Afinidade e termo-estabilidade do complexo

2.11.1 Anisotropia de Fluorescência

Foram realizados dois ensaios de anisotropia, sendo um para verificar a afinidade entre as proteína do complexo TR:PDI; e um segundo experimento para verificar a se o complexo TR:PDI permite o recrutamento de coativador, o SRC-1.

No primeiro ensaio, realizado pela Dra. Juliana Fattori, para verificar a afinidade entre as proteínas do complexo, foi titulada PDIFULL em concentrações

variando entre 1 a 5000 nM em uma solução contendo TRDL com FITC (isotiocianato

de fluoresceína), na presença ou ausência de hormônio, em concentração de 50 nM. Para este ensaio, TRDL foi marcada com excesso de sonda (FITC – Invitrogen)

equivalente a 3 vezes a concentração molar da proteína e foi incubada por 1 hora no gelo. Posteriormente, a solução TRDL+sonda foi aplicada em uma coluna de

desalting (HiTrap desalting – GE Healthcare) para retirada do excesso de sonda. As amostras obtidas de TRDL marcada foram monitoradas por absorbância em 280 e

495 nm para monitorar a presença de proteína e sonda, respectivamente. Essa mesma marcação foi feita para a proteína PDI usada no ensaio de anisotropia com a proteína TRFULL. Nesse ensaio, foi titulado TRFULL em concentrações variando entre

1 a 5000 nM em uma solução contendo PDI com FITC, na presença ou ausência de hormônio, em concentração de 50 nM.

O segundo ensaio foi realizado para estudar a ação do complexo (TR:PDI) no desligamento e recrutamento de peptídeo da proteína coativadora, SRC-1. Para isso, incubamos as proteínas TR e PDI na proporção molar 1:1 para formar o complexo, e em seguida, adicionamos T3 com 3 vezes de excesso molar. Incubamos por 1 hora, a 4o_{C. O complexo, em concentrações variando de 1 a 7000 nM, foi titulado em}

corregulador utilizado neste segundo ensaio foi obtido pela Life-technologies : SRC1- 1 (peptídeo coativador)  FITC-KYSQTSHKLVQLLTTTAEQQL

Para todos os ensaios foram feitos 3 experimentos independentes, e a curva média de cada condição foi contruída no Origin. Foi medida a constante de dissociação (Kd) de cada curva e dos valores foram calculados uma média e um desvio padrão (erro). Para as medidas, os dados foram ajustados no programa Origin por meio do algoritmo de Levenberg-Marquardt, e as curvas foram ajustadas de acordo com a equação Hill para determinação dos valores de constante de dissociação (Kd) e índice de cooperatividade (FIGUEIRA et al., 2010a).

A anisotropia foi medida a 15°C num fluorímetro (ISS-K2), utilizando 495 nm como comprimento de onda de excitação, sendo a emissão monitorada a partir de 520 nm, utilizando-se filtro de 490 nm de Cuttoff (Kopp Glass #3384). Os valores de anisotropia foram calculados pelo programa Vinci-ISS por meio da função (LAKOWICZ, 2006):

 No qual I se refere a intensidade de fluorescência medida, V e H correspondem aos polarizadores orientados na vertical e horizontal, respectivamente, e G é um fator de correção que considera diferenças da sensibilidade da fotomultiplicadora, dependente das direções dos polarizadores.

Esse fator de correção pode ser calculado de acordo com (LAKOWICZ, 2006):

2.11.2 Dicroísmo Circular - CD

Foram realizados ensaios de dicroísmo circular (CD) para avaliar a estrutura secundária do complexo e a termoestabilidade do mesmo. As medidas de CD foram feitas em um espectropolarímetro J-810 (JASCO), equipado com um controlador de temperatura (Peltier Type Control System PFD 4255, JASCO). Utilizando cubetas de quartzo de 1 mm de caminho óptico, as medidas foram feitas com uma velocidade

de varredura de 20 nm/min de 197 a 260 nm, 25 acumulações, com intervalo de dados de 0,5 nm a 10o_{C. Amostras das proteínas TRβ}

DL e PDI, isoladas e em complexo

(TRβDL+PDI) na proporção 1:1, foram diluídas a concentração de 5 μmol/L.

Realizamos também a deconvolução dos espectros de CD das proteínas e do complexo e obtivemos uma estimativa da estrutura secundária das mesmas. A deconvolução dos espectros foi feita no servidor DichroWeb, utilizando o programa K2D (ANDRADE et al., 1993; MERELO et al., 1994). Esta deconvolução foi feita baseada em algorítmos e representa uma estimativa da estrutura secundária da proteína.

2.11.3 Thermal-Shift

Este experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a termo estabilidade do complexo TR:PDI. O Thermal-shift consiste em um experimento no qual a proteína é incubada com uma sonda fluorescente, SYPRO Orange (Life Technologies), que somente emite fluorescência quando se liga em partes hidrofóbicas, as medidas são realizadas em um equipamento de qPCR, pois este possui a capacidade de fazer uma rampa de temperatura de forma controlada e também realizar a leitura de fluorescência da amostra (LAYTON; HELLINGA, 2011).

No início do experimento, a proteína (ou complexo) está enovelada e a fluorescência medida tem baixo valor, visto que as suas partes hidrofóbicas devem estar escondidas do solvente. Esta proteína começa a ser aquecida em uma rampa de temperatura de 10 a 100°C, variando-se a temperatura de 1 em 1 °C. Com isso, a estrutura proteica começa a ser perdida, as partes hidrofóbicas são expostas e a sonda se liga à proteína, emitindo fluorescência. A medida que a proteína perde sua estrutura, a sonda se desliga, diminuindo a emissão da fluorescência, e curvas de melting da proteína são obtidas. Com isso é possível calcular a temperatura média do desenovelamento terciário da proteína (Tm) em diferentes condições, em

complexo ou sozinha, na presença ou ausência de hormônio. As condições que estabilizam a estrutura da proteína apresentarão uma Tm maior. Os dados foram

analisados em Excel e no programa Origin, onde foi possível checar a temperatura de melting dos complexos em cada uma das condições.

Para realizar o experimento, concentramos as três proteínas (TR, TR e PDI), e juntamos na proporção molar 1:1 cada complexo (20 M de cada proteína), no tampão Hepes 20 mM pH 8, NaCl 200 mM, 5% de glicerol e DTT 2 mM . Também separamos alíquotas do complexo e incubamos com 3 vezes de excesso molar de T3. Ambos, proteínas com T3 e complexos foram incubados por 1 hora, a 4o_{C, antes do}

início do ensaio.

As quantidades de proteína e sonda foram escolhidas baseadas em um teste feito previamente. Nesse teste variamos as condições de cada reagente. A partir disso, escolhemos a condição onde obtivemos o melhor sinal de fluorescência para ser usada no ensaio descrito (sonda de 10 a 20x, e proteína ou complexos de 10 a 15

M).

O ensaio de Thermal-shift foi realizado em placas de de 96 poços para qPCR, em um volume final de 25 L. As condições utilizadas foram feitas em triplicata experimental. Utilizamos condições com proteínas sozinhas (TRFULL ou TRDL ou

PDIFULL, na presença e ausência de T3) e em complexos (TRFULL:PDI ou TRDL:PDI, na

presença e ausência de T3).