Knockdown de PDI seguido de qPCR

Com o objetivo de entender melhor o papel fisiológico do complexo PDI-TR, decidimos investigar por meio de qPCR as diferenças de expressão em genes regulados diretamente por TR+T3 na presença e ausência da PDI. Nosso grupo colaborador do Houston Methodist Research Institute, dirigido pelo Dr. Paul Webb, já havia pesquisado os diferentes genes regulados por TR na presença e ausência de T3 em um trabalho recente (LIN et al., 2013). Nesse trabalho, os autores mostram as diferenças na regulação de genes encontradas para as isoformas de TR. Ou seja, apesar de semelhantes em estrutura, as isoformas têm funções completamente distintas. Para isso, foram produzidas linhagens de Hep-G2 com expressão estável de TRα ou TRβ, em seguida, a expressão de genes regulados por T3 com a linhagem parental HepG2 foram comparadas.

A partir dos genes considerados como regulados por TR+T3, evidenciados no trabalho de LIN et al. (2013), selecionamos 5 genes. Usamos esses dados de regulação para observar se o knockdown da PDI afetaria a transcrição desses genes. Após os knockdowns de PDI nas linhagens Hep-TR, analisamos a expressão dessa proteína por WB (FIGURA 54) e por qPCR (Tabela 16).

FIGURA 54. Knockdown de PDI em linhagem celular Hep-TR com e sem T3. A. Western blot anti-P4HB e anti- beta actina. Linhagens Hep-TR e Hep-TR foram transfectadas com siRNA controle e P4HB siRNA. Após duas transfecções consecutivas seguidas de novos plaqueamentos, aguardamos 72h para coletar e lisar as células para avaliar a presença de PDI por WB. O knockdown se mostrou muito efetivo em nível proteico. Não observamos bandas de PDI nas amostras que sofreram o knockdown. Para as amostras tratadas com T3, adicionamos o hormônio 12h antes da coleta; B. Gráfico mostra a quantificação das bandas de WB de PDI em relação à beta-actina. Essa quantificação foi feita usando como base o WB das células Hep-TRs sem T3.

Tabela 16. Porcentagem de knockdown do gene P4HB em linhagens Hep-TR.

Linhagem Sem T3 Com T3

Hep-TR 99.76% 97.34%

Hep-TR 98.99% 99.41%

Após a análise por qPCR da PDI observamos um knockdown de mRNA de aproximadamente 97% para a linhagem Hep-TR+T3, e de 99% para as linhagens Hep-TR, Hep-TR+T3 e Hep-TR (Tabela 16). Já o knockdown de proteína foi confirmado por WB e quantificado por análise de densitometria das bandas (FIGURA 54-A). De acordo com o WB e quantificações, podemos observar um resultado próximo ao que poderia ser considerado knockout da proteína.

Seguimos então, para a análise por qPCR com primers para os seguintes genes: PCK1, ALP1, MYH6, FURIN e HIF2A. Estes genes foram escolhidos devido a alta regulação que sofrem pelo receptor TR com T3 (LIN et al., 2013). Primeiramente vamos apresentar aqui as funções e detalhes sobre cada gene escolhido para o experimento de qPCR (Tabela 17). Infelizmente para os genes PCK1 e ALP1 não obtivemos resultados satisfatórios nos controles experimentais, nos quais a presença de T3 deveria aumentar a expressão destes genes. Por isso, aqui

apresentamos os resultados apenas dos genes nos quais o hormônio T3 aumentou a transcrição, juntamente com PDI em concentrações endógenas normais (condição siRNA controle) (FIGURA 55).

Tabela 17. Genes regulados por TR+T3 utilizados no qPCR e sua respectivas funções segundo GeneCards (SAFRAN et al., 2010; SAFRAN; SOLOMON, 2002).

Gene Nome Função [GeneCards]

Myh6 Miosina cardíaca de cadeia pesada (Myosin Heavy

Chain 6 Cardiac Muscle α)

A proteína miosina do músculo cardíaco é um hexâmetro composto de 2 subunidades de cadeia pesada, 2 subunidades de cadeia leve e 2 subunidades regulatórias. Doenças associadas com MYH6 incluem: cardiomiopatias dilatadas myh6-relacionadas, e cardiomiopatias familiais hipertróficas myh6-relacionadas. Entre as vias relacionadas ao MYH6 temos a via RhoGDI e a PAK. As anotações para esta proteína segundo o GeneOntology, incluem proteína ligante de quinase e atividade ATPase.

