Confirmação da presas encontradas – Co-transformação 1 a

Ao término das análises dos sequenciamentos, obtivemos um total de 55 possíveis parceiros de interação para o TR e 52 parceiros para o TR (Tabela 7). Em negrito evidenciamos os parceiros de interação de TR já bem descritos pela literatura: como o RXR, a proteína que forma heterodímeros com TR (BERRODIN et al., 1992; BUGGE et al., 1992); e N-CoR, proteína correpressora da transcrição que interage com TR (ARAKI et al., 2005; SAFER et al., 1998; WANG et al., 2009).

Tabela 7. Presas encontradas no screening para cada isoforma de TR. As siglas representam os GENE SYMBOLS (UniprotKB).

TR TR

ASB3 HMGB1 RPS6 ABCB8 LINC00269 RPL5 ATAD2 HSP90B1 RXRA ASCC2 LRPAP1 RPL8 C8orf44 L1TD1 RXRB ATP1B3 MRPL11 RPLP0 CASP4 LINC00596 SNRNP48 CCDC132 NAP1L1 RPS11 CCDC132 LTBR SRM CFL1 NCOR1 RPS16 CCT5 MESDC2 SRPK1 CLPX NCOR2 RPS4X CIB1 MRPL28 STAC COG2 NPM1 RXRA CNNM4 NCOR1 TAOK3 DGKZ P4HB SRSF3 CNTLN NCOR2 TBC1D9B DYNLT1 PCBP1 SYBU COG2 NUDCD1 TIMM8A EEF1A1P5 PISD TIMM8A COL4A2 PCYT2 TMPRSS3 ENO1 PLA2G16 TSC2 COPS5 PDHX UBA52 FTH1 PRDX1 UBA52 COPS7B PPM1G UBE2I FXC1 PRKAR1B UBE2I CSNK1A1 RAB20 USP34 GOLGA7 PSMB1 ZNF195 DDX5 RFXANK USP7 HIGD1A PSME1

FAM134B RNASEH2B VIM HSP90AA1 PTP4A2 FIP1L1 RPL9 ZFAND1 IRF2BP1 RPL23A

FTH1 RPS2 KIF3A RPL28

Com o objetivo de confirmar se as interações eram realmente verdadeiras, realizamos a co-transformação da isca com uma das presas em levedura. Após a análise dos resultados, obtivemos uma lista de interações confirmadas.

Para demonstrar os resultados dos testes de confirmação da interação, selecionamos apenas algumas das presas que foram confirmadas (4 de 31 presas para o TR, e 4 de 11 presas para o TR), embora o teste tenha sido feito com todas (FIGURAS 16 E 17). As figuras estão separadas para cada presa, em dois quadrantes, um preto e um azul. O primeiro (preto) representa fotos dos crescimentos das colônias em placas SD-WLH, e o segundo (azul), representa fotos do teste da - galactosidade.

FIGURA 16. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRASNFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado a triplicata 1-3, é o controle sem TR (espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal uma cor de colônia rosa claro, sem halos azuis) , e a triplicata 4-6, onde temos a confirmação da interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior em SD-WLH, e no tese da -gal uma colônia com halos azuis).

Para a isoforma TR ilustramos 4 das 31 interações (FIGURA 16), nas quais observamos tanto o crescimento (triplicatas 4 a 6) em placas SD-WLH (quadrante

preto), quanto a cor azul no teste da -gal (quadrante azul). Detacamos as proteínas NCor1; RXR ; TIMM8A, uma translocase mitocondrial; e CASP4, uma caspase.

FIGURA 17. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRANSFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado, a triplicata 1-3 é o controle sem TR (espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal, colônia rosa claro, sem halos azuis), a triplicata 4-6, confirma a interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior em SD-WLH, e no tese da -gal uma colônia com halos azuis).

Para a isoforma TR (FIGURA 17), ilustramos 4 das 11 interações confirmadas, nas quais observamos tanto o crescimento (triplicatas 4 a 6) em placas SD-WLH (quadrante preto), quanto a cor azul no teste da -gal (quadrante azul). Destacamos as proteínas P4HB, uma Dissulfeto Isomerase; L1TD1, fator de transcrição com Domínio Transposase Linha-1; NPM1, Nucleofosmina; NCor2.

O método de duplo-híbrido em levedura é considerado como uma ótima técnica para a busca de novas interações, uma vez que, ao chegarmos ao final das confirmações, as interações restantes são consideradas interações ‘diretas’, ou seja, interações fortes proteína-proteína (BRÜCKNER et al., 2009; CAUSIER, 2004; PARRISH; GULYAS; FINLEY, 2006). A partir do número inicial de aproximadamente 800 colônias (Tabela 6), encontramos 11 interações para o TR e 31 interações para o TR. Nessa seleção dos candidatos a parceiros de interação, cada etapa funciona como um filtro, eliminando as interações falso-positivas ou muito fracas (Tabela 8).

Por isso foi muito importante obter o maior número de colônias possível na primeira etapa do screening.

Tabela 8. Duplo-híbrido em números

TR  TR 

Screening com biblioteca de HeLa (Clontech) Screening com biblioteca de HeLa (Clontech)

Dias de crescimento em meio

sólido Colônias

Dias de crescimento em meio

sólido Colônias 3 143 3 180 4 191 4 261 5 132 5 186 total 466 total 627 Clones Clones

Colônias positivas na presença

de x-gal 384

Colônias positivas na presença

de x-gal 596

Crescimento em meio, extração de DNA em levedura, transformação em DH5α, miniprep de bactéria e sequenciamento

128

Crescimento em meio, extração de DNA em levedura, transformação em DH5α, miniprep de bactéria e sequenciamento 147 Número de proteínas encontradas 55 Número de proteínas encontradas 51

Confirmação da interação por co-transformação em

levedura

31

Confirmação da interação por co-transformação em

levedura

11