UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Jéssica Christina Lois de Oliveira Campos
Interações entre as Isoformas Alfa e Beta dos
Receptores de Hormônios Tireoidianos (TR) e outras
Proteínas Celulares
CAMPINAS
JÉSSICA CHRISTINA LOIS DE OLIVEIRA CAMPOS
Interações entre as Isoformas Alfa e Beta dos Receptores de
Hormônios Tireoidianos (TR) e outras Proteínas Celulares
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências, na área de concentração em Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientadora: Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira
CAMPINAS
2016 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JÉSSICA CHRISTINA LOIS DE OLIVEIRA CAMPOS E ORIENTADA PELA DRA. ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2011/23659-2
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Campos, Jéssica Christina Lóis de Oliveira,
C157i CamInterações entre as isoformas alfa e beta dos receptores de hormônios
tireoidianos (TR) e outras proteínas celulares / Jéssica Christina Lóis de Oliveira Campos. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
CamOrientador: Ana Carolina Migliorini Figueira.
CamTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Cam1. Receptores dos hormônios tireóideos. 2. Interação proteína-proteína. 3.
Técnicas do sistema de duplo-híbrido. 4. Espectrometria de massas. I. Figueira, Ana Carolina Migliorini. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Interactions among isoforms alpha and beta of thyroid hormone receptor (TR) and other cellular proteins
Palavras-chave em inglês: Receptors, Thyroid hormone Protein-protein interaction Two-hybrid system techniques Mass spectrometry
Área de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Ana Carolina Migliorini Figueira [Orientador] Sandra Martha Gomes Dias
Francisco de Assis Rocha Neves Fernanda Aparecida Helena Batista Célia Regina Nogueira
Data de defesa: 31-08-2016
Campinas, 31 de agosto de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira (Orientadora)
Dra. Sandra Martha Gomes Dias
Prof. Dr. Franscisco de Assis Rocha Neves Dra. Fernanda Aparecida Helena Batista Prof. Dra. Célia Regina Nogueira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A tese de doutorado aqui apresentada recebeu apoio de agência de fomento à pesquisa científica e tecnológica, conforme descrito abaixo,
Agência: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Linha de Fomento: Doutorado Direto
Número do Processo: 2011/23659-2
Beneficiário: Jéssica Christina Lois de Oliveira Campos
Agência: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Linha de Fomento: Bolsa Estágio de Pesquisa no Exterior - Doutorado Número do Processo: 2014/22215-1
Beneficiário: Jéssica Christina Lois de Oliveira Campos
Agência: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Linha de Fomento: Projeto
Número do Processo: 2013/08743-2
Dedicatória
: Aos meus avós, pais e padrinhos: Cleusa Pereira de Souza & Wilson Maffei Lois. Pelo amor incondicional, - e café - todas as manhãs. A Molly, por me ensinar que tudo acontece em seuAgradecimentos
“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar... As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito.” (Chico Xavier)
A minha família Lois. Fabiana (Mãe), Cleusa & Wilson (avós), por todo o apoio e amor. Sem vocês eu não chegaria até aqui.
A minha segunda família, Scozzafave, tão acolhedora e sempre pronta a me ajudar: Maria, João, Cassio & Sanny.
Ao Marcio, e ao meu irmão, Bruno, pelo apoio e carinho. Aos amigos e irmãos que a vida me deu.
Daniela Bertelli, Bianca Assunção, Rebeka Melo, Carolina Mantovani, Marina Cabral ... Desde 2001 juntas pra vida toda.
Aos meus amigos da ‘Rep33’: Andre Godoy, Danielle Pini, Gabriela Vitcosque, Flavia Facchini, Marina Ramia, Carla Codima. Desde 2007 me fazendo crescer e evoluir como pessoa. Obrigada pelas risadas, por ouvirem meus dramas, pela sinceridade. A minha Sis, Bruna Tullio, você além de ser minha confidente e irmã, me ensinou que amizade não tem barreiras de tempo e distância.
A minha 'ermã', Bárbara Pires, obrigada por me ensinar a ser forte, e por me mostrar como ser uma pessoa melhor.
As minhas eternas ‘LECas’ (Aline Bridi, Juliana Fattori, Tábata Doratioto, Michelle Assis, Nathalia Indolfo, Natalia Videira). Crescemos juntas profissionalmente e aprendemos a ser mais fortes. Vocês foram essenciais nessa trajetória.
As 'macaca-véia' da dança, pelos happy-hours e lembranças maravilhosas. A todos amigos que fiz em Houston.
Aos colegas e amigos do LNBio que de uma forma ou outra contribuiram para o desenvolvimento dessa pesquisa.
Obrigada: Marcel Nakahira pela ajuda no desenvolvimento dos ensaios de duplo-híbrido. LECas que também me ajudaram. Beatriz Alves pelas clonagens, Gabriela Meirelles pela ajuda na construção das redes de interação. Helder Veras pela construção dos modelos de docking e mutagenese. Juliana Fattori pela ajuda com a produção das proteínas e ensaios biofísicos.
A minha orientadora, Dra. Ana Carolina, pela oportunidade e orientação.
Ao Dr. Paul Webb e todos que conheci no Houston Methodist Research Institute. Durante 6 meses aprendi e cresci muito como cientista.
A FAPESP pelo financiamento dos projetos de Doutorado e Pesquisa no Exterior. Ao LNBio e a todas as instalações utilizadas nesse projeto: LEC, LPP, MAS, LBC e LVV. E por último e nunca menos importante, a você Caio. Obrigada pelo amor, amizade, apoio, otimismo. Não consigo enumerar aqui o tamanho da sua importância para o desenvolvimento e finalização desse projeto. Obrigada por me tornar uma pessoa melhor. Sempre.
“Continue a nadar... Para achar a solução ...continue a nadar...”
Resumo
Receptores Nucleares (RNs) são proteínas ativas na presença de moléculas pequenas e hidrofóbicas, os quais atuam na regulação direta sobre a transcrição de genes. Os Receptores de Hormônios Tireoidianos (TRs) são RNs que possuem efeitos na taxa metabólica e consumo de oxigênio, e também funções únicas em diversos órgãos. Os TRs possuem duas isoformas: TR e TR, e sua expressão é diferenciada em vários tecidos. Os hormônios que se ligam aos TRs são a tiroxina (T4) e a triiodotironina (T3). Atualmente, um melhor entendimento sobre a regulação da transcrição por estes receptores tem se tornado uma necessidade para o mapeamento de diferenças que poderiam resultar em novos alvos para a regulação de diversas patologias. Para isso, usamos screenings de duplo-híbrido (y2h) e imunoprecipitação (IP) seguida de espectrometria de massas (LC-MS/MS) para identificar o maior número possível de parceiros de interação, buscando diferenças entre suas isoformas e a influência do T3 nestas interações. Primeiramente, concluímos que TR faz mais interações com outras proteínas, se comparado à isoforma . Em segundo lugar, observamos a diminuição da expressão de TRs após tratamento com T3. Em terceiro lugar, foram montadas redes de interação nas quais foram evidenciados os processos biológicos nos quais os candidatos participam. Em seguida, algumas interações encontradas com proteínas reguladoras de ciclo celular foram confirmadas por co-imunoprecipitação (Co-IP), sendo uma delas formada por TR e a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Esta interação foi investigada mais profundamente e nossos resultados demonstram que a PDI é capaz de interferir na expressão regulada por TR, sendo que o knockdown de PDI revelou a alteração na expressão de alguns genes. Este complexo foi caracterizado através de ensaios biofísicos e observamos que a formação do complexo não altera o recrutamento de coativadores por TR. Por fim, modelos in silico demonstraram as possíveis interfaces de interação do complexo. Com isso, sugerimos que TRs podem ter um papel muito importante em vias pouco estudadas como ciclo celular, e que mecanismos redox podem ser importantes para alterar a regulação gênica mediada por TR.
