y a deux brins d’ADN. La flèche indique le sens du peignage. La hauteur au point c est double de celle au point a et b. Les images sont obtenues en mode tapping AFM.

Brins d’ADN côte à côte

Ou Plectonème SiH

1.5µm

30 à 50nm

a c b

III.5. Mesure de la hauteur de l’ADN