Discussão e Conclusões sobre a regulação de genes por TR e PD

Após analise dos dados de qPCR e dados de transativação, observamos algumas diferenças em relação à regulação de genes. Principalmente com relação à ação da PDI nesses genes regulados por TR+T3.

Devido às diferenças encontradas entre o qPCR e os ensaios de transativação, resolvemos investigar sob quais promotores estavam regulados os genes escolhidos para o qPCR. No GeneCards, a partir do item ‘Genomics’, pesquisamos os sítios de ligação de outros fatores de transcrição nos promotores de cada gene (Tabela 18).

Tabela 18. Genes e elementos responsivos regulados por TR e um resumo da ação do complexo PDI-TR nestes mesmos promotores

O gene Furin, pode ser regulado por AP-1, um dos fatores de transcrição que sofrem regulação negativa pelo TR sem ligante (Tabela 18). Nossos dados de gene repórter mostram que TR sem ligante junto com PDI, aumentam a transcrição de Luciferase. Embora, por qPCR, não vemos o mesmo resultado para Furin, o qual não parece ser regulado por PDI. Uma hipótese que levantamos se baseia na ideia de que os promotores presentes na construção do plasmídeo de gene repórter e na linhagem celular ou in vivo, sejam diferentes. De forma que existem muitos outros elementos, além dos HREs, antes e depois da região promotora de um gene, que obviamente não são clonados nos vetores dos genes repórteres.

Para os genes Myh6 e Hif2a observamos que o knockdown de PDI provocou um aumento da transcrição do mRNA desses genes. Aumento que foi evidenciado quando na presença de T3. Este aumento de transcrição na ausência de PDI não corresponde aos resultados encontradas no experimento de transativação que realizamos. No entanto, a análise do efeito da PDI na transativação foi observada nos elementos responsivos AP-1 e F2, os quais não fazem parte dos elementos regulatórios para os genes Myh6 e Hif2a. Como outros elementos estão envolvidos, o comportamento da PDI na transcrição regulada por TR pode ser diferente da observada nos experimentos de transativação. Observamos também que um outro RN, o PPAR, pode regular o promotor de Myh6 e Hif2a (Tabela 18). Ou seja, pode

Furin Myh6 Hif2a A1 Luc F2 Luc

Principais Fatores de Transcrição Encontrados AP-1; c- Jun; ATF- 2; TBP; YY1; GATA-1 YY1; aMEF-2; HNF-42; HNF- 41; MEF-2A; MEF-2; PPAR; c-Et-1. PPAR2; PPAR1; Sp1; HEN1; HNF-1A; IRF- 1; HNF-1 X X Ação do complexo PDI e TR Não há diferença PDI reprime o gene PDI reprime o gene TR sem T3 e PDI aumentam a transcrição TR com T3 e PDI aumentam a Transcrição

haver um cross-talk entre TR e PPAR nesse promotor como já mostrado na literatura (ARAKI et al., 2005). Entretanto, não sabemos identificar e deduzir como PDI poderia estar contribuindo para esse cross-talk. Uma possível explicação para esse resultado é que Hif2a e Myh6 são regulados por promotores diferentes dos construídos nos ensaios de gene repórter. Uma vez que a presença de PDI reprime a transcrição (Myh6 e Hif2a) ao invés de aumentá-la (Luciferase em elemento F2), sugerimos então, que existam outros reguladores da transcrição atuando com ou através dos RNs nesse sítio.

Vale ressaltar que a PDI está envolvida com enovelamento oxidativo de proteínas (função chaperona) e também proporciona a sobrevivência e progresso de alguns tipos de câncer (XU; SANKAR; NEAMATI, 2014). Um artigo mostra que células de carcinoma hepatocelular (HCC) expressam PDI em situação de hipóxia (YU et al., 2012). Sabendo que a linhagem HepG2 é uma linhagem de carcinoma hepatocelular de fígado, podemos pensar então em um possível papel da PDI como reguladora da proliferação de células de câncer. E esta pode agir na regulação de genes como o Hif2a, através de TR. Além disso, a atuação da PDI na regulação da transcrição do gene Hif2a, que está envolvido na queda dos níveis de oxigênio celular, corrobora dados já publicados do envolvimento da PDI com hipóxia celular (HASHIMOTO; IMAOKA, 2013; LAURINDO; PESCATORE; DE CASTRO FERNANDES, 2012; XU; SANKAR; NEAMATI, 2014; YU et al., 2012).

Outros trabalhos mostram que, a PDI, além de estar envolvida em estresse oxidativo, pode estar relacionada à algumas patologias cardíacas (AMANSO; DEBBAS; LAURINDO, 2011). Nossos dados demonstram que a ausência de PDI permite um aumento na expressão do gene relacionado à miosina cardíaca de cadeia pesada (Myh6). Sugerimos que deve existir uma relação importante entre o balanço da presença de TR, PDI e a regulação do gene Myh6.

Além disso, foi demonstrado que a PDI possui dois sítios de ligação para o hormônio T3, sendo que um deles é o mesmo sítio de ligação para o estradiol. (PRIMM; GILBERT, 2001). Essa informação nos levou a sugerir a hipótese em que PDI poderia estar atuando como um reservatório de hormônios, e sua função seria então, transportar e entregar esses hormônios para os RNs como TR e ER. Entretanto, refutamos essa hipótese em duas análises: (1) a presença do T3 não

afetou a afinidade entre TR:PDI nos ensaios de anisotropia de fluorescência; (2) a regulação diferenciada de genes na presença e ausência de T3, identificada pelos ensaios de qPCR e gene repórter.

E mais importante ainda, o trabalho de Hashimoto & Imaoka (2013) (HASHIMOTO; IMAOKA, 2013) mostra que a superexpressão de PDI em células de tumor pituitário (GH3), suprime a expressão do gene do hormônio de crescimento que é estimulado por T3. Ou seja, assim como nossos dados apontam, a PDI consegue atuar através de TR para reprimir a expressão de genes. E mais, esta atuação está envolvida com a atividade dissulfeto oxidorredutase da PDI, na qual o mutante de PDI não apresentou função na regulação do gene, o que comprova que a atividade dissulfeto oxirredutase de PDI é essencial para a regulação de genes através de TR (HASHIMOTO; IMAOKA, 2013). Então, como a PDI hora aumenta a expressão, hora diminui a expressão de genes regulados por TR, o papel desta proteína em cada elemento responsivo precisa ser melhor estudado. Mas nossos experimentos indicam, e dados da literatura confirmam, que a presença ou ausência de PDI pode provocar alterações na expressão de genes regulados por TR.