Abstract
Nuclear Receptors (NRs) are proteins activated by small hydrophobic molecules that act directly in regulation of gene expression. Thyroid Hormone Receptors (TRs) are NRs involved in maintaining metabolic rates, oxygen consumption and have unique functions in different organs. There are two isoforms of TRs: TR and TR, each one has different expression among human tissues. The small hydrophobic molecules responsible for TRs regulation are triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4) hormones. Nowadays, a deeply understanding of indirect non-classical transcription regulation by TRs could lead to a better mapping of the main differences between normal and pathological states of the cell. To do so, we performed screenings in yeast two-hybrid system (y2h) and immunoprecipitation (IP) followed by Mass Spectrometry (LC-MS/MS) to identify novel interactors for TRs and to elucidate possible differences between both isoforms plus and minus T3. The results showed TR binding a superior number of interactors in comparison with TR. In second place, treatment with T3 decreases TR expression. In third place, we build interactomes for TRs and we classified the protein candidates by biological process (BP). Following, important candidates from cell cycle regulation BP were confirmed by Co-immunoprecipitation (Co-IP) with TRs. One of those interactions, TR and protein disulfide isomerase (PDI) was further investigated and our results showed that PDI changes TR-gene regulation in reporter gene assays. In addition, PDI knockdown alters expression of some genes. In Biophysical Assays we characterized TR-PDI complex and measure binding affinities (Kd). We observed that complex formation do not change coactivator recruitment. Finally, we built in silico models in order to elucidate TR-PDI possible interfaces of interaction. Overall, we suggest that TRs have important roles in less studied pathways, as cell cycle regulation, and TRs could be regulated by redox mechanism to change gene expression.
Lista de Figuras
FIGURA 1. Ilustração esquemática da organização estrutural e funcional dos receptores nucleares. As regiões mais bem conservadas C e E estão representadas por um retângulo cinza, e as barras coloridas são as regiões divergentes A/B, D e F. AF-1 e AF-2 representam os domínios de ativação da transcrição (Activation Function, AF). ____________________________________________________________ 21 FIGURA 2. Esquema dos três estados conformacionais do LBD dos RNs. (a) Forma apo (sem ligante) do RXR LBD. (b) Forma holo - ligante agonista - do LBD do RAR. (c) Forma holo – ligante antagonista – do LBD do RAR. A superfície de dimerização está mostrada em verde, os sítios de ligação a correpressores e coativadores está em laranja, e a hélice H12 que contém a AF-2 está em vermelho. LBP – Bolsão de ligação ao ligante (BOURGUET; GERMAIN; GRONEMEYER, 2000)._______________ 23 FIGURA 3. Mecanismo de ação clássico dos RNs. Quando na forma apo (sem ligante), os RNs podem ser encontrados no citoplasma ou no núcleo ligados a correpressores e deacetilases de histonas. Esse estado reprime a transcrição do gene. Uma vez que o ligante chega e se liga ao RN (forma holo), muda sua conformação de forma a recrutar coativadores, acetilases de histona e toda a maquinaria da transcrição, ativando a expressão do gene [Figura adaptada de (ARANDA; PASCUAL, 2001)]. ___ 25 FIGURA 4. Ligação do RNs nos HREs. As diversas orientações dos motivos hexaméricos: Pal (palíndromo) - para ligação de homodímeros; A/T (sequência rica em A/T+) - motivo hexamérico para a ligação de monômeros; e heterodímeros são formados tanto em Pal, quanto em DR (Repetição Direta) ou IP (palíndromo invertido) (ARANDA; PASCUAL, 2001). _____________________________ 27 FIGURA 5. Hormônios da Tireoide A. Hormônios Tireoidianos, T3 e T4, diferença de um iodo a mais na posição 5’. B. Eixo Hipotálamo Glândula Pituitária Tireóide. Hipotálamo produz TRH que estimula a pituitária a produzir TSH, que por sua vez, estimula a tireoide a produzir T3/T4. Estes últimos regulam negativamente a produção de TSH e TRH pela pituitária e hipotálamo, respectivamente. [Modificado de (BRENT, 2012)]. _________________________________________ 29 FIGURA 6. Representação esquemática das isoformas de TR. TRs são codificados pelos genes THRA e THRB localizados em cromossomos diferentes. O splicing alternativo dos transcritos primários resultam em diferentes isoformas. TRs compartilham de uma alta homologia no domínio C (DBD - Domínio de Ligação ao DNA, barra sólida) e Domínio D/E (LBD – Domínio de Ligação ao Ligante). Os domínios amino-terminais A/B são variáveis em sequencia e tamanho. [Modificada de (CHENG; LEONARD; DAVIS, 2010)]. ____________________________________________________________ 30 FIGURA 7. Um exemplo de ação genômica (1) e indiretamente genômica (2) dos Hormônios da Tireóide (TH). A ação genômica acontece de forma clássica e requer regulação direta da transcrição pelos elementos responsivos à TR (TREs). No caso da ação não-genômica, o inicio acontece pela ativação de PI3K através dos THs. Essa ativação leva à ativação em sequência da cascata Akt/PKB-mTOR-p70S6K. Ainda pouco entendido, esse mecanismo leva ao aumento da expressão de genes como ZAKI-4α e HIF-1α. GTF: Fatores de Transcrição Genéricos. Modificado de (MOELLER et al., 2006). _________________________________________________________________________________ 32 FIGURA 8. Mecanismo de funcionamento do screeening de duplo-híbrido (y2h). Os genes lacZ e HIS3 estão sob regulação do promotor da LexA. Dentre as presas (fusionadas ao Domínio de Ativação da Gal4) encontradas na biblioteca de cDNA de HeLa, temos duas situação possíveis: (1) não existe interação com a isca (que fusionada ao Domínio de Ligação ao DNA da LexA), e então os domínios de ativação e ligação ao DNA não ficam próximos o suficiente para reconstituir a maquinaria de transcrição e transcrever os genes repórteres; (2) existe interação com a isca, e então os domínios de ativação e ligação ao DNA ficam próximos o suficiente para reconstituir a maquinaria de transcrição e transcrever os genes repórteres. Dessa forma a levedura consegue crescer em meio restritivo de histidina (SD-WLH) e consegue quebrar a x-gal e produzir o substrato azul (teste da -galactosidase). _________________________________________________________________________________ 42 FIGURA 9. Teste da auto-ativação das presas do duplo-híbrido. A. Transformação e plaqueamento em gotas. Colônia de L40 é transformada com a isca (ou controles) e plaqueada em meio restritivo. B. Esquema de plaqueamento dos controles e iscas no teste da auto-ativação. C. Teste da auto-ativação (Crescimento da colônia em meio restritivo seguido por teste da beta-galactosidase. Nesse teste é verificado se a isca sozinha é capaz de auto-ativar o promotor e transcrever o gene repórter lacZ (coloração azul). As colônias transformadas são retiradas da placa através de um papel filtro, lisadas e submetidas à imersão em solução contendo x-gal (z-buffer). A quebra da x-gal pela enzima beta-galactosidade produz um substrato de coloração azul. Detalhes na Tabela 3. ___________________ 44
