Interactoma, análise e discussão do y2h

Analisamos primeiramente as presas encontradas e confirmadas por y2h. Os interactomas construídos no Cytoscape estão ilustrados a seguir (FIGURA 18). De acordo com as configurações default do software Cytoscape, todas as interações novas, ou não descritas pela literatura, aparecem em azul; e aquelas já descritas na literatura, aparecem em verde.

FIGURA 18. Interactoma dos parceiros de TR encontrados no duplo-híbrido (y2h), analisados pela plataforma IIS e visualizados no Cytoscape. Em verde, os parceiros já descritos na literatura como interactores de TR, e em azul os parceiros inéditos.

Foram encontrados 31 parceiros de interação para a isoforma , sendo que 28 desses parceiros são considerados inéditos (mostrados em azul na FIGURA 18). Já para o TR , foram encontradas 11 interações, sendo que 10 dessas interações, nunca foram descritas (em azul, FIGURA 18). Também observamos que a validade do método se concretiza pela presença de interações já descritas, como a proteína

NCOR, um correpressor bem estudado e bem conhecido do TR (ARAKI et al., 2005; SAFER et al., 1998; WANG et al., 2009). Além disso, o RN envolvido na heterodimerização do TR, o Receptor X-Retinóide (RXR), também foi encontrado (BERRODIN et al., 1992; BUGGE et al., 1992). Dentre esses parceiros já descritos, também encontramos o NCor 2 (ou SMRT) interagindo com o TR e o NCor 1 interagindo com a isoforma  (FIGURA 18).

Nossa hipótese para as diferenças de parceiros de interação encontrados para TR e  é que caso houvesse um cruzamento da dados das confirmações, ou seja, se os parceiros de TR fossem co-transformados com TR e vice versa, algumas interações seriam confirmadas para ambas isoformas, como é o caso do NCor 1 e 2, e dos RXRs. Além disso, no y2h é comum que algumas interações mais fracas possam ser ‘’perdidas’’ ao longo do caminho (como mostrado na Tabela 8), em detrimento das mais fortes e mais abundantes. Entretanto, não consideramos isso um problema, uma vez que encontramos um grande número parceiros de interação direta confirmados para ambas isoformas.

Descrição de alguns alvos encontrados para o TR

Além dessas proteínas, destacamos que, dentre os parceiros encontrados para o TR, 5 proteínas estão relacionadas a sinalização de estrógeno e câncer de mama (SGK3, PCYT2, CSNK1N1, CASP4, ATAD2). Os papéis de NRs na proliferação, diferenciação e apoptose suportam a ideia de sua importante participação em câncer e muitos estudos mostram a perda da expressão de NRs ou expressão exacerbada em células neoplásicas (CHUNG et al., 2006; KRISHNAN; PEEHL; FELDMAN, 2003; PENDÁS-FRANCO et al., 2008). Um desses estudos concentra-se no Receptor de Hormônios Tireoidianos (TR) e sua expressão no câncer (ALYUSUF et al., 2014; ARANDA et al., 2009; CHENG, 2003; CONDE et al., 2006). Embora as evidências de uma relação entre hormônios tireoidianos e desenvolvimento de câncer de mama são conhecidas desde 1896, alguns outros estudos in vivo e in vitro diferem substancialmente (ALYUSUF et al., 2014; CESTARI et al., 2009; DINDA; SANCHEZ; MOUDGIL, 2002; GLINSKII et al., 2009; GUIGON et al., 2011; PARK; ZHAO; CHENG, 2013; SAR et al., 2011; SARAIVA et al., 2005).

Dentre estes destaques, a SGK3 (ou C8orf44) é uma serina/treonina quinase que faz parte da família de quinases do soro e de glicocorticóides, esta família consiste de 3 isoformas, SGK-1, -2 e -3. Estas quinases são responsáveis por regular o crescimento, a sobrevivência e a migração celular, processos celulares que se apresentam desregulados no câncer. Além do mais, SGKs estão downstream da via de sinalização da PI3K e interagem em vários níveis com as quinases RAS/RAF/ERK, ambas sinalizações conhecidas por promover tumorigênese (BRUHN et al., 2010). Um trabalho de 2012 mostra que a expressão da SGK3 está ligada ao Receptor de Estrógeno (ER) tanto em linhagens de câncer de mama, quanto em amostra de tumores, e demonstra que existe uma correlação positiva entre a presença desta proteina e o prognóstico do tumor, principalmente, ER+ (XU et al., 2012).

