Análise da Regulação da Transcrição

Se tratando de RNs, experimentos que mostrem diferenças na regulação da transcrição de genes são imprescindíveis. Todos os experimentos foram conduzidos em cultura de células (293T ou Hep-TRs) transfectadas com diferentes construções de genes de interesse ou siRNA (no caso de knockdown). Estes ensaios foram usados para analisar se determinada construção, como flag-TR, responde ao hormônio e é capaz de ativar a transcrição; ou como a superexpressão de um parceiro de interação juntamente com TR, interfere na transcrição; ou ainda, como o knockdown de um parceiro de interação interfere na transcrição de genes regulados por TR+T3.

2.8.1 Ensaios de Transativação – Gene Repórter Luciferase

Neste experimento buscou-se detectar se as construções flag-RN, subclonadas em pLVIG, eram capazes de produzir proteínas que, na presença de T3, seriam capazes de ativar uma determinada região promotora da transcrição de Luciferase (gene repórter).

Para isso, sítios de ligação de TR (TREs: F2, DR-4 e AP-1) foram subclonados na região promotora do plasmídeo pGL, que contém o gene da Luciferase de vagalume (TRE-Luc). Quando co-transfectamos o flag-TR, pBlue (controle vazio), TRE- Luc e gene da Luciferase de Renilla (pRL, como controle da transcrição basal e para normalização de dados), obtemos uma certa quantia da enzima Luciferase expressa, a qual foi avaliada como descrito a seguir neste mesmo tópico.

O experimento foi realizado em células 293T plaqueadas em placas de 24 poços. Quando as células atingem a confluência ideal transfectamos os plasmídeos com Lipofectamina como descrito anteriormente, sendo que 1 M de T3 foi adicionado 4h após a transfecção e foram aguardadas 36h para a coleta das células. No controle experimental transfectamos 400 ng pBlue, 400 ng TRE-Luc e 400 ng pRL; e, nas condições experimentais, 400 ng flag-TR ou flag-TR, 400 ng TRE-Luc, 400 ng pRL, na presença e ausência de 1 M de T3.

Além disso, sabe-se que, quando TRs estão complexados com outras proteínas celulares, ocorrem alterações na transcrição do gene repórter em células de mamíferos. Neste caso, uma das proteínas que foi identificada nos experimentos de IP+y2h (PDI), foi subclonada e transfectada, juntamente com os receptores de estudo. Para realizar esse experimento, nos controles experimentais transfectamos 800 ng pBlue, 400 ng TRE-Luc e 400 ng pRL ou 400 ng PDI, 400 ng pBlue, 400 ng TRE- Luc e 400 ng pRL; e nas condições experimentais, 400 ng flag-TR ou flag-TR, 400 ng TRE-Luc, 400 ng pRL, na presença e ausência de PDI e/ou de 1 M T3.

O sistema de ensaio empregado foi o Dual-Luciferase Reporter (Promega). Neste sistema, as atividades das luciferases do vagalume e da Renilla foram sequencialmente avaliadas um luminômetro de placas (GloMax®-Multi Detection System). A primeira atividade medida é feita pela adição do Luciferase Assay Reagent II, contendo o substrato luciferina de vagalume. A forma reduzida da luciferina combina com ATP na presença de luciferase para formar um complexo luciferil- adenilato. Esse complexo, então, se decompõe para produzir a luciferina oxidada, gás carbônico e luz (comprimento de onda máximo de 560 nm). A quantidade de luz produzida nessa reação foi captada e quantificada pelo luminômetro. Após a medida deste sinal, a reação foi parada e a atividade da luciferase Renilla foi medida pela adição do reagente Stop&Glow (com o substrato luciferina de Renilla). Desta maneira, a atividade de luciferase de vagalume dirigida pelos elementos responsivos foi normalizada pela luciferase de Renilla, que representa a transfecção e expressão basal da célula. Foram feitos 3 experimentos independentes (n=3) para cada ensaio e os dados obtidos foram analisados no programa Prism (GraphPad) de acordo com o teste estatístico one-way ANOVA seguido de pós-teste Bonferroni.

2.8.2 Knockdown seguido de qPCR

Com o objetivo de estudar o efeito da interação entre TR e PDI (proteína encontrada nos ensaios de IP e y2h) realizamos ensaios de knockdown de PDI em linhagens Hep-TRs seguido de qPCR de genes regulados por TR+T3 de acordo com Lin e colaboradores (2013).

O protocolo para knockdown foi adaptado de Dharmacon-DharmaFECT (GE Healthcare Dharmacon), de quem adquirimos o kit para realização desse experimento. Escolhemos uma solução contendo diversos siRNA (chamado de pool) do gene P4HB que codifica a proteína PDI humana (ON-TARGETplus, Smart Pool, #L- 003690-00-0005). Além disso, recebemos um pool de siRNA para controle negativo (ON-TARGETplus Non-targeting Pool, #D-001810-10-05) e a solução de transfecção adequada para o tipo celular Hep-G2 (DharmaFECT 4 Transfection Reagent).

A linhagem HepG2-TR foi plaqueada a 1x105 _{células por poço em 2 placas de}

12 poços, uma usada para o qPCR e outra para WB. As células foram mantidas em DMEM completo.
No dia seguinte, o meio foi trocado por DMEM sem antibióticos. Em tubos separados diluímos em optiMEM o siRNA da PDI a 5 μM ou o siRNA do controle negativo a 5 μM (tubo A). Em outros tubos, diluímos o reagente de transfecção (tubo B). Após 5 minutos transferimos o conteúdo do tubo A para o B e incubamos por 20 minutos, a temperatura ambiente, antes de adicionar o mix nas células.

Após 48 horas de transfecção, as células foram coletadas para qPCR e após 72h, para WB.
As placas usadas para qPCR foram lavadas com PBS, as células foram lisadas e tiveram seu RNA coletado com o kit RNeasy Mini kit (QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante. Aproximadamente 1 μg de RNA foi usado para sintetizar cDNA de acordo com o manual do kit iScript cDNA Synthesis (BIO-RAD). Após diluir 10 vezes o cDNA obtido em água, as reações de qPCR foram montadas usando SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e o aparelho usado foi ABI 7900HT RT-PCR system (Applied Biosystems) com o programa default de RT-PCR de 2 passos, de acordo com instruções do fabricante. As curvas de amplificação foram avaliadas por analise de Ct comparativas. As sequências dos primers usados estão listadas na Tabela 4.


Tabela 4. Lista de primers utilizados no qPCR

Primer Sequencia PDI 1 F: CATCGTGAACTGGCTGAAGA R: CTCCACGTCCTTGAAGAAGC FURIN F: ACAACTATGGGACGCTGACC R: TGGACACAGCTCTTCTGGTG HIF2A F: CCACCAGCTTCACTCTCTCC

R: TCAGAAAAAGGCCACTGCTT MYH6 F: CCACCCAAGTTCGACAAGAT R: CACAGAAGAGGCCCGAGTAG ALP1 F: GTATGTGTGGAACCGCACTG R: CTGGTAAGCCACACCCTCAT PCK1 F: GGGAGAAGGAGGTGGAAGAC R: GAACACTTGCCCTCTCTTGC GAPDH F: ACCTGCCGCCTGGAGAAACC R: GACCATGAGGTCCACCACCCTG