FIGURA 10. Western Blot anti-flag confirmando a Expressão de TRs em HepG2. 1. Células parentais HepG2; 2. HepG2 infectadas com lentivirus controle; 3. HepG2 infectadas com lentivirus expressando TRα; 4. HepG2 infectadas com lentivirus expressando TRβ. Clones estáveis de HepG2 gentilmente doados pelo grupo do Pesquisador Dr. Paul Webb. Figura retirada de (LIN et al., 2013). __________ 50 FIGURA 11. Árvore de Ontologias da plataforma Gene Ontology. Em negrito “regulation of gene expression” é considerado um ramo superior indicando um processo biológico. Abaixo deste, estão os ramos inferiores, ou seja, processos biológicos que estão contidos dentro do ramo superior. ______ 60 FIGURA 12. Subclonagens no vetor pBTM-116kQ’. O vetor ampliado mostra a localização dos genes TRs subclonados. Destacamos as regiões mais importantes do vetor: KanR, que fornece resistência à kanamicina quando expresso em E. coli; TRP1, gene que permite o crescimento da levedura em meio sem triptofano (SD-W); LexA-DBD, Domínio de ligação ao DNA da lexA, clonado em fusão ao gene da isca. ______________________________________________________________________________ 77 FIGURA 13. Subclonagens no vetor Lentiviral pLVIG. O vetor mostra a região em que o genes TRs foram subclonados. Destacamos as regiões mais importantes do vetor: LTR, regiões que codificam genes necessários à formação do lentivírus; Promotor Ubiquitina, que dirige a expressão dos genes, AMP, gene que confere resistência à ampicilina quando expresso em E. coli.; IRES-GFP, região de transcrição policistrônica do gene da proteína GFP. _______________________________________ 78 FIGURA 14. Teste da auto-ativação (5mM 3-AT): As placas SD-W (sem triptofano) permitem o crescimento das colônias que possuem o vetor pBTM116-KQ’. E placas SD-WL (sem triptofano; sem leucina) permitem o crescimento de colônias com pBTM116-KQ’ e pACT2. Com isso, o teste da beta-galactosidade mostra a não-transcrição do gene repórter lacZ nos casos de controle negativo (vetores vazios) e a auto-ativação (azul) nas condições de controle positivo (FEZ; interação NDR:YA4). Felizmente ambas isoformas de TR não auto-ativaram (cor da colônia rosa claro), portanto seguimos o screening com esses RNs. ____________________________________________________________ 79 FIGURA 15. Teste da beta-galactosidade nas colônias resultantes do screening. Aqui mostramos uma placa de cada isca, porém esse mesmo teste foi aplicado em todas as colônias encontradas. Após repique e crescimento das colônias, as mesmas foram retiradas com papel filtro e incubadas com buffer-Z (que possui o substrato da beta-gal, x-gal). A figura mostra a grande maioria de colônias azuis presentes, onde houve transcrição do gene repórter lacZ. Os destaques em rosa mostram colônias que não apresentaram interação e, portanto, o gene lacZ não foi transcrito, sendo consideradas ‘falso-positivas’. _________________________________________________________ 80 FIGURA 16. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRASNFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado a triplicata 1-3, é o controle sem TR (espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal uma cor de colônia rosa claro, sem halos azuis) , e a triplicata 4-6, onde temos a confirmação da interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior em SD-WLH, e no te(espera-se da -gal uma colônia com halos azuis). ___ 82 FIGURA 17. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRANSFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado, a triplicata 1-3 é o controle sem TR (espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal, colônia rosa claro, sem halos azuis), a triplicata 4-6, confirma a interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior em SD-WLH, e no tese da -gal uma colônia com halos azuis). _______________________________ 83 FIGURA 18. Interactoma dos parceiros de TR encontrados no duplo-híbrido (y2h), analisados pela plataforma IIS e visualizados no Cytoscape. Em verde, os parceiros já descritos na literatura como interactores de TR, e em azul os parceiros inéditos. ________________________________________ 85
FIGURA 19. Células 293T transfectadas (ou sem transfectar) com flag-TRs ou GFP-flag. Imagens obtidas com microscópio de fluorescência (FITC). Em verde, GFP expresso nas células 293T indicando que o plasmídeo que contém o gene do TR foi transcrito juntamente com GFP. _________________ 91 FIGURA 20. Transfecção de flag-TR em 293T, com e sem T3. A presença de T3, após 36h de tratamento, diminui a expressão de TRs. A. Western Blot mostrando os TRs fusionados a flag (WB anti-flag) e a proteína controle de ‘loading’ (WB anti-beta actina). B. Quantificação da intensidade das bandas (ImageStudio, LI-COR) em relação ao controle ( -actina). ____________________________ 92 FIGURA 21. Ensaios de Gene Repórter em células 293T – Transativação de TRα (acima) e TRβ (abaixo). Os gráficos mostram a ativação de cada receptor após a adição do hormônio T3 (1 μM). Em todas as condições houve uma ativação significativa após a adição do hormônio, se comparada com a ativação basal (TR sem T3 = 1). A quantidade de luminescência se apresenta normalizada e representa apenas o sinal proveniente de flag-TRs transfectados (TRs endógenos foram subtraídos). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni (p ≤0.05; n=3). __________________________________________________________ 94 FIGURA 22. Imunoprecipitação (IP) de flag-TRs e GFP-flag usando a resina anti-flag. A. Transfecção transiente de flag-TRs em 293T. O input mostra flag-TRs presentes antes da IP. As IPs são alíquotas da eluição onde também verificamos a presença de flag-TRs. O TR aparece com um tamanho menor que o TR, como esperado. B. Transfecção transiente de flag-GFP em 293T. O input mostra flag-GFP presente antes da IP. As IPs são alíquotas da eluição onde também verificamos a presença de flag-GFP. _____________________________________________________________________________ 95 FIGURA 23. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em roxo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. _____________________________________________ 97 FIGURA 24. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em roxo, nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. _____________________________________________ 98 FIGURA 25. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. _____________________________________________ 99 FIGURA 26. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. ____________________________________________ 100 FIGURA 27. METACORE – ‘Pathway Maps’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). As setas evidenciam tanto vias já bem estudadas como “transcrição”, como vias inéditas (ex. Dano ao DNA e apoptose). __________________________________________________________________ 104 FIGURA 28. METACORE – Pathway Maps. Via da apoptose relacionada à fosforilação BAD. Encontrada em TR+T3. Apoptosis/Survival_BAD phosphorylation.. LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs. __________________________________________ 106 FIGURA 29. METACORE – Pathway Maps. Via de dano ao DNA com DSBs ligada à reparo por NHEJ. Encontrada em TR+T3, TR+T3, TR-T3. DNA damage_NHEJ/DSB; LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs. _______________________ 107 FIGURA 30. METACORE – Pathway Maps. Via de reparo de DNA ligada à proteínas BRCA1/BRCA2. Encontrada nas 4 amostras analisadas. Brca1/Brca2 DNA Repair. LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs. _______________________________ 108