Furin Furin O gene Furin codifica a formação de uma proteína membro da família de proteases que processam precursores de proteínas e peptídeos que trafegam através da via secretória da célula. A proteína produzida pelo Furin é uma protease tipo 1 ligada à membrana que é expressa em muitos tecidos como neuroendócrino, fígado, intestino e cérebro. O produto desse gene é um dos 7 membros específicos de aminoácidos básicos e é responsável por clivar substratos em resíduos simples ou pareados. Alguns desses substratos são o paratormônio, precursor do TGF-β, proalbumina, pro-β-secretase, matriz metaloproteínase tipo 1 de membrana, β subunidade do Fator de crescimento pro-nervo e fator vo Willebrand. Doenças associadas a esse gene incluem a influenza aviária e demência familiar tipo-britânica. Entre as vias em que está envolvida, temos: sinalização por GPCR e Biologia do Desenvolvimento. Segundo o GeneOntology, as anotações específicas desse gene incluem atividade endopeptidase e atividade endopeptidase inibidora em serinas

Hif2a Epas1 – Proteína 1 endotelial com

domínio PAS

(Endothelial PAS

Domain Protein 1)

Gene que codifica um fator de transcrição envolvido na indução de genes regulados pela queda dos níveis de oxigênio. A proteína contém um domínio básico hélice-loop- hélice responsável por heterodimerização, assim como um domínio encontrado em proteínas vias de transdução de sinais que respondem a níveis de oxigênio. Mutações nesse gene estão associadas à eritrocitose familiar tipo-4. Doenças relacionadas a EPAS1 incluem a policitemia secundária autossômica dominante e feocromocitoma esporádica. Entre as vias nas quais EPAS1 participa temos a Biologia do Desenvolvimento e Câncer. Esse gene está relacionado à estas anotações, segundo o Gene Ontology: fator de transcrição, ligação à sequencias de DNA específicas, e heterodimerização com outras proteínas

FIGURA 55. Knockdown de PDI seguido de qPCR em Células Hep-TR (Hep-G2 transduzidas com TR ou TR). A. Gene Hif2a. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI parece reprimir a transcrição do gene quando presente. Isso acontece em ambas isoformas de TR; B. Gene Myh6. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI atua de forma similar à Hif2a, reprimindo a transcrição do gene para ambas isoformas de TR; C. Gene Furin. O knockdown da PDI não afeta de forma significativa a expressão deste gene. (*, P <0.05), Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes ). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni.

Para o gene Hif2a (FIGURA 55-A), o knockdown de PDI afeta a regulação do gene da mesma forma em ambas isoformas de TR, aumentando de 2 a 3x a expressão do mRNA do Hif2a, na ausência de T3, em relação ao controle (ctrl si- RNA). Já na presença de T3, o knockdown de PDI provoca um aumento de cerca de

6x em Hep-TR, e em torno de 10x em Hep-TR, em relação ao respectivo controle (ctrl si-RNA) sem hormônio.

O knockdown de PDI, na ausência de T3, afetou a regulação do gene Myh6 de forma a aumentar a transcrição em torno de 5x em Hep-TR, e em torno de 2 a 3x em Hep-TR (FIGURA 55-B). No entanto, na presença de T3, o knockdown de PDI afetou a regulação do gene Myh6 de forma a aumentar a transcrição em torno de 12x em Hep-TR, e em torno de 10x em Hep-TR, em relação ao respectivo controle (ctrl si-RNA) sem hormônio. Apesar desse gene apresentar regulação diferenciada entre as isoformas de TR, o que reflete em diferentes proporções de regulação da PDI sobre o mesmo, podemos observar que o knockdown de PDI aumenta a transcrição de Myh6, sendo que esse efeito é evidenciado na presença de T3.

De maneira geral, nossos resultados indicam que, para genes como Hif2A (FIGURA 55-A) e Myh6 (FIGURA 55-B) que se comportam se forma similar, a transcrição dos genes aumenta com T3, como era de se esperar. A partir do momento que PDI não está mais presente (PDI siRNA; knockdown), a transcrição do gene aumenta em ambas condições, com e sem T3. Verificamos aqui, nesses dois genes, o primeiro indício de que PDI pode estar atuando na regulação da transcrição como proteína repressora da transcrição, de forma que a sua ausência aumenta tanto a transcrição basal, quanto a ativação por T3, em ambas isoformas de TR. Embora esses dados estejam em desacordo aos dados obtidos na transativação com gene repórter, vamos discutir posteriormente o que essas diferenças representam e como podem ser explicadas.

Entretanto, para o gene Furin, o knockdown da PDI (PDI siRNA) não afeta a transcrição, já o T3, como esperado, aumenta a transcrição do gene nas duas isoformas de TR (FIGURA 55-C). Só foi possível observar um pequeno aumento da transcrição na condição TRβ+T3 sem PDI, porém pouco significativo.

Por fim, através do qPCR, obtivemos indicícios que talvez PDI regule de forma diferente cada gene regulado por TR, e que existem diferenças para cada isoforma de TR.