Discussão e Conclusão dos Screenings

Os resultados encontrados nos permitiram construir vias e redes de interação em que os TRs α e β estão envolvidos. De todos os processos mapeados, verificamos que os TRs têm importante participação em processos biológicos relacionados ao desenvolvimento e progressão do câncer. Com os experimentos de IP e Y2H foi possível identificar interações inéditas entre TRα e β e EBP1, ERK3, CKII, SRPK1 e PRMT5. Nos experimentos de duplo híbrido foram encontradas 28 interações inéditas para TRα e 10, para TRβ. Nos experimentos de IP, foram encontradas mais de 400 novas interações para TRα (459 sem ligante e 311 com ligante) e mais de 200, para TRβ (215 sem ligante e 20 com ligante T3). De acordo com o mapeamento destas interações foi possível visualizarmos os processos em que os TR participam, se existe preferência por isoforma na participação de determinados processos e, como o ligante T3 interfere nas formações de complexos.

Verificamos que TRα se apresentou mais promíscuo em termos de parceiros de interação, sendo que participa de diversos processos biológicos. A adição do ligante T3 leva à redução tanto de parceiros de interação, quanto de processos em

que ambos os TRs participam. No caso, o T3 parece direcionar o TR para a participação em eventos de regulação de transcrição e tradução. Mais ainda, após a identificação dos processos celulares mais comuns em que os TRs atuam, e diversas análises de bioinformática, buscamos a validação de nossos dados e a comparação com outros trabalhos já publicados.

Nossos resultados corroboraram o trabalho de PRIVALSKY, conforme demonstramos, e indicaram que a participação do TR em processos celulares relacionados ao desenvolvimento e progressão do câncer.

Entretanto também encontramos algumas diferenças entre nossos dados e os dados de PRIVALSKY. Uma hipótese para explicar essas diferenças está no método usado por cada um dos trabalhos. Primeiramente, em nosso trabalho, a expressão dos TRs foi feita dentro da mesma célula que a imunoprecipitação dos complexos, criando um ambiente celular bem próximo do encontrado in vivo, sendo que os TRs podem interagir com todas as proteínas presentes dentro de uma célula viva. Outra hipótese se baseia nas diferenças encontradas no tipo de expressão das proteínas, pois enquanto PRIVALSKY utilizou a construção inteira (full) de TRs fusionada em GST, expressa em E. coli BL21 (DE3), nós utilizamos a expressão dos TRs em célula de mamíferos e realizamos as IPs dos complexos dentro da própria célula. A expressão em bactéria, usada por PRIVALSKY, resulta em ausência de modificações pós- traducionais na proteína formada e, como consequência, têm-se interações e recrutamento diferenciado de proteínas.

Além disso, em vez da realização de uma eletroforese para separação das proteínas, nossos complexos foram eluídos da resina anti-flag por competição química, antes de serem enviados para a análise de LC-MS/MS. Durante o procedimento de correr um gel e recortar bandas para enviar para a análise, podem existir escolhas enviesadas. Ao contrário, nós escolhemos eluir os complexos e submeter a amostra líquida total para a análise, o que pode ter resultado em um número maior de peptídeos encontrados exclusivamente para cada isoforma de TR. Por fim, entendemos essas diferenças não como problemas do método, e sim como um fator a ser usado a favor na busca das diversas interações que uma proteína pode fazer.

Comparando os métodos IP-LC-MS/MS e y2h, suas vantagens e desvantagens, uma das questões que podem ser levantadas em nossa análise, é o fato de que não foram encontradas proteínas em comum em ambos. De fato, o sistema y2h identifica interação proteína-proteína de forma binária, ou por interação direta: presa interage com isca e temos a transcrição do gene repórter. Já no sistema IP-LC-MS/MS, as proteínas identificadas podem fazer parte de um complexo muito maior, e as interações encontradas não são necessariamente diretas. Ou seja, entre flag-TR e a presa, podem haver outras proteínas que não necessariamente foram identificadas pela espectrometria de massas (BRÜCKNER et al., 2009; CAUSIER, 2004).

Juntos, y2h e IP-LC-MS/MS, seja encontrando interações diretas ou complexos, nos direcionaram a encontrar vias nas quais os TRs têm funções relevantes. Essas vias foram cuidadosamente analisadas em diversos softwares e plataformas. Através do método IP-LC/MS/MS foi possível confirmar vias em que os TRs atuam dado que foram identificados complexos de proteínas nos quais as interações binárias (y2h) estão inseridas. De fato, quando analisamos os interactomas construídos no Cytoscape, é possivel verificar nas redes de interação dos TRs as interações diretas com o receptor (presas do y2h), as quais compõem, juntamente com os peptídeos identificados em LC-MS/MS, cada processo biológico destacado. Ou seja, nosso trabalho se torna mais confiável e robusto, pelo uso de duas técnicas complementares de screening.

Baseados nestas informações, buscamos alguns alvos para a confirmação experimental através de Co-IP. Para todas as interações confirmadas por Co-IP – RXRα, EBP1, SRPK1, CKIIα, ERK3 e PRMT5 – nós obtivemos a seguinte conclusão: embora as proteínas foram encontradas inicialmente em espectrometria de massas de uma condição em particular, a maioria dos candidatos escolhidos para Co-IP interagiram com os TRs nas 4 condições (TRα, TRα+3, TRβ, TRβ+3).

Atribuímos as diferenças encontradas entre IP e Co-IP aos ruídos de background e cobertura de dados da MS. Conforme discutido em uma revisão recente (GOH et al., 2012), essas são duas limitações muito comuns da técnica de MS. Dessa forma, nós sugerimos que parte dos nossos dados podem não estar totalmente cobertos na IP-LC-MS/MS dos TRs, o que explica porque algumas

proteínas que pareciam ser exclusivas de uma amostra (Ex. TRα sem T3), na Co-IP acabaram sendo confirmadas para as outras amostras também (TR sem T3, TR com T3 e TR com T3). Apesar disso, nossos dados de IP, y2h e Co-IP corroboraram a hipótese de que TRs podem interagir com proteínas presentes em processos essenciais das vias de regulação de câncer. O que revela uma nova e importante função para esse receptor nuclear.