Análise de ‘Pathway Maps’ (junho de 2016)

Analisamos via Software MetaCore (Módulo Pathway Maps, junho de 2016) os peptídeos e presas encontrados em relação as vias em que estão envolvidos, e os agrupamos de acordo com as vias mais enriquecidas (visualização das 10 vias mais enriquecidas - FIGURA 27).

Nas diferentes amostras analisadas, observamos a presença das presas encontradas em vias relacionadas à transcrição de genes, o que confirma a função já bem estudada de TR como regulador da transcrição. Outras vias como regulação metabolismo de hormônios T3 e T4, também já são bem conhecidas (FIGURA 27).

Observamos também outros processos interessantes e menos estudados como: quebra/reparo de DNA e apoptose (em destaque na FIGURA 27). Segundo revisão recente, esses processos, quando desregulados, são considerados como capacidades adquiridas pelas células (chamadas também de ‘hallmarks of cancer’) que resultam no desenvolvimento de tumores (HANAHAN; WEINBERG, 2011). A seguir evidenciaremos algumas dessas vias.

FIGURA 27. METACORE – ‘Pathway Maps’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). As setas evidenciam tanto vias já bem estudadas como “transcrição”, como vias inéditas (ex. Dano ao DNA e apoptose).

Observando as vias em comum a todas as quatro amostras, encontramos a via da transcrição e silenciamento de genes pelos correguladores NCor e SMRT. É sabido que as proteínas TR, RXR, N-CoR e SMRT atuam na regulação da transcrição dentro do núcleo da célula. Essa via contém a repressão e silenciamento de genes feita pelo complexo correpressor, no qual existe a atuação de N-CoR ou SMRT, e

algumas deacetilases de histonas (HDACs). Sendo TR um RN regulado por proteínas correguladoras (ex. NCor), essa via aparece como uma forma de confirmação da confiabilidade dos métodos utilizados. Outra via enriquecida, a via de Regulação do Metabolismo dos Hormônios T3 e T4, também traz confiabilidade aos nossos dados. Nesta via está presente o TR com seus parceiros bem caracterizados: RXR, que forma o heterodímero; NCor/SMRT, correpressores de TR; NCoA, coativador da transcrição e TRIP, uma proteína caracterizada por interagir com TR na via de transcrição. Além dessas, outra via bem estudada com a ação de TRs, é a via de transcrição de genes regulados por retinóides. Nessa via observamos as mesmas proteínas encontradas nas vias anteriores, exceto por FASN, que tem um papel importante na rota de lipogênese e o biossíntese de ácidos graxos saturados.

A via de apoptose relacionada à fosforilação BAD (FIGURA 28) foi outra via muito importante encontrada em nossos dados. BAD é um membro da família BCL-2, que são reguladores das vias de morte celular programada, induzindo a apoptose. Quando fosforilada, BAD é retida no citosol ligada à proteína 14-3-3 (encontrada na amostra-1, interagindo com TR +T3). E em situações de estresse BAD é ativada por defosforilação, executada principalmente pelas proteínas PP2A e PP2C (BERGMANN, 2002). Estudos demonstram que a expressão estável de TR em células de câncer de mama (MCF-7) resulta em inibição do crescimento de tumor, através da ativação de vias de apoptose (PARK; ZHAO; CHENG, 2013) e, talvez esta proteína seja um importante elo de interação com o TR, que poderia explicar a diminuição da proliferação deste tipo celular.

FIGURA 28. METACORE – Pathway Maps. Via da apoptose relacionada à fosforilação BAD. Encontrada em TR+T3. Apoptosis/Survival_BAD phosphorylation.. LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs.

Mais ainda, nossa análise destaca uma via que aparece em 3 das 4 amostras: a via de dano ao DNA com DSBs (ou Double-strand breaks - DSBs) ligada à reparo por NHEJ (junção de extremidades não-homólogas) (FIGURA 29). Quebra de dupla- fita (DSBs) resultam da ruptura da estrutura dupla-hélice do DNA e a NHEJ parece ser o mecanismo primário utilizado pelos mamíferos para reparar os DBSs (FIGURA 29). No primeiro passo da via, o heterodímero Ku70/80 (encontrado nas amostra-1 e amostra-3, interagindo com TR sem e com T3, respectivamente), que são subunidades 70 e 80 kDa de DNA helicases dependentes de ATP, reconhecem as extremidades do DNA, recrutam e ativam quinases, que vão ligar as fitas e reconstituir o DNA (PASTWA; BLASIAK, 2003). Nessa via é importante mencionar a ação pouco estudada de TR na quebra e reparo de DNA. De fato, existem muitas evidências que mostram TR e THs (Hormônios Tireoidianos) envolvidos em envelhecimento, câncer e doenças degenerativas. Em um trabalho publicado recentemente (ZAMBRANO et al., 2014) foi demonstrado que a ligação do T3 ao TR induz senescência e danos ao DNA em cultura de células e tecidos de camundongos