O gene PCYT2, tem como produto a enzima CTP:fosfoetanolamina citidililtransferase (ECT), essencial participante da via Kennedy, via primária de síntese de fosfatidiletanolamina (PE) nas células de mamíferos. Alguns estudos sugerem que ECT e a via PE-Kennedy poderiam ser inibidas em vários tumores e células transformadas, inclusive em câncer de mama (BAKOVIC; FULLERTON; MICHEL, 2007; ZHU; JOHNSON; BAKOVIC, 2008). Em outro trabalho foi demonstrado que a grande síntese de DAG (Diacilglicerol) e alta atividade da taxa regulatória da enzima Pcyt2 são moduladores críticos da via PE-Kennedy. Dessa forma, Pcyt2, além de ser um gene ultrassensível ao microambiente nutricional, se mostra também um bom alvo para novas estratégias no contexto do tratamento do câncer (ZHU; BAKOVIC, 2012).

A CKI, produto do gene CSNK1a1, é chamada enzima caseína quinase 1. Componente da família das caseínas quinases (CKs) que, assim como a SGK3, também são serina/treonina quinases, divididas em em CK1 ou CK2, dependendo da sua homologia e domínios catalíticos. A CKI  faz parte da CK1 e em vertebrados existem 7 isoformas (, , 1, 2, 3,  e ). Muitos substratos são conhecidos como específicos da CKI e estão envolvidos em vias de sinalização oncogênicas com Wnt/

-Catenina, p53 e PI3K/AKT (SCHITTEK; SINNBERG, 2014). Um grupo, investigando a linhagem MCF-7 de câncer de mama e a resistência ao Tamoxifeno, também observou que as células apresentavam a via Wnt/-catenina aumentada assim como

a trancrição dos genes associados, como o Csnk1a1, Axin2, Myc, entre outros (ELYADA et al., 2011).

Caspases são cisteíno-proteases aspartato específicas, evolucionalmente conservadas envolvidas em eventos de sinalização. São muito conhecidas por executarem papéis na morte celular programada durante o desenvolvimento e a vida adulta. As caspases -1, -4, -5 e -12, estão supostamente envolvidas com inflamação. O gene CASP4, produz a proteína caspase-4, ainda pouco caracterizada em humanos (SOLLBERGER et al., 2012). Foi identificada, através de hibridização por Microarray, como um dos genes apoptóticos que são regulados pela curcumina (pigmento amarelo presente em rizomas de cúrcuma, conhecida por efeitos anti- tumorigênicos) na linhagem celular de câncer de mama, MCF-7, indicando que CASP4 pode ser um possível alvo no tratamento deste tipo de cancer (RAMACHANDRAN et al., 2005).

O ATAD2/ANCCA, AAA+ Corregulador Nuclear Associado ao Câncer, contém dois domínios AAA (ATPases Associadas com diversas Atividades celulares), identificado também como coativador de AR (Receptor de Andrógenos). Essa proteína regula diretamente protooncogenes como ACTR, AIB1, SRC-3 e é altamente expressa em câncer de próstata, além de regular genes como ciclina D1, c-Myc, e E2F1, que contribuem para proliferação celular (WAN et al., 2014). Também foi demonstrado que ATAD2 é comumente encontrado em muitos tumores e seus níveis de expressão se correlacionam com o resultado do sucesso do tratamento dos pacientes de câncer de mama. Autores sugerem que ATAD2 liga as vias de sinalização E2F e MYC e contribui para o desenvolvimento do câncer agressivo, através do aumento da transcrição dependente de MYC (CIRÓ et al., 2009). Ainda na área de câncer de mama ER+, outro grupo descobriu que a estimulação da proliferação por estrógeno de células de câncer envolve a regulação de proteínas chamadas kinesinas, superfamília de proteínas motoras (Kifs). ANCCA, tem um papel crucial na regulação da expressão das kinesinas pelo estrógeno (E2). O knockdown da ANCCA impediu a proliferação celular e induziu a apoptose tanto nas células resistentes quanto nas sensíveis ao tamoxifeno, demonstrando a importância deste gene para um possível tratamento desse tipo de câncer (ZOU et al., 2014).

