O presente trabalho teve como objetivo estudar, a partir de diferentes técnicas, a interação do peptídeo antimicrobiano StigA15 com meios miméticos de membranas, além de investigar suas preferências conformacionais e atividades biológicas.
Os dados obtidos por espectroscopia de Dicroísmo Circular, juntamente com a espectroscopia de RMN em solução, mostram que o peptídeo adota conformação em -hélice na presença de co-solvente TFE, em meios micelares e na presença de vesículas fosfolipídicas. Contudo, o conteúdo helicoidal é maior quando o peptídeo está em presença de meios biomiméticos aniônicos, o que foi atribuído a sua maior interação nesses ambientes.
Por sua vez, o estudo termodinâmico por ITC mostrou aspectos importantes da interação peptídeo-membrana. Em ambos os meios, POPC e POPC:POPG (3:1), as interações peptídeo-membrana são termodinamicamente favoráveis (∆G0 < 0) com constantes de interação relativamente elevadas, sendo duas vezes maior em ambiente aniônico, o que novamente indica maior perturbação da membrana carregada negativamente. Em contrapartida, embora a StigA15 apresente uma carga líquida positiva, a componente entálpica, proveniente em grande parte das interações eletrostáticas, apresentou-se menor que a entrópica tanto para bicamadas aniônicas quanto para zwitteriônicas. Como a ITC mede o calor global envolvido na interação, pode-se concluir que a interação eletrostática seja fundamental para a interação inicial da StigA15 com a membrana, com contribuições significativas de interações hidrofóbicas, resultando no baixo valor da entalpia de interação do peptídeo com as vesículas fosfolipídicas.
Somado a isso, foi verificada a atividade antimicrobiana em cepas bacterianas e fúngicas, as quais foram comparáveis à do peptídeo nativo Stigurina. Além de inibir o crescimento dos microrganismos às concentrações menores que as da Stigmurina, pôde-se verificar valores de CIMs próximos às CMMs, fazendo com que esse peptídeo seja promissor para uso como agente antibiótico. Apesar do análogo apresentar taxas de hemólise maiores que a Stigmurina, os resultados sugerem que o peptídeo StigA15 pode ser seletivo para células de patógenos por não apresentar taxas de hemólise nas concentrações nas quais foram verificadas atividades antimicrobianas.
Os estudos de RMN em solução indicam que a Stigmurina e StigA15 adotam conformações helicoidais na presença de TFE. Além disso, as estruturas helicoidais desses peptídeos possuem forte caráter anfipático, que permite que esses compostos se particionem de maneira eficiente na interface da membrana. Estruturas anfipáticas e com teor líquido de carga positiva são comuns a vários peptídeos antimicrobianos, o que certamente indica que o modelo apresentado é consistente com a conformação ativa dos peptídeos. Dessa forma, tais compostos podem exercer atividades desestabilizadoras e de formação de poros na
membrana, especialmente no peptideo análogo StigA15, que apesar do elevado caráter catiônico favorecer uma interação eletrostática com o meio aniônico, a cadeia peptídica pode adotar uma conformação que favorece interações hidrofóbicas com a face apolar do peptídeo inserida na parte interna da membrana fosfolipídica, como observado nos estudos de ITC que apresentou um elevado valor entrópico.
Apesar da considerável similaridade entre as sequências peptídicas, consideráveis diferenças são observadas com relação à propensão de formação de hélices nas porções próximas às extremidades N-terminais dos dois peptídeos. As estruturas tridimensionais obtidas a partir dos dados de RMN em solução indicam segmentos helicoidais envolvendo os resíduos Ile-5 a Phe-16 para a StigA15 e de Ser-7 a Phe-16 para a Stigmurina. Esses resultados estão de acordo com as atividades mais pronunciadas da StigA15 em comparação com o peptideo nativo, o que reforça ideia de que substituições por resíduos carregados na sequência peptídica favorecem a interação da StigA15 com as membranas, bem como uma elevada estabilidade estrutural. Tal característica estrutural se torna parte importante do processo de interação, em que o peptídeo promove a formação de poros, causando a lise da membrana celular. Assim sendo, com o conjunto de análises proposto neste trabalho, foi possível identificar o modo de interação para o modelo de mecanismo de ação do StigA15. A proposta do modelo de mecanismo, mostra que a ação do StigA15 é favorecida e, possivelmente seletiva, para as membranas que apresentam carga superficial negativa, como as membranas bacterianas e fúngicas, mostrando que o peptídeo StigA15 é um promissor agente anti-infeccioso.
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8 ANEXOS
8.1 Anexo A
Figura 35. Estrutura química dos principais componentes das membranas procariotas: (A) fosfatidilglicerol (PG) e (B) cardiopina (CL)
Figura 36. Estrutura química dos Fmoc-amoniácidos usados na obtenção do peptideo StigA15.
Grupo protetor do grupo amino: 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc). Grupo protetor da cadeia lateral: em vermelho o terc-Butiloxicarbonila (Boc) e em azul o terc-Butil (tBu)
Fonte: Autor, 2019 Figura 37. Estrutura química do ácido siálico em pH fisiológico.
Fonte: Autor, 2019
Figura 38. Ângulos diédricos formados a partir das rotações das ligações peptídicas em torno do C