FIGURA 31. METACORE – ‘Disease Biomarker Networks’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). Sem T3 – Laranja, Com T3 – Azul. _____________________________________________ 109 FIGURA 32. Diagrama de Venn comparando peptídeos/presas encontrados en nossos screenings versus peptídeos encontrados em screening feito por PRIVALSKY (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014). ___________________________________________________________________________ 111 FIGURA 33. GENECODIS – ‘GoSlim’ Processes – Dados de IP+y2h. Os números representam a quantidade de presas/peptídeos por anotação. __________________________________________ 113 FIGURA 34. GENECODIS – ‘GoSlim’ Processes – Dados de Privalsky (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014). As proteínas encontradas em TR estão incluídas na lista do TR por isso realizamos apenas uma análise. Os números representam a quantidade de presas/peptídeos por anotação. ________ 114 FIGURA 35. Co-Imunoprecipitação flag-TR e RXR. O input é uma alíquota do extrato proteico (lisado) da célula 293T, e indica a presença de RXR. O controle negativo (-ctrl) é o extrato proteico de 293T sem superexpressão de flag-TRs, imunoprecipitado em resina anti-flag. Parte da membrana foi incubada com anti-RXR e parte com anti-flag. Na primeira parte vemos bandas de RXR nas 4 amostras, e não observamos quantidades significativas de RXR no controle negativo, mostrando que existe RXR interagindo com ambos TRs na presença ou ausência de T3. Na segunda parte da membrana observamos alíquotas das amostras de IP anti-flag. Escolhemos apenas 2 das 4 amostras pra análise em WB. A IP das 4 amostras juntas já foi apresentada na FIGURA 21. ______________ 116 FIGURA 36. Co-IP de EBP1. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui EBP1 (ou PA2G4, Abcam #33613) interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, não houve imunoprecipitação inespecífica visto que não existem bandas no controle negativo. _________________________________________________ 117 FIGURA 37. Co-IP de SRPK1. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui SRPK1 (BD #611072), interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, não houve imunoprecipitação inespecífica visto que não existem bandas no controle negativo. _________________________________________________________________ 118 FIGURA 38. Co-IP de CKII. Extratos proteicos de células 293T com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. As bandas de CKII alpha (Cell signaling, #2656) observadas sugerem que esta proteína interage com as diferentes isoformas de TR, na ausência de T3. Observamos também que para essas proteínas, houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso, testamos um controle negativo diferente: Extrato de 293T superexpressando TRs, imuprecipitado por resina de proteína A/G agarose conjugadas a normal IgG. _____________ 119 FIGURA 39. Co-IP de ERK3 com TR. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui ERK3 (ou MAPK6, cell signaling #4067), interagindo com TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso a co-IP precisa ser otimizada. _______________________________ 121 FIGURA 40. Co-IP de PRMT5. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui PRMT5 (Millipore #07-405) interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso a co-IP precisa ser otimizada. _______________________________ 122 FIGURA 41. Esquema mostrando uma estrutura conhecida de PDI (baseada na PDI de levedura) composta pelos a-b-b′-x-a′-c, as quatro cisteínas redox (esferas cinzas) e o dominio C-terminal com a sequencia KDEL. Retirada de (LAURINDO; PESCATORE; DE CASTRO FERNANDES, 2012). _________ 127 FIGURA 42. Interação TR e PDI encontrada na IP-LC/MS/MS de TR sem T3, encontrada e confirmada em y2h de TR. A. Rede de interações de TR alpha sem T3, anotada e criada pela plataforma IIS, visualizada no Software Cytoscape (organic layout). Em azul, proteínas encontradas na IP consideradas inéditas; em verde, proteínas do banco de dados de interação do TR alpha, interações já
descritas na literatura. Em destaque abaixo da rede, as interações já descritas encontradas pela LC-MS/MS, aumentam a confiabilidade do método. E em destaque na parte superior, a P4HB (ou PDI); B. Ensaio de confirmação de y2h. 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + P4HB (controle negativo); 4 a 6, triplicata de pBTM-TR beta + P4HB. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina; Quadrante azul: teste da beta-galactosidase. ___________________________________ 130 FIGURA 43. Co-imunoprecipitação de TR e PDI. A. Extratos de 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3) foram imunoprecipitados com resina A/G agarose conjugada a anti-P4HB (anticorpo #MAB4236, R&D Systems). Input corresponde ao extrato de 293T com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3), antes da IP. WB anti-flag mostra TRs nas amostras nas quais PDI foi imunoprecipitada. Os gráficos ao lado da figura mostram a quantificação das bandas pelo software Li-Cor. Os números de intensidade são dados pelo software e calculamos usando o controle como intensidade basal (=1); B. Extratos de 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T sem T3, antes da IP. _____________________________________ 131 FIGURA 44. Purificação por afinidade a His-tag das proteínas em resina de cobalto. SDS-PAGE 12% acrilamida mostrando o TRFULL (A) de 47 kDa, a PDI (B) de 57 kDa e TRDL (C) de 42kDa. MW=
marcador molecular; E1-E6 são as eluições da purificação. O destaque em vermelho mostra o tamanho das bandas da proteínas purificada. ___________________________________________ 133 FIGURA 45. Purificação por gel filtração (GF, exclusão por tamanho molecular, em coluna Superdex 200 16/60) de TRs e PDI. MW= marcador molecular. A. Perfis da Gel filtração em coluna Superdex 200 16/60 de TRFULL, TRDL e PDI; B. TRFULL – SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de
eluição retiradas da Gel filtração; C. TRDL – SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de
eluição retiradas da Gel filtração; D. PDIFULL - SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de
eluição retiradas da Gel filtração. _____________________________________________________ 135 FIGURA 46. Gel Filtração analítica do complexo em Coluna Superdex 200 10/300. A. Perfil da gel filtração analítica na qual observamos o pico de eluição do complexo. B. SDS-PAGE 12% com frações da PDI ___________________________________________________________________________ 136 FIGURA 47. Medidas de DLS das proteínas sozinhas e em complexo (TR:PDI). A Tabela ao lado indica os valores dos Rh encontrados. _______________________________________________________ 138
FIGURA 48. Espectros de Dicroísmo Circular (CD) das proteínas: PDI em preto, TRβ-AB em vermelho e do complexo TRβ-AB:PDI em azul. ___________________________________________________ 140 FIGURA 49. Curvas de desnaturação térmica monitorando o sinal de CD em 208nm: A. TRβ-AB; B. PDI; C. TRβ-AB:PDI, na qual observamos 2 platôs indicados pelas setas. _____________________ 141 FIGURA 50. Thermal-Shift Assays das proteínas sozinhas e em complexo. A. Curvas médias da desnaturação de TR, TR, PDI, TR:PDI e TR:PDI, sem T3. B. Curvas médias da desnaturação de TR, TR, PDI , TR:PDI e TR:PDI, com T3. O perfil de desnaturação de PDI sozinha e em complexo com TRs possui 2 duas temperaturas de melting (Tm) diferentes. ____________________________ 143