_{Descrição de alguns alvos encontrados para o TR}

Dentre os parceiros do TR, encontramos NPM1, KIF3A, ASCC2, TIMM10B (ou FXC1) e TIMM8A. Estas são proteínas que merecem destaque devido as suas importantes funções em processos biológicos, como ciclo celular e translocação para mitocôndria, ou como correguladoras de outros RNs.

NPM1 é uma proteína que reside no núcleo (região granular do nucléolo) e está envolvida em duplicação de centrossomo, manutenção da integridade do genoma, biogênese de ribossomos, atividade chaperona regulada por fosforilação e no aumento da transcrição dependente de acetilação na cromatina (FREHLICK; EIRÍN-LÓPEZ; AUSIÓ, 2007; SWAMINATHAN et al., 2005). Foi demonstrado que NPM1 interage com o complexo APE1 (Ref-1/APE1), uma enzima de reparo de DNA e coativador transcricional, sendo uma proteína vital nos mamíferos. Essa interação resulta em uma regulação direta do crescimento celular através do controle da qualidade de RNA. Esse controle, por fim, afeta a expressão gênica através de mecanismos pós-transcricionais (VASCOTTO et al., 2009). Outro trabalho mostra NPM1 envolvida na tumorigênese de câncer de mama, através da interação com um complexo formado por BRCA2 e ROCK2. Esse complexo é responsável para manter a integridade numérica de centrossomos e uma divisão celular acurada (WANG et al., 2011).

Mais ainda, a proteína KIF3A, membro da família de proteínas motoras, que está envolvida no complexo de sinalização Hedgehog e regula o desenvolvimento precoce, ciliogênese e tumorigênese (HUANGFU et al., 2003). Foi demonstrado que KIF3a é capaz de promover a proliferação e invasão em células de câncer de próstata avançado, através da via de sinalização Wnt (LIU et al., 2014). Além disso, KIF3a se liga a KIF3b com a ajuda de KAP3, formando o complexo Quinesina-2, e a presença deste complexo foi demonstrada no aparato mitótico, principalmente nos microtúbulos do fuso e centrossomos (HARAGUCHI et al., 2006).

A proteína ASCC2, também chamada de Proteína Cointegradora de Ativação de Sinal (hASC-1), foi originalmente isolada como um coativador de RNs. ASC-1 tem um papel essencial na transativação de AP-1, SRF e NF-kB para mediar a transrepressão entre RNs e e essas proteínas in vivo (JUNG et al., 2002).

Foram encontradas também duas proteínas que fazem parte da mesma família de proteínas mitocondriais, as translocases de membrana interna a TIMM8A e TIMM10B (também chamada de FXC1). TIMM8a se liga à TIMM13 no espaço intermembranas mitocondriais para formar um complexo de 70 kDa, isso facilita a importação do substrato TIMM23, para essa localização. Além disso, a TIMM8A é uma proteína que parece ser necessária para o desenvolvimento neurológico (ROESCH et al., 2004; ROTHBAUER et al., 2001). Já a TIMM10B, é um componente do complexo TIM22 que media a importação e inserção de proteínas transmembranas na membrana interna da mitocôndria. Esse complexo é uma translocase de poros duplos que se utiliza da força do potencial de membrana para realizar suas funções. Em adição a isso, o complexo também funciona como ancora para o complexo de 70 kDa (TIMM8a e TIMM13) (MÜHLENBEIN et al., 2004). Como mencionado anteriormente, os TRs estão presentes e conseguem atuar dentro da mitocôndria de células cardíacas, se ligando à sequencias HRE no DNA mitocondrial (ARDAIL et al., 1993; MORRISH et al., 2006), apesar desta função e sublocalização celular serem pouco estudadas.

Importante mencionar que estas interações encontradas para TRα e TRβ sinalizam para funções adicionais destes receptores, além de desvendar novas vias que podem ser reguladas por estes receptores. Dessas 11 interações encontradas para isoforma , 3 se apresentam interagindo também com a isoforma , L1TD1, TIMM8a e COG2. Isso mostra que apesar de serem isoformas diferentes, conseguem interagir com as mesmas proteínas em alguns casos. Esse mesmo padrão de interação se repetiu no número de peptídeos encontrados na imunoprecipitação, como será discutido adiante.