Interactoma e análise de IP+y2h

A lista de peptídeos obtida por LC-MS/MS foi carregada juntamente com a lista do duplo-híbrido para a plataforma IIS, onde seguimos com as análises dos interactomas através de diversos softwares e plataformas (IIS, Cytoscape, MetaCore e GeneCodis). Os interactomas foram visualizados no Cytoscape, onde cada proteína (identificada por um código swissprot) é classificada com um Top Enriched Biological Process (TEBP), segundo o banco de dados do Gene Ontology (ASHBURNER et al., 2000; CONSORTIUM, 2015), sendo o enriquecimento feito de acordo com o melhor p-value dentre os processos biológicos que aquela proteína participa.

Em seguida, a árvore inferida para cada TEBP foi analisada e aqueles processos que se juntavam em um ramo superior foram agrupados e renomeados como mostrado nos interactomas a seguir (FIGURAS 23-26). .

FIGURA 23. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological

Processes – Gene Ontology). Em roxo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas dobanco de dados. Em azul, os

FIGURA 24. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological

Processes – Gene Ontology). Em roxo, nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os

FIGURA 25. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological

Processes – Gene Ontology). Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os

FIGURA 26. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR.

A grosso modo, verificamos que TR sem ligante (TR-T3, FIGURA 23) participa de 27 processos biológicos, além de interagir com outros 125 alvos não agrupados em processos específicos. A presença do ligante (TR+T3, FIGURA 24) parece direcionar o TR para os eventos relacionados à transcrição e metabolismo, embora esta isoforma ainda continue participando de 22 processos celulares e interaja com 78 proteinas não agrupadas em processos específicos (pontos agrupados formando um quadrado ao centro da parte inferior das FIGURAS 23 e 24). A ausência do ligante envolve o TR em um leque mais amplo de processos como: apoptose, divisão celular, processos metabólicos de compostos nitrogenados, biossíntese de acetil-CoA, tradução na mitocôndria, regulação positiva da atividade de quinases e biossíntese de ATP (FIGURA 23), além dos encontrados independente da presença do T3. Entretanto, a presença do ligante, parece direcionar o TR para vias mais enriquecidas em número de parceiros, como: transcrição, tradução, metabolismo de RNA, ciclo celular, processos virais, metabolismo de pequenas moléculas, apoptose e direcionamento de axônio (FIGURA 24).

Por outro lado, a análise do interactoma de TR evidencia claramente que esta isoforma do receptor é mais restrita quanto às interações celulares. O TR, na ausência do ligante (TR-T3, FIGURA 25), participa de 22 processos celulares, sendo que 15 deles são os mesmos encontrados em TR, e 7 são exclusivos. A presença do ligante (TR+T3, FIGURA 26) parece direcionar o TR para interações que favoreçam transcrição, tradução, metabolismo e reparo de DNA, além de metabolismo de lipídeos. O número de processos celulares que o TR participa na ausência de ligantes foi reduzido para 9 após a adição do T3, e o número de interações com proteínas não listadas em processos também foi reduzido de 56 para 20 parceiros (pontos agrupados formando um quadrado ao centro da parte inferior das FIGURAS 25 e 26). Os processos exclusivos da rede para este receptor na ausência de seu ligante foram: tradução, processos metabólicos de RNA, apoptose, enovelamento de proteínas, direcionamento proteico, organização de citoesqueleto, transporte celular, proliferação celular, resposta a vírus, regeneração de órgãos e metabolismo de compostos nitrogenados. Outros processos em que TR está envolvido e que

merecem destaque são aqueles que aparecem independente da presença do ligante: desenvolvimento, metabolismo de lipídios, reparo de DNA, metabolismo de DNA, metabolismo de pequenas moléculas, processos virais, ciclo celular e transcrição.

Se compararmos de maneira geral ambas as isoformas, independente da presença de T3, observamos nas redes da isoforma TR (FIGURAS 23 e 24), esta proteína interagindo com proteínas que regulam a divisão celular, expressão gênica, via da ubiquitina, tradução na mitocôndria, biossíntese de acetil-CoA, regulação positiva da atividade de quinases, biossíntese de ATP, resposta imune e desenvolvimento de sistema nervoso. Enquanto que TR (FIGURAS 25 e 26) regula vias diferentes daquelas observadas para TR, como metabolismo de DNA, reparo de DNA, e regeneração de órgãos. Existem ainda outras vias que são reguladas por ambas isoformas (ex. transcrição, tradução, metabolismo de RNA, processos virais, ciclo celular, transdução de sinais, etc). Além disso, TRα interage com maior número de proteínas, além de participar de mais processos celulares que TRβ, demonstrando que o TRα deva ser menos específico e mais promíscuo em relação aos processos e interações que participa, enquanto TRβ parece ser mais direcionado para eventos relacionados à regulação da transcrição. Entretanto, foram observados muitos processos biológicos similares entre as duas isoformas, como regulação da transcrição e metabolismo, principalmente na ausência de ligante. Comparando todos os processos que TRβ e TRα participam, 15 são comuns.

Nossos dados corroboram com os resultados observados em um artigo publicado (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014), no qual TR interage com uma variedade mais ampla de parceiros, sendo alguns deles co-expressos em tecidos nos quais observamos alta expressão de TR. De fato, neste trabalho os autores encontram uma gama variada de possíveis parceiros de TR, e os parceiros de TR estão em menor número e incluídos na lista de parceiros da isoforma . Ou seja, podemos dizer que a função de TR, nesse caso, é suprida pela isoforma , mas o contrário não é verdadeiro.

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