com hipertireoidismo. Isso ocorre através da ativação de proteínas de uma cascata que resulta em aumento da respiração na mitocôndria, que por sua vez produz mais

espécies reativas de oxigênio causando DSBs.

FIGURA 29. METACORE – Pathway Maps. Via de dano ao DNA com DSBs ligada à reparo por NHEJ. Encontrada em TR+T3, TR+T3, TR-T3. DNA damage_NHEJ/DSB; LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs.

Por fim, também observamos a via de reparo de DNA ligada à proteínas BRCA1/BRCA2 (FIGURA 30), que é uma via ativada na presença de quebra de DNA e posterior fosforilação das proteínas BRCA1/BRCA2. A presença destas proteínas indicam a susceptibilidade ao câncer de ovário e de mama. Existem proteínas dessa via envolvidas em reparo do DNA, como a Rad50, que foi encontrada nas 4 amostras analisadas em nossos experimentos, além da p53 (encontrada interagindo com TR com e sem T3), tão importante nessa via e já descrita como parceira de interação de TR (YAP; YU; CHENG, 1996).

FIGURA 30. METACORE – Pathway Maps. Via de reparo de DNA ligada à proteínas BRCA1/BRCA2. Encontrada nas 4 amostras analisadas. Brca1/Brca2 DNA Repair. LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs.

3.5.2 Análise de ‘Disease Biomarkers Network’ – MetaCore (junho de 2016)

Em seguida, decidimos investigar se as proteínas encontradas como parceiras de interação dos TRs estavam envolvidas no desenvolvimento e progressão de doenças. Essa análise nos permite discutir se existe e qual seria a importância da função dos TRs nesses processos. De acordo com análise do MetaCore, no módulo de biomarcadores de doenças, encontramos as vias nas quais as proteínas parceiras de TRs participam (FIGURA 31).

FIGURA 31. METACORE – ‘Disease Biomarker Networks’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). Sem T3 – Laranja, Com T3 – Azul.

Em menor proporção observamos os parceiros de TR participando de doenças como Esclerose Lateral Amiotrófica, Parkinson, Hepatite. Mas, de um modo geral, entre as vias encontradas (FIGURA 31), observamos diversas vias de câncer, muito enriquecidas em ambas amostras (TR e TR), como: neoplasmas de mama, de tireoide, colorretal e de próstata.

De fato, a relação entre TRs e câncer não é nova, porém os mecanismos pelos quais TRs podem suprimir ou ajudar na proliferação de tumores são pouco estudados. Evidências dessa relação surgiram a partir do descobrimento de uma forma mutante de TR1, v-erbA, que poderia estar envolvida em leucemia eritróide aguda (THORMEYER; BANIAHMAD, 1999; WEINBERGER et al., 1986). A oncoproteína v-erbA não liga T3 e perdeu sua habilidade de ativar a transcrição de genes, atua aumentando a atividade oncogênica de outras proteínas. Além disso, v-erbA compete com TR pelos TREs, interferindo na transcrição de genes (CHEN; PRIVALSKY, 1993; CHENG, 2003). Outras evidências vem de estudos com camundongos transgênicos superexpressando v-erbA, que como resultado, desenvolvem carcinoma hepatocelular (BARLOW et al., 1994).

Outra relação encontrada entre TR e câncer vem de estudos que demonstram TR1 interagindo com ciclina D1, um produto oncogênico conhecido, e

p53, um supressor de tumor bem descrito na literatura. Nesses casos, os resultados sugerem que TR1 estaria atuando como repressor da atividade transcricional dessas nucleoproteínas (CHENG, 2003). De fato, a proteína p53 foi encontrada em nossas amostras de imunoprecipitação de TR, com e sem T3. CHENG (2003) também comenta o envolvimento de TRs em câncer de fígado, através da confirmação da presença de formas truncadas de TR1 e TR1. (CHENG, 2003; GONZÁLEZ-SANCHO et al., 2003).