4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.6 Preparação das Vesículas Fosfolipídicas
Para a preparação das vesículas unilamelares (LUV, do inglês Large Unilamellar Vesicles) foi utilizado 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e o 1-palmitoil-2- oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol) (POPG) (Fig. 16), ambos adquiridos da Avanti Polar Lipidics, Inc. O filme lipídico foi ressuspendido em solução tampão de Tris-HCl a 100 mM (NaCl a 50 mM) em pH 7,5 para as análises de ITC. O preparo foi realizado segundo a metodologia de Desidratação/Reidratação de Vesículas (DRV) proposta por Kirby (Kirby et al., 1984), no Laboratório de Síntese e Estrutura de Biomoléculas (LASEB), UFVJM. Já para as análises de dicroísmo circular, o filme lipídico foi ressuspendido em água deionizada Mili-Q, procedimento esse realizado no Laboratório de Síntese e Estrutura de Peptídeos (LASEP), UFMG.
Para a preparação das vesículas, os fosfolipídios POPC e POPG, na proporção estequiométrica 3:1 mol/mol, foram pesados e solubilizados em até 2,0 mL de clorofórmio. A solução foi transferida para um tubo de ensaio e o clorofórmio foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida e aquecimento a 40 °C. Tal processo resultou na formação de filme lipídico sobre a parede interna do tubo de ensaio, o qual foi hidratado. Para os estudos de ITC, foi utilizado a solução tampão Tris-HCl 100 mM pH (7,5), contendo NaCl (50 mM NaCl), já no CD essa suspensão foi realizada em água Mili-Q. O que levou, em ambas hidratações, à formação de vesículas fosfolipídicas multilamelares (MLV).
Figura 16. Estrutura química dos fosfolipídios utilizados para a obtenção das vesículas unilamelares.
Fonte: Autor, 2019.
Para obtenção das LUV, as MLV foram submetidas a oito ciclos sucessivos de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria a 40 °C, resultando na formação de vesículas unilamelares de tamanhos variáveis. A dispersão de vesículas multilamelares obtida foi submetida a ciclos de onze extrusões, através da membrana de policarbonato de 100 nm, usando-se um extrusor de pressão manual (Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, Alabama).
4.7 Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)
As análises de ITC foram realizadas a 35 °C em um microcalorímetro VP-ITC da Malvern (Malvern, Reino Unido), pela titulação de solução de vesículas de POPC e POPC:POPG (3:1) em solução de peptídeo StigA15, no Laboratório de Síntese e Estrutura de Biomoléculas (LASEB), UFVJM. A calibração do equipamento foi realizada com água deionizada Mili-Q, os dados foram tratados em software Microcal Origin7.0 para ITC. As soluções utilizadas foram previamente desgaseificadas em um Microcal Thermovac da Malvern.
Os experimentos foram realizados com 50 injeções sucessivas de 1,0 μL de titulante (LUV) a 20 mM na célula de reação preenchida com 1,4 mL de solução de peptídeo, com intervalos de 300 s. Para os experimentos com a StigA15, foram utilizados 30 μM do peptídeo em solução de 20 mM de vesículas de POPC e de POPC:POPG (3:1). Todas as soluções foram preparadas em tampão Tris-HCl 100 mM em pH 7,5 (50 mM NaCl).
4.8 Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD)
Os estudos conformacionais por CD foram realizados em um espectropolarímetro da JASCO J-810 (Tóquio, Japão), equipado com sistema de controle de temperatura Peltier Jasco - PFD425S, pertencente ao Departamento de Química da UFMG. Estudos de dicroísmo
circular foram realizados com os peptídeos StigA15 a 0,1 mg/mL em soluções de 2,2,2- trifluoretanol (TFE) (0; 10; 20; 30; 40; 50; e 60% v/v de TFE em água ultrapura) com diferentes proporções, bem como na presença de micelas de dodecil fosfocolina (DPC) e dodecil sulfato de sódio (SDS) (Fig. 17) nas concentrações 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 10 e 15 mM e na presença de pequenas vesículas unimelares de POPC e de POPC:POPG (3:1) para concentrações fosfolipídicas de 0,1; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0; 1,5, 2,0 e 2,5 mM. As análises foram realizadas em uma cubeta de quartzo com 1,0 mm de caminho óptico, tendo-se empregados os seguintes parâmetros: com janela espectral de 195 a 260 nm, velocidade de varredura de 50 nm/min, coleta de dados 0,2 nm e 1,0 nm de largura de banda, com o tempo de resposta de 1 s, com quatro varreduras para experimentos realizados em TFE:H2O e na presença de
micelas e seis para experimentos realizados na presença de vesículas fosfolipídicas. Os experimentos para todas as amostras foram realizados a 25 ºC e, no caso dos experimentos na presença de vesículas fosfolipídicas, além dessa temperatura, também foram realizados experimentos a 35 ºC. Os espectros foram adquiridos e processados com o auxílio do software Spectra Manager e foram posteriormente analisados com o uso do software CDPro (Sreerama & Woody, 2000, 2004).
Figura 17. Estrutura química das micelas (DPC e SDS) e do TFE, e suas respectivas massas molares.
Fonte: Autor, 2019
4.9 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Para realização dos estudos estruturais e conformacionais por RMN em solução, foi preparada uma solução a 2,0 mM do peptídeo StigA15 e Stigmurina em mistura de TFE- d2:H2O (40:60%, v/v) a 25 ºC. Foram utilizados o TFE-d2 da Cambridge Isotope Laboratories
(DSS) a uma concentração de 1,0 mM foi utilizado como padrão interno de referência para ressonâncias de 1H e 13C. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram obtidos em
um espectrômetro da Bruker AVANCE III 800, no Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear - Jiri Jonas (CNRMN), na Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). A aquisição dos experimentos de RMN foi feita pela Professora Renata Mendonça Araújo, orientadora desta dissertação.
Os experimentos bidimensionais homonucleares de TOCSY, NOESY e o heteronucleares 1H–13C HSQC e 1H–15N HSQC foram realizados usando uma sonda de 5 mm
de tripla ressonância (1H/13C/15N), equipada com bobina para o emprego de pulsos de
gradiente de campo. A supressão do sinal da água foi efetuada por pré-saturação. Para os dois peptídeos, os experimentos de TOCSY foram realizados com tempo de mistura de 60 ms, enquanto os experimentos de NOESY com tempos de mistura de 120, 150, 200 e 250 ms, a fim de avaliar a difusão de spin.
Para os processamentos dos espectros, foi utilizado o software NMRPipe (Delaglio et al., 1995). Os assinalamentos dos mapas de contornos de RMN foram realizados com o auxílio do software NMRView (Johnson & Blevins, 1994).
Seguindo o procedimento padrão de atribuição sequencial desenvolvido por Wüthrich (1986), foram atribuídas as correlações 1H–1H intra e inter-residuais de cadeia principal e
cadeias laterais nos mapas de contornos TOCSY e NOESY. Os mapas de contornos heteronucleares 1H–13C–HSQC e 1H–15N–HMQC foram utilizados para determinar os
deslocamentos químicos 13C, C e C e 15N amídicos, e funcionaram como controles para os
assinalamentos das ressonâncias de 1H. E como referência para identificação dos sistemas
de spin dos resíduos de aminoácidos, foi utilizada a tabela de deslocamentos químicos Biological Magnetic Resonance Data Bank (Disponível: http://www.bmrb.wisc.edu/ ref_info/statsel.htm. Acesso: janeiro de 2019).