FIGURA 51. Curvas de Anisotropia de Fluorescência da formação do complexo TR-PDI com e sem T3. A. Curva de anisotropia de TR DL com e sem T3, titulado em PDI marcada com FITC. A tabela mostra o constante de dissociação (Kd) médio encontrado.; B. Curva de anisotropia de PDI titulada em TR marcado com FITC, na presença e ausência de T3. A tabela mostra o constante de dissociação (Kd) médio encontrado. As curvas são a representação média da triplicata experimental. ___________ 145 FIGURA 52. Gene Repórter Luciferase – Ensaios de Transativação em células Hek 293T. Plasmídeos com o gene TRα ou TRβ, PDI e elementos responsivos (HREs) para TR, F2-Luc ou AP1-Luc, foram transfectados em células 293T (com ou sem 1μM T3). Após 36h a atividade da luciferase foi medida. Todos os valores de ativação foram normalizados pela condição controle (pBlue), portanto todo sinal de RNs endógenos foi descontado. A. TRα e PDI em F2-Luc. A condição TRα+T3:PDI mostra PDI aumentando a transcrição em 3 vezes (TRα+T3 vs.TRα+T3:PDI); B. TRα e PDI em AP1-Luc, elemento de resposta negativo. Aqui a presença de PDI parece não alterar a transcrição. Nenhuma diferença significativa foi observada; C. TRβ e PDI em F2-Luc. Como mostrado para a isoforma TRα, PDI aumenta em 2.5 vezes a transcrição, se compararmos TRβ+T3 vs.TRβ+T3:PDI; D. TRβ e PDI em AP1-Luc, elemento de resposta negativo. Aqui a presença de PDI promove desrepressão da transcrição, na condição sem T3, diferentemente do que acontece com a isoforma TRα. (*, P <0.05). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni. ____________________________________________________________________ 147
FIGURA 53. Anisotropia de Fluorescência de TR alpha+T3 com e sem PDI titulado em peptídeo coativador SRC1 marcado. Representação média das triplicatas. A tabela mostra o coeficiente de dissociação (Kd) médio encontrado. ___________________________________________________ 149 FIGURA 54. Knockdown de PDI em linhagem celular Hep-TR com e sem T3. A. Western blot anti-P4HB e anti-beta actina. Linhagens Hep-TR e Hep-TR foram transfectadas com siRNA controle e P4HB siRNA. Após duas transfecções consecutivas seguidas de novos plaqueamentos, aguardamos 72h para coletar e lisar as células para avaliar a presença de PDI por WB. O knockdown se mostrou muito efetivo em nível proteico. Não observamos bandas de PDI nas amostras que sofreram o knockdown. Para as amostras tratadas com T3, adicionamos o hormônio 12h antes da coleta; B. Gráfico mostra a quantificação das bandas de WB de PDI em relação à beta-actina. Essa quantificação foi feita usando como base o WB das células Hep-TRs sem T3. ___________________________________________ 151 FIGURA 55. Knockdown de PDI seguido de qPCR em Células Hep-TR (Hep-G2 transduzidas com TR ou TR). A. Gene Hif2a. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI parece reprimir a transcrição do gene quando presente. Isso acontece em ambas isoformas de TR; B. Gene Myh6. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI atua de forma similar à Hif2a, reprimindo a transcrição do gene para ambas isoformas de TR; C. Gene Furin. O knockdown da PDI não afeta de forma significativa a expressão deste gene. (*, P <0.05), Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes ). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni. ___________________________________________________ 153 FIGURA 56. Docking TR:PDI. A. Modelo de PDI humana com os quatro domínio a, b, b’, e a’, mostrando em vermelho as cisteínas catalíticas. B. Modelo I de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (verde). Em azul está indicado parte do hinge do TR, fazendo contato direto com o domínio b’ da PDI. C. Modelo II de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (verde). Em vermelho, as cisteínas do domínio a da PDI fazendo contato com a cisteína das hélices H3 e H4 do TR. D. Modelo II de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (amarelo). Em vermelho, as cisteínas do domínio a da PDI fazendo contato com as cisteínas das hélices H3 e H4 do TR. D. Aproximação do ponto de contato entre PDI (cinza) e TRLBD (amarelo). O modelo II de docking mostra as cisteínas 53 e 56 (vemelho) do domínio a de PDI próximas das cisteínas 294 e 298 (vemelho) de TR. ______________________________________________ 156
Lista de Tabelas
Tabela 1. Lista de clones utilizados. ____________________________________________________ 39 Tabela 2. Lista de primers e enzimas utilizados. (F)= Forward; (R)= Reverse; Núcleotídeos em itálico = sítio da enzima de restrição. __________________________________________________________ 39 Tabela 3. Lista de transformações usadas no teste de auto-ativação. _________________________ 44 Tabela 4. Lista de primers utilizados no qPCR _____________________________________________ 63 Tabela 5. Proteínas utilizadas no projeto e seus respectivos coeficientes de extinção molar e massa em kDa. _____________________________________________________________________________ 66 Tabela 6. Número de colônias encontradas para cada isca em cada dia de crescimento. __________ 80 Tabela 7. Presas encontradas no screening para cada isoforma de TR. As siglas representam os GENE SYMBOLS (UniprotKB). _______________________________________________________________ 81 Tabela 8. Duplo-híbrido em números ___________________________________________________ 84 Tabela 9. Número de proteínas encontradas na IP-LC-MS/MS dos TRs. ________________________ 95 Tabela 10. Construções das proteínas utilizadas no projeto. ________________________________ 133 Tabela 11. Raios hidrodinâmicos calculados através de Purificação por Exclusão Molecular e GF Analítica. ________________________________________________________________________ 137 Tabela 12. Raios calculados à partir da GF e DLS. ________________________________________ 139 Tabela 13. Os resultados da deconvolução dos espectros no programa DichroWeb (ANDRADE et al., 1993; MERELO et al., 1994). _________________________________________________________ 140 Tabela 14. Temperaturas de melting (Tm) calculadas a partir das curvas de desnaturação térmica
obtidas no CD (FIGURA 53). __________________________________________________________ 142 Tabela 15. Temperaturas de melting (Tm) encontradas no Thermal-shift ______________________ 143
Tabela 16. Porcentagem de knockdown do gene P4HB em linhagens Hep-TR. __________________ 151 Tabela 17. Genes regulados por TR+T3 utilizados no qPCR e sua respectivas funções segundo GeneCards (SAFRAN et al., 2010; SAFRAN; SOLOMON, 2002). ______________________________ 152 Tabela 18. Genes e elementos responsivos regulados por TR e um resumo da ação do complexo PDI-TR nestes mesmos promotores __________________________________________________________ 158
Lista de Abreviaturas e Siglas
AF-1 – Activation Function-1; Função de Ativação-1. AF-2 – Activation Function-2; Função de Ativação-2. CD - Dicroísmo Circular.Co-IP - Co-Imunoprecipitação. CoA – Coativador Transcricional. CoR – Correpressor Transcricional.
DBD – DNA-binding Domain; Domínio de Ligação ao DNA. DLS – Espalhamento de Luz Dinâmico.
DSB – Quebra de Dupla-fita. ERE – Elemento Responsivo ao ER. GF – Cromatografia de Gel Filtração. GH – Hormônio de Crescimento.
HREs – Hormone Response Elements; Elementos Responsivos a Hormônios. IMAC – Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados. IP – Imunoprecipitação.
Kd – Coeficiente de Dissociação.
LBD – Lingand-binding Domain; Domínio de Ligação ao Ligante. LBP – Ligand Binding Pocket; Bolsão de Ligação ao Ligante.
LC-MS/MS - Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas. MW – Marcador de Peso Molecular.
NHEJ – Junção de Extremidades não-Homólogas.
NLS – Nuclear Localization Signal; Sinal de Localização Nuclear. PCR – Reação em Cadeia da Polimerase.
PDB – Protein Data Bank.
Proteína AP-1 – Proteína Ativadora-1.
Proteína BRCA – Proteína de susceptibilidade ao cancer de mama. Proteína ER – Receptor de Estrógeno.
Proteína GFP – Proteína Verde Fluorescente. Proteína GR – Receptor de Glicocorticóides.
Proteína GRIP – Proteína Interactora do Receptor de Glutamato. Proteína HAT – Histona Acetil-Transferase.
Proteína HDAC – Histona Deacetilase. Proteína HSP – Proteínas do Choque-Térmico.
Proteína N-CoR – Correpressor de Receptores Nucleares. Proteína PDI – Proteína Dissulfeto Isomerase.
Proteína PPAR – Receptor Ativador da Proliferação de Peroxissomos. Proteína PR – Receptor de Progesterona.
Proteína RAR – Receptor de Ácido Retinóide. Proteína Ref-1 – Fator (de Transcrição) Redox-1. Proteína RXR – Receptor X Retinóide.
Proteína SMRT – Mediador de Silenciamento dos Receptores Retinóides e Receptors de Hormônios Tireoidianos.
Proteína SRC – Coativador de Receptores de Esteróides. Proteína TR – Receptor de Hormônios Tireoidianos. Proteína TRBP – Proteína Ligante de TR.
qPCR – PCR quantitativo em Tempo Real. RN – Receptor Nuclear.
SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio. T3 – Triiodotironina; 3,5,3’-triiodo-L-tironina.
T4 – Tiroxina; 3,5,3’,5’-tetraiodo-L-tironina. TEBP – Top Enriched Biological Process. TH – Hormônios Tireoidianos (T3 e T4). Tm – Temperatura de Melting.
TRE – Elemento Responsivo ao TR.
TRH – Hormônio Estimulador da Tireotropina. TSH – Hormônio Estimulante da Tireóide. WB – Western Blotting.
Sumário
Capítulo 1. Introdução e Justificativa 19 1.1 Receptores Nucleares – Características Gerais e Domínios 20
1.2 Mecanismo de Ação 24
1.3 Os Receptores de Hormônios Tireoidianos - TRs 28
1.4 Justificativa 36
1.5. Objetivos 37
Capítulo 2. Material e Métodos 38 2.1. Clones utilizados e subclonagens 39 2.2 Duplo-híbrido em Levedura (y2h) 40 2.3 Cultura de Células de Mamífero 49 2.4 Transfecção e expressão em células de mamífero 51 2.5 Imunoprecipitação (IP) em 293T 54 2.6 Análise dos dados de IP-LC-MS/MS 56 2.7 Análise dos dados de IP+y2h 58 2.8 Análise da Regulação da Transcrição 61 2.9 Expressão e Purificação de Proteínas 64 2.10 Caracterização Biofísica das proteínas e complexos 67 2.11 Afinidade e termo-estabilidade do complexo 69 2.12 Estudos estruturais do complexo in silico 72 Capítulo 3. Screening de novas interações entre TRs e outras proteínas 74
3.1 Introdução 75
3.2 Subclonagens 76
3.3 Duplo-Híbrido em Levedura (y2h) 78 3.4 Imunoprecipitação de flag-TR seguida de LC-MS/MS 91 3.5 MetaCore (Thomson Reuters®) 103 3.6 Comparação com dados da Literatura 110
3.7 Genecodis 112
3.7 Co-imunoprecipitação (Co-IP) de TR com proteínas de Ciclo Celular 115 3.7.1 RXR – controle positivo 115 3.7.2 Proteínas do ‘Ciclo Celular’ 117 3.8 Discussão e Conclusão dos Screenings 122 Capítulo 4. A interação inédita entre TR e PDI 126
4.1 Introdução 127
4.2 Co-IP de TR e PDI em 293T 130 4.3 Expressão e Purificação das proteínas 132
4.4 Caracterização Biofísica 135
4.5 Estudos da Interação TR:PDI 144 4.6 Discussão e Conclusões sobre a regulação de genes por TR e PDI 157 Capítulo 5. Conclusões e Perspectivas 161
5.1 Conclusões 162
5.2 Perspectivas 164
Capítulo 6. Elementos Pós-textuais 165
6.1 Referências 166
6.2 Termo de aprovação da pesquisa pela Comissão de Bioética e/ou Biossegurança 175 6.3 Declaração de que a dissertação ou tese não infringe os dispositivos da lei nº
1.1 Receptores Nucleares – Características Gerais e Domínios
As diferentes células que compõe um organismo multicelular executam diversas funções nesses organismos, mas para que isso ocorra corretamente, se faz necessário um sistema de comunicação intra e intercelular organizado. Esse sistema é responsável pela organização de diversos eventos como a embriogênese e a manutenção de propriedades e funções fisiológicas. Tudo isso constitui a rede complexa de sinalização celular existente nos metazoários. Os sinais, representados por diversas moléculas como proteínas, peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, esteróides, retinóides, derivados de ácidos graxos e gases, se ligam à macromoléculas específicas chamadas receptores, desencadeando eventos de resposta (LAUDET, VINCENT; GRONEMEYER, 2001; YEN, 2001).
Essa sinalização abrange desde a detecção dos sinais, enviados a moléculas receptoras, até a conversão (transdução) destes sinais em respostas moleculares, uma propriedade universal das células vivas (NELSON; COX, 2008). Neste contexto, os Receptores Nucleares (RNs), ou receptores de resposta rápida, são proteínas ativas na presença de moléculas pequenas e hidrofóbicas, as quais podem ser hormônios estereoidais, vitaminas ou intermediários metabólicos; que após penetrarem na célula-alvo, chegam ao núcleo para iniciar a resposta celular.
Sendo assim, os RNs estão envolvidos em muitas das funções fisiológicas de um organismo regulando o desenvolvimento, inflamação, homeostase, metabolismo, divisão e diferenciação celular (GIGUÈRE, 1999; SCHWABE; TEICHMANN, 2004), sendo considerados importantes alvos para o tratamento de doenças, pois estão intimamente relacionados com diversas patologias metabólicas e vários tipos de câncer. Além disso, os ligantes desses receptores (glicocorticóides, estrógenos, vitamina D, antiandrogênios, retinóides, tiroxina, etc.) constituem a classe de fármacos mais procurada e estudada atualmente pois servem de modelo para o desenvolvimento de novos medicamentos (CHEN, 2008).
Até o momento, foram encontrados 65 RNs em todo o reino animal, desde os nematódeos até o homem. Esses RNs constituem uma superfamília de fatores de transcrição com uma estrutura molecular em comum, composta de 5 a 6 domínios bem conservados e responsáveis por funções específicas (FIGURA 1). A classificação
desses RNs é feita de acordo com a homologia encontrada entre os membros da família, ou seja, pelos domínios mais conservados, C (Domínio de Ligação ao DNA – DBD) e E (Domínio de Ligação ao Ligante – LBD) (FIGURA 1).
FIGURA 1. Ilustração esquemática da organização estrutural e funcional dos receptores nucleares. As regiões mais bem conservadas C e E estão representadas por um retângulo cinza, e as barras coloridas são as regiões divergentes A/B, D e F. AF-1 e AF-2 representam os domínios de ativação da transcrição (Activation Function, AF).
Foi proposto que os RNs evoluíram por uma diversificação precoce de um receptor órfão ancestral sem ligante conhecido, o qual só mais tarde adquiriu a ligação ao ligante. Esse conceito é bem aceito juntamente com a hipótese de que alguns receptores órfãos funcionam exclusivamente como repressores constitutivos ou ativadores de transcrição. Um exemplo é o repressor constitutivo Rev-Erb, capaz de recrutar correpressores ou ativadores mesmo sem a presença de um ligante (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).
Na região N-terminal ou A/B (FIGURA 1) se encontra a região AF-1 (Activation Function-1), que atua como ativadora constitutiva da transcrição (ARANDA; PASCUAL, 2001). A comparação da região A/B de subfamílias diferentes demonstra que esta é a região mais fracamente conservada entre os RNs. Seu tamanho pode variar de 23 (Receptor da vitamina D) a 550 aminoácidos (Receptor de Glicocorticóides). A nomenclatura dupla A/B se deve ao fato de que a divisão entre as duas regiões não é sempre evidente. A principal função da AF-1 é conferir especificidade à célula, ao DNA e aos promotores (KRAICHELY; NAKAI; MACDONALD, 1999; REICHARDT et al., 1998). Além disso, a região N-terminal dos RNs pode sofrer modificações pós-traducionais como fosforilação, que aumenta a probabilidade de transativação da AF-1, assim como a sinergia e cooperatividade do AF-1 com o AF-2 (REICHARDT et al., 1998; SHAO; LAZAR, 1999).
A região C abriga o domínio de ligação ao DNA (DBD) e é responsável pelo reconhecimento de sequências específicas de DNA (HREs, Elementos Responsivos a Hormônios) (FIGURA 1). Além disso, o DBD é composto por dois motivos em dedos
de zinco; sendo que em cada um deles 4 resíduos de cisteína fazem interação com um íon de Zn2+. Além disso, possui 4 sub-regiões, P-, D-, T- e A- boxes, as quais foram
caracterizadas por definir ou contribuir diretamente em diversos fatores como: (1) na especificidade aos elementos responsivos; (2) na formação de uma interface de dimerização entre os DBDs e (3) no contato com o esqueleto do DNA (CHAMBON, 1996; LAUDET; GRONEMEYER, 2002). A seletividade de reconhecimento dos HREs e as propriedades de dimerização e estruturas tridimensionais deste domínio já foram bem estudadas e muitas se encontram depositadas no Protein Data Bank (PDB) (BERMAN; HENRICK; NAKAMURA, 2003).
Já a região D é menos conservada que as regiões que a cercam (C e E) e funciona como uma “dobradiça” (hinge) que permite que os domínios de ligação ao ligante e ao DNA adotem diversas conformações. Esta região também contém um sinal de localização nuclear (NLS) ou pelo menos uma parte funcional dele (CHEN et al., 1994).
A região E, que engloba o domínio de ligação ao ligante (LBD) e o AF-2, é uma das regiões mais bem estruturadas e possui diversas funções reguladas pela ligação de moléculas lipofílicas. Entre elas estão a liberação do receptor do complexo de proteínas de choque térmico, translocação para o núcleo, homo ou heterodimerização, recrutamento de correguladores e ativação da transcrição de genes-alvo (ARANDA; PASCUAL, 2001). Sua associação com proteínas correguladoras, como correpressores (HEERY et al., 1997; HÖRLEIN et al., 1995) e coativadores (FENG et al., 1998; RIBEIRO; KUSHNER; BAXTER, 1995), são respectivamente essenciais para repressão e ativação de genes pelos receptores. A função ativadora dependente de ligante, AF-2, presente nesta região é a responsável pelo recrutamento de coativadores, embora às vezes, possa ter função repressora. As primeiras estruturas tridimensionais de LBDs de RNs foram: Receptor X Retinóide
(RXR; sem ligante), Receptor de Ácido Retinóico (RAR; com ligante) e Receptor de Hormônios Tireoidianos (TR; com ligante), estas e outras estruturas revelaram que é no LBD que agem os agonistas e antagonistas, ativando ou reprimindo a transcrição (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).
Por último, temos a região F, presente na posição C-terminal de apenas alguns receptores como o Receptor de Progesterona (PR), Receptor de Estrógeno
(ER), e RXR. Esta região é um domínio pouco conservado com tamanho variável e função desconhecida. Porém estudos mostram que a região F possa ter um papel no recrutamento de coativadores pela região E, além de determinar a especificidade do coativador com o LBD (ARANDA; PASCUAL, 2001).
Após a resolução de várias estruturas cristalográficas de domínios LBD dos RNs, observou-se um enovelamento comum entre eles, devido ao alinhamento e sequência dos aminoácidos. Esse enovelamento padrão consiste em um sanduíche de 3 camadas de -hélices, além de um “-hairpin” e diversas alças de tamanhos variados. As hélices são numeradas de 1 a 12, sendo que a primeira está na região N-terminal, e juntamente com H3, H5, H6 e H11, forma uma cavidade hidrofóbica que acomoda os ligantes hidrofóbicos (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).
As estruturas cristalográficas da região E na forma apo e holo (sem e com ligantes) são muito distintas, o que indica que existe uma grande mudança conformacional após a acomodação do ligante. Esse mecanismo foi descrito como ‘ratoeira’ (mouse-trap) (FIGURA 2): a hélice H11 é empurrada pelo ligante, e reposicionada em continuidade com a H10; então, o balanço da hélice H12 libera o ômega-loop, que gira abaixo da H6, trazendo consigo a região N-terminal da H3; na posição final, a H12 sela a “tampa” do bolsão de ligação ao ligante, criando um ambiente hidrofóbico para estabilizar a ligação, podendo até fazer contatos adicionais com o próprio ligante (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).
FIGURA 2. Esquema dos três estados conformacionais do LBD dos RNs. (a) Forma apo (sem ligante) do RXR LBD. (b) Forma holo - ligante agonista - do LBD do RAR. (c) Forma holo – ligante antagonista – do LBD do RAR. A superfície de dimerização está mostrada em verde, os sítios de ligação a correpressores e coativadores está em laranja, e a hélice H12 que contém a AF-2 está em vermelho. LBP – Bolsão de ligação ao ligante (BOURGUET; GERMAIN; GRONEMEYER, 2000).
Estudos apontam que os receptores nucleares são capazes de formar homodímeros (como os Receptores de Hormônios Esteróides), ou seja, um complexo com dois RNs iguais. Outros RNs formam heterodímeros com o RXR, como RAR-RXR, TR-RXR, VDR-RXR (Receptor da Vitamina D-RXR), PPAR-RXR (Receptor Ativador da Proliferação de Peroxissomos-RXR) (BOURGUET et al., 1995; LAUDET; GRONEMEYER, 2002). Segundo os mesmos autores, a ligação de um ligante pode afetar as propriedades de dimerização dos RNs in vitro. Para os TRs e para o VDR, os quais formam tanto homodímeros, quanto heterodímeros com o RXR, e a ligação do ligante parece favorecer a heterodimerização (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).
Posteriormente, foi demonstrada a existência de heterodímeros não-usuais (sem o RXR), que podem ser formados entre diferentes RNs, regulando a transcrição, e até mesmo com outras proteínas, em um mecanismo chamado cross-talk. Um exemplo é a heterodimerização dos receptores TR-PPAR e TR-ER, como uma forma adicional de regulação positiva e negativa da transcrição de determinados genes (LIU et al., 2007). A formação do complexo entre TR e a proteína GATA, é outro exemplo cross-talk presente na regulação do Hormônio Estimulante da Tireóide (TSH) (FIGUEIRA et al., 2010b). Estas formações não usuais de oligômeros levam, então, a uma regulação diferenciada da transcrição.
1.2 Mecanismo de Ação
Os RNs em sua forma apo podem ser encontrados tanto no citoplasma (subfamília dos receptores esteróides), quanto no núcleo celular (receptores da subfamília dos TRs). Quando ligados ao DNA, atuam reprimindo a transcrição dos genes-alvo (FIGURA 3), sendo que, nas duas subfamílias, os RNs estão ligados à proteínas correpressoras, como por exemplo os receptores esteróides que são usualmente encontrados ligados a proteínas de choque-térmico (HSP90, 80 e 70) (COUETTE et al., 1998) e os receptores da subfamília do TR, ligados a correpressores específicos como SMRT e N-CoR (PRIVALSKY, 2004).
FIGURA 3. Mecanismo de ação clássico dos RNs. Quando na forma apo (sem ligante), os RNs podem ser encontrados no citoplasma ou no núcleo ligados a correpressores e deacetilases de histonas. Esse estado reprime a transcrição do gene. Uma vez que o ligante chega e se liga ao RN (forma holo), muda sua conformação de forma a recrutar coativadores, acetilases de histona e toda a maquinaria da transcrição, ativando a expressão do gene [Figura adaptada de (ARANDA; PASCUAL, 2001)].
Os ligantes esteróides são hidrofóbicos e difundem livremente pela membrana plasmática até atingirem seus receptores no citoplasma. Já o hormônio triiodotironina (T3), por exemplo, necessita de transportadores como os NTCP (Polipeptídeo Co-transportador Sódio/Taurocolato), OATP1 (Transportador de ânions orgânicos 1), LAT (Transportador de Aminoácidos de tipo L) e TAT (Transportador de Aminoácidos de tipo T) e proteína MCT8 (FRIESEMA et al., 2005; NASCIMENTO, 2009).
Como descrito anteriormente (FIGURA 2), o ligante, ao encontrar o seu receptor, se adapta ao bolsão de ligação ao ligante (ligand binding pocket – LBP) e provoca uma mudança conformacional na proteína. A superfície hidrofóbica formadas pelas hélices H12, H3 e H4 e H5 (ou também chamada de AF-2) constitui o sítio de ancoragem das proteínas coativadoras (FIGURA 3). Apesar da alta similaridade de resíduos que formam essa região (WURTZ et al., 1996) o mecanismo de ativação dos RNs continua incompleto, já que foram identificadas estruturas cristalográficas de receptores em forma apo com a H12 em posição ativa e na forma holo com a H12 na posição inativa (FLAIG et al., 2005; NOLTE et al., 1998).
Apesar das variações encontradas, o mecanismo clássico de ativação continua com a chegada dos coativadores e o recrutamento da maquinaria de transcrição basal (FIGURA 3), incluindo a TBP (TATA box-binding protein) e o fator de transcrição IIB (TFIIB) (NASCIMENTO, 2009).
A família p160 – GRIP-1, TRBP-1 e SRC-1 contém exemplos de coativadores que se ligam aos RNs através do motivo LXXLL (RN-box, onde L é o aminoácido leucina e X é um aminoácido qualquer), repetido de 3 a 4 vezes em cada coativador. Os coativadores também formam complexos com outras proteínas como as histonas acetil-trasferases (HATs), que através do relaxamento e modificação da cromatina próxima à região promotora, recrutam outras moléculas para o local, as quais, estabilizam a ligação da RNA polimerase II (NASCIMENTO, 2009; WEBB et al., 2002).
Entretanto, quando os ligantes estão ausentes, os RNs recrutam correpressores inibindo a transcrição. Alien, N-CoR e SMRT, são correpressores que contém sequências hidrofóbicas conservadas (IDs, motivo L/IXXIIXXL, onde L é o aminoácido leucina, I é isoleucina e X é um aminoácido qualquer) por onde se ligam aos RNs. Essas sequências podem aparecer repetidas 3 vezes no N-CoR e 2 vezes no SMRT. Esses correpressores ligam-se à região hidrofóbica formada pelas hélices 3, 4 e 5 dos receptores. Além disso, os correpressores apresentam-se complexados com histonas deacetilases (HDACs), que condensam a cromatina nas regiões próximas aos promotores onde se ligam os RNs, impedindo a maquinaria transcricional de ser ativada (SANTOS; FAIRALL; SCHWABE, 2011).
Ainda existe uma gama de fatores, geralmente componentes de complexos transcricionais multiprotéicos, que coordenam a função dos RNs. Entre eles estão a família de proteínas associadas à arginina metiltransferase-1 (CARM); o complexo formado pelo fator de transcrição p160, coativador de receptor nuclear e coativador de receptor de esteróides (TIF/NCoA/SRC); a proteína E1A de ligação a proteína p300 (ou CBP); o fator associado a p300 (PCAF); e as histonas acetiltransferases (HATs) (SANTOS; FAIRALL; SCHWABE, 2011). Estas proteínas formam complexos estáveis em promotores responsivos, quando ancoradas no DNA. Pesquisas sobre outras proteínas que podem atuar nos modelos da regulação da transcrição através da ligação aos receptores têm aumentado continuamente desde então, com o objetivo de entender toda a complexidade existente nesse processo (DIAS, 2004).
Sendo estes RNs fatores de transcrição, eles se ligam no DNA a sequências promotoras específicas. Nestes promotores (FIGURA 4) encontram-se os HREs, elementos responsivos a hormônios, que são formados pelo motivo hexamérico 5’-PuGGTCA-3’ (Pu = A ou G). Estes podem estar separados por um número variável de
nucleotídeos e organizados em diversas orientações, como: repetições diretas (DR), palindrômicas (Pal) ou palindrômicas invertidas (IP) (LAUDET; GRONEMEYER, 2002) (FIGURA 4). As interações RN-DNA podem ocorrer com o receptor em seu estado monomérico, homodimérico, ou heterodimérico com o RXR, por exemplo (GLASS, 1994; WEBB et al., 2002).
FIGURA 4. Ligação do RNs nos HREs. As diversas orientações dos motivos hexaméricos: Pal (palíndromo) - para ligação de homodímeros; A/T (sequência rica em A/T+) - motivo hexamérico para a ligação de monômeros; e heterodímeros são formados tanto em Pal, quanto em DR (Repetição Direta) ou IP (palíndromo invertido) (ARANDA; PASCUAL, 2001).
Além da regulação direta da transcrição, existe também um mecanismo chamado regulação indireta. Nele, os RNs podem interagir com outros fatores de transcrição, bloqueando ou ativando a produção de diferentes proteínas, atuando em diversas rotas de sinalização celular. Os RNs podem agir nos mecanismos de transrepressão e transativação quando reprimem ou ativam a expressão de genes regulados por outros fatores de transcrição. Isso pode ocorrer através da competição por correguladores, ou pela ligação direta dos RNs com os outros fatores de transcrição. Este é o caso da interação entre o receptor de glicocorticóides (GR), ER, ou TR e a proteína ativadora 1 (AP-1); entre RAR e a proteína GATA-1; e da ligação entre outros RNs à proteína supressora de tumor p53 (CAELLES; GONZÁLEZ-SANCHO; MUÑOZ, 1997; DE BOSSCHER; VANDEN BERGHE; HAEGEMAN, 2001; MOLL; MARCHENKO; ZHANG, 2006; OGAWA et al., 2005; TSUZUKI et al., 2004; ZHOU; SHEN; SHEMSHEDINI, 1999).
Homodímeros Monômeros
