Estudos estruturais e biológicos do peptídeo StigA15 e a relação com o protótipo natural Stigmurina

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudos estruturais e biológicos do peptídeo StigA15 e a relação com o

protótipo natural Stigmurina

Suedson de Carvalho Silva Rodrigues

Dissertação de Mestrado

Suedson de Carvalho Silva Rodrigues

Estudos estruturais e biológicos do peptídeo StigA15 e a

relação com o protótipo natural Stigmurina

Texto da dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Química.

Área de concentração: Química Orgânica

Orientadora: Profª. Dra. Renata Mendonça Araújo Co-orientador: Prof. Dr. Jarbas Magalhães Resende

Natal-RN 2019

Rodrigues, Suedson de Carvalho Silva.

Estudos estruturais e biológicos do peptídeo StigA15 e a relação com o protótipo natural Stigmurina / Suedson de Carvalho Silva Rodrigues. - Natal: UFRN, 2019.

102f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra - CCET, Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Química (PPGQ).

Orientador: Dra. Renata Mendonça Araújo. Coorientador: Dr. Jarbas Magalhães Resende.

1. Peptídeo Antimicrobiano - Dissertação. 2. Interação Peptídeo-Membrana - Dissertação. 3. Relação Estrutura-Atividade - Dissertação. I. Araújo, Renata Mendonça. II. Resende, Jarbas Magalhães. III. Título.

RN/UF/BSQ CDU 577(043.3)

- IQ

Dedico essa e todas as outras conquistas da minha vida à minha família, especialmente à minha mãe e a meus avós, que nunca mediram esforços para meus estudos, que sempre me apoiaram em todas as decisões, nunca me deixaram sozinho nos momentos de dificuldades e desespero, e que sempre acreditaram em mim e no meu potencial. Meu amor e agradecimento são imensuráveis.

Agradecimentos

Em primeiro lugar, quero agradecer a Deus pela força e sabedoria que me foram concedidas, principalmente nos momentos mais difíceis, em que me senti incapaz de prosseguir.

Sou imensamente grato à minha orientadora Renata Araújo, pois sem ela nada disso seria possível, principalmente a minha ida a UFMG, e a confiança dada para desenvolver este projeto. Agradeço também sua disponibilidade de realizar os experimentos de RMN no CNRMN, UFRJ.

Ao meu co-orientador, Jarbas Resende, pelo enorme entusiasmo pela pesquisa que contagia qualquer um, por todos os ensinamentos e, principalmente, pela oportunidade e confiança de realizar toda a parte experimental deste trabalho em seu laboratório. Obrigado por ser um coorientador sempre tão presente e paciente e que sempre se mostrou amigo de todos nós. Você é um exemplo de profissional para mim. Agradecer ao professor Matheus Pedrosa da UFRN, por idealizar este projeto junto com a professora Renata, pelo fornecimento da sequência do peptídeo, matéria prima desse projeto e pelos testes biológicos realizados pela sua equipe, em especial ao Bruno e Adriana.

Aos amigos da UFMG, especialmente no LASEP. Eu não poderia querer um ambiente melhor para trabalhar, onde todos se ajudam com boa vontade, trabalham com seriedade, mas também deixam o dia a dia descontraído e divertido. Em especial à Cláudia e à Lídia, que me receberam e ajudaram muito durante os primeiros passos nos experimentos.

Agradecer por toda a equipe do LASEB na UFVJM, em Diamantina, onde todos ali presentes sempre estiverem dispostos a ajudar. Em especial ao professor Rodrigo Verly, pela oportunidade de realizar os testes de interação e o uso do CLAE, pela disponibilidade do seu tempo para me auxiliar em experimentos e por ter dado ótimos conselhos que contribuíram significativamente na execução deste projeto.

Aos companheiros do programa de pós-graduação em química da UFMG e da UFRN, e às secretárias da pós-graduação, sempre tão presentes e dispostos a ajudar. Ao Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais pela cessão das instalações para que a minha pesquisa pudesse se concretizar.

Por fim aos órgãos de fomento à pesquisa, CNPq, CAPES e FAPEMIG, responsáveis pelo financiamento deste projeto de pesquisa.

Enfim, agradeço a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

Resumo

Devido ao amplo espectro de atividades biológicas relatadas na literatura para peptídeos presentes na peçonha de escorpiões, tem sido observado um aumento nos estudos dessas moléculas, principalmente os peptídeos antimicrobianos, que são investigados como alternativas estratégicas para enfrentar problemas como a resistência a antibióticos convencionais. Sabe-se que o mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos ocorre, em grande parte, pela interação dos mesmos com a membrana do microrganismo, causando desestabilização da bicamada lipídica, resultando na formação de poros que levam à lise celular. Entretanto, os detalhes dessas interações ainda não são totalmente conhecidos e podem variar significativamente de peptídeo para peptídeo, por isso, estudos da interação peptídeo-membrana em meios biomiméticos fazem-se necessários. O presente trabalho propôs a síntese e caracterização de um potencial peptídeo bioativo, denominado StigA15. Esse peptídeo foi arquitetado a partir da sequência primária da Stigmurina, peptídeo antimicrobiano originalmente identificado no transcriptoma da espécie Tityus stigmurus. O peptídeo StigA15 foi obtido por síntese de peptídeos em fase sólida, via estratégia Fmoc. Foram então empregadas, como ferramentas principais de investigação, a Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) e as espectroscopias de Dicroísmo Circular (CD) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para o peptídeo análogo. Todos esses experimentos foram desenvolvidos em meios que mimetizam os ambientes de membranas. Para o peptídeo StigA15, observou-se que a substituição por duas lisinas, resultou no aumento na atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e contra fungos, sendo o peptídeo StigA15 mais ativo para essas cepas do que o peptídeo nativo. Segundo estudos preliminares, identificou-se que o StigA15 possuía maior momento hidrofóbico e que por isso poderia se inserir mais na superfície da membrana e interagir de maneira mais efetiva do que a Stigmurina. Pôde-se observar uma seletividade para células microbianas em relação às células eucarióticas no peptídeo StigA15, por apresentar uma taxa de hemólise baixa nas concentrações ativas contra os microrganismos. Isso foi confirmado por estudos de ITC que demonstraram a maior interação de StigA15 em vesículas aniônicas do que em vesícula zwitteriônicas. Verificou-se, por espectroscopias de CD e RMN, que o peptídeo se estruturava em  -hélice quando em contato com meios miméticos de modelos de membranas. Além disso, foi comprovado por RMN uma alta anfipacidade do StigA15 o que, juntamente com sua carga líquida positiva (+4), é propriedade bastante recorrente em peptídeos com significativa atividade antimicrobiana. Portanto, apresenta-se um peptídeo inédito com alto potencial biotecnológico.

Palavras chave: Peptídeo antimicrobiano, interação peptídeo-membrana, estrutura,

Abstract

Due to the broad spectrum of biological activities reported in the literature for peptides present in scorpion venoms, an increase in the studies of these molecules has been observed, especially of antimicrobial peptides, which are investigated as strategic alternatives to face problems such as resistance to conventional antibiotics. It is known that the mechanism of action of antimicrobial peptides occurs in large part by the interaction with microorganism membrane, causing destabilization of the lipid bilayer and resulting in the formation of pores, which lead to cell lysis. However, details of these interactions are not yet completely known and significant variation may occur from peptide to peptide, therefore, membrane-peptide interaction studies with biomimetic environments are necessary. The present study proposes the synthesis and chemical characterization of the bioactive peptide StigA15, designed from the primary sequence of Stigmurin, antimicrobial peptide identified from Tityus stigmurus transcriptome. The peptide was obtained from Fmoc solid phase peptide synthesis. Isothermal Titration Calorimetry (ITC), Circular Dichroism (CD) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy were used as the main research tools and the respective experiments were performed in mimetic membrane environments. The activity of StigA15 when compared to Stigmurin revealed that the substitution of two serine residues by two charged lysines resulted in higher activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria, as well as against fungi. According to preliminary studies, it has been identified that StigA15 has a higher hydrophobic moment and therefore could be inserted more deeply in the membrane than Stigmurin. StigA15 presents selectivity towards pattogen cells, since it presents very low hemolysis rates at the active antimicrobial concentrations. This selectivity is further supported by ITC experiments that indicated significatly stronger interactions of StigA15 with anionic vesicles, when compared to zwitterionic vesicles. CD and NMR spectroscopies indicated that the peptide adopts helical conformations in membrane mimetic enviorenments. In addition, NMR spectroscopy proved that the peptide shows high amphipathicity which is, together with its net positive charge (+4), a feature commonly found in several antimicrobial peptide sequences. Therefore, here is presented a novel peptide sequence with high biotechnological potential.

Keywords: Antimicrobial peptide, peptide-membrane interaction, structure,

Lista de Figuras

Figura 1. Representação da cadeia peptídica pela formação da ligação peptídica. Além

disso, é ilustrada a direção da cadeia peptídica da porção N- para a C-terminal. ... 21

Figura 2. Gráfico de pizza da distribuição de peptídeos isolados de fontes naturais (total

3065) depositados no APD. ... 22

Figura 3. Principais classes estruturais de peptídeos. (A) -hélices, magainina-2 (PDB 2MAG); (B) conformação-, polifemusina (PDB 1RKK); (C) estendidos, indolicidina (PDB 1G89); (D) Dímero da homotarsinina (Verly, et al., 2017). ... 24

Figura 4. Representação esquemática dos principais modelos de ação dos peptídeos

antimicrobianos helicoidais: (A) modelo de barril, (B) eletroporação molecular, (C) poro toroidal e (D) modelo carpete. Em vermelho representa-se uma parte hidrofílica, e em azul uma parte hidrofóbica ... 27

Figura 5. Espécie Tityus stigmurus, popularmente conhecido como escorpião amarelo.

... 29

Figura 6. Exemplos de resinas poliméricas usadas na síntese de peptídeos em fase

sólida. ... 31

Figura 7. Mecanismo genérico proposto para a reação de desproteção (remoção do

grupo Fmoc) com 4-metilpiperidina (condição básica) para gerar o N-terminal. ... 32

Figura 8. Mecanismo genérico proposto para a reação de ativação seguida do

acoplamento de Fmoc-aminoácido. ... 33

Figura 9. Mecanismo genérico proposto para o teste de Kaiser. ... 34 Figura 10. Mecanismo da clivagem libera o C-terminal amídico do peptídeo da

peptidil-resina, pelo emprego de uma solução de TFA (catálise ácida) ... 35

Figura 11. Esquema geral da síntese de peptídeos em fase sólida, segundo estratégia

Fmoc. ... 36

Figura 12. (A) Espectros padrões de dicroísmo circular característicos de peptídeos em

conformação em -hélice (amarelo), em conformação em folha- (azul) e sem conformação preferencial (vermelho) e (B) os principais comprimentos de onda de absorção e as respectivas transições eletrônicas, representativos de cada tipo de estrutura. ... 38

Figura 13. Representação das correlações típicas de estrutura secundária em -hélice. (A) interações entre núcleos de hidrogênios intra-residuais observadas no TOCSY e (B) inter-residuais observadas no NOESY. ... 41

Figura 14. Em detalhe, modelo da seringa utilizada na Fmoc-SPFS. ... 43 Figura 15. Representação esquemática das etapas da estratégia Fmoc de SPFS. ... 47

Figura 16. Estrutura química dos fosfolipídios utilizados para a obtenção das vesículas

unilamelares. ... 51

Figura 17. Estrutura química das micelas (DPC e SDS) e do TFE, e suas respectivas

massas molares. ... 52

Figura 18. Perfil de CLAE do peptídeo StigA15. Amostra injetada (100 μL de uma

solução a 1 mg/mL) em coluna C18 Vydac (7,8 x 300 mm) equilibrada com TFA a 0,1 %. Eluente: solução de acetonitrila/TFA 0,08% em um fluxo de 1 mL/min. A linha reta retrata a variação da concentração de acetonitrila. A absorbância foi monitorada em máx

= 214 nm. ... 57

Figura 19. Espectro de massa (MALDI-ToF) e expansão da fração correspondente do

peptídeo StigA15. Massas monoisotópicas observadas: 1877,1 Da do peptídeo StigA15, [M+Na]+ _{= 1900,1 Da e [M+K]}+ _{= 1916,1 Da. ... 57}

Figura 20. Percentual de atividade hemolítica dos peptídeos Stigmurina e StigA15 em

eritrócitos humano. ... 60

Figura 21. Isotermas de titulação calorimétrica obtidas a partir da titulação de LUVs de

POPC (20 mM) e POPC:POPG (3:1) (20 mM) em solução de StigA15 (30 µM). Gráfico de fluxo de calor para cada injeção de (A) LUVs-POPC e (B) LUVs-POPC:POPG em função do tempo. Ajuste não linear de entalpia por razão molar de (C) POPC/StigA15 (D) POPC:POPG (3:1) /StigA15, com subtração dos respectivos calores de diluição. 63

Figura 22. Espectros de CD da StigA15 em (A) diferentes proporções de TFE:H2O, na

presença de micelas de (B) DPC e (C) SDS e na presença de vesículas grandes unilamelares de (D) POPC 25 ºC, (E) POPC 35 ºC, (F) POPC:POPG (3:1) 25 ºC e (G) POPC:POPG (3:1) 35 ºC ... 66

Figura 23. Estrutras químicas das sequências primárias dos peptídeos (A) Stigmurina

e (B) StigA15. Em azul são apresentados os resíduos de serina (S) Stigmurina que foram substituídos por resíduos de lisina (K) StigA15. ... 71

Figura 24. Ampliação dos mapas de contornos (A) NOESY e (B) TOCSY da StigA15 a

2,0 mM em TFE-d2:H2O (40:60%). ... 72

Figura 25. Ampliação do mapa de contornos (A) NOESY região NN (i, i+1) e (B) 1 H-15_{N-HMQC da StigA15 a 2,0 mM em TFE-d}

2:H2O (40:60%). ... 74

Figura 26. Ampliação do mapa de contornos (A) NOESY região NN (i, i+1) e (B) 1 H-15_{N-HMQC da Stigmurina a 2,0 mM em TFE-d}

2:H2O (40:60%). ... 75

Figura 27. Ampliação do mapa de contornos (A) TOCSY e (B) 1_H-13_{C-HSQC da StigA15}

a 2,0 mM em TFE-d2:H2O (40:60%). ... 77

Figura 28. Ampliação do mapa de contornos (A) TOCSY e (B) 1_H-13_{C-HSQC da}

Figura 29. Ampliação das regiões de correlação de NOEs no mapa de contornos

NOESY a 2,0 mM em TFE-d2:H2O (40:60%) dos peptídeos. StigA15 (A) N (i, i+n)

n=1,2,3,4; (B) N (i, i+1) e (C) β (i, i+3) e Stigmurina (D) N (i, i+n) n=1,3 e (E) N (i, i+1). ... 79

Figura 30. Diferenças entre deslocamentos químicos de Cα experimentais e

deslocamentos químicos padrões de C a 2,0 mM em TFE-d2:H2O (40:60%) dos

peptídeos (A) StigA15 e (B) Stigmurina. Valores positivos são indicativos de que os resíduos participam de um segmento -helicoidal e valores negativos indicam que resíduos participam de uma conformação-. ... 82

Figura 31. Dez estruturas de menor energia obtidas via rotina de annealing simulado a

2,0 mM em TFE-d2:H2O (40:60%) dos peptídeos (A) StigA15 (sobreposição dos

resíduos Ile-5 a Lys-17) e (B) Stigmurina (sobreposição dos resíduos Ser-7 a Lys-17). Cadeias laterais de resíduos hidrofílicos são apresentadas em verde e de resíduos hidrofóbicos em azul. A porção N-terminal aponta para a parte inferior da Figura. ... 84

Figura 32.Dez estruturas de menor energia obtidas via rotina de annealing simulado a

2,0 mM em TFE-d2:H2O (40:60%) dos peptídeos (A) StigA15 (sobreposição dos

resíduos Ile-5 a Lys-17) e (B) Stigmurina (sobreposição dos resíduos Ser-7 a Lys-17). Cadeias laterais de resíduos hidrofílicos são apresentadas em verde e de resíduos hidrofóbicos em azul. A porção N-terminal aponta para o lado esquerdo da Figura. ... 85

Figura 33. Conformações de menores energias obtidas via rotina de annealing

simulado a 2,0 mM em TFE-d2:H2O (40:60%) dos peptídeos (A) StigA15 e (B)

Stigmurina. Cadeias laterais de resíduos hidrofílicos são apresentadas em verde e de resíduos hidrofóbicos em azul. A porção N-terminal aponta para o lado esquerda da Figura ... 86

Figura 34. Diagrama de Ramachandran das dez estruturas mais estáveis a 2,0 mM em

TFE-d2:H2O (40:60%) dos peptídeos (A) StigA15 e (B) Stigmurina. Regiões mais

favoráveis em vermelho (A, B, L), regiões adicionalmente favoráveis em amarelo (a, b, l, p), regiões generosamente favoráveis em bege (~a, ~b, ~l, ~p) e regiões proibidas em branco. Dados obtidos com uso do software PROCHECK-NMR (Laskowski et al., 1996). ... 87

Figura 35. Estrutura química dos principais componentes das membranas procariotas:

(A) fosfatidilglicerol (PG) e (B) cardiopina (CL) ... 99

Figura 36. Estrutura química dos Fmoc-amoniácidos usados na obtenção do peptideo

StigA15. ... 100

Figura 38. Ângulos diédricos formados a partir das rotações das ligações peptídicas em

Lista de Tabelas

Tabela 1. Sequências e cargas líquidas da Stigmurina e do StigA15 investigado neste

trabalho... 30

Tabela 2. Fmoc-aminoácidos protegidos e as respectivas massas molares modificadas

e obtidas na obtenção do peptídeo StigA15 ... 45

Tabela 3. Propriedades físico-químicas e predições de estruturas secundárias

simuladas para a Stigmurina e StigA15 ... 54

Tabela 4. Alinhamento da sequência da StigA15 com peptídeos antimicrobianos

isolados de peçonha de escorpião. ... 55

Tabela 5. Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo StigA15 ... 56 Tabela 6. Atividade antimicrobiana dos peptídeos por concentração inibitória mínima

(CIM) e concentração microbicida mínima (CBM). ... 58

Tabela 7. Parâmetros termodinâmicos obtidos a partir da titulação de LUVs (20 mM) em

StigA15 (30 μM) a 35 °C ... 64

Tabela 8. Sumário gráfico de correlações de NOE características de estrutura helicoidal

obtidas a partir da análise do mapa de contornos NOESY a 2,0 mM em TFE-d2:H2O

(40:60%) dos peptídeos (A) StigA15 e (B) Stigmurina. As linhas finas correspondem a restrições de distância fracas (entre 5,0 e 1,8 Å), as linhas com larguras intermediárias a restrições de distância médias (entre 3,4 e 1,8 Å) e as linhas grossas a restrições de distância fortes (entre 2,8 e 1,8 Å). ... 80

Tabela 9. Sumário da estatística estrutural do peptídeo StigA15 e Stigmurina a 2,0 mM

Lista de Siglas e Abreviaturas

ATCC do inglês American Type Culture Collection

ACN Acetonitrila

APD Banco de dados de peptídeos antimicrobianos, do inglês Antimicrobial Peptide Database

CD Dicroísmo circular, do inglês Circular Dichroism CHCA alfa-ciano-4-hidroxicinâmico

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CIM Concentração Inibitória Mínima, do inglês Minimal Inhibitory Concentration (MIC)

CMI Concentração Microbiana Mínima, do inglês Minimal Microbial Concentration (MMC)

COSY Espectroscopia de correlação, do inglês COrrelation SpectroscopY

CSI Índice de deslocamento químico, do inglês Chemical Shift Index

DCM Diclorometano

DIC N,N-Diisopropilcarbodiimida

DMF N,N-Dimetilformamida

DPC Dodecil fosfocolina, do inglês Dodecyl PhosphoCholine DRV Desidratação/Reidratação de Vesículas

EM Espectrometria de Massas

Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonila HOBt 1-hidroxibenzotriazol

HMQC Correlação heteronuclear de múltiplo quantum, do inglês Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HSQC Coerência heteronuclear de simples-quantum, Heteronuclear Single Quantum Coherence

IPA Álcool isopropílico, do inglês Isopropyl Alcohol

ITC Titulação Calorimétrica Isotérmica, do inglês Isothermal Titration Calorimetry

J constante de acoplamento escalar

LUVs vesículas grandes unilamelares, do inglês Large Unilamellar Vesicles

MALDI Dessorção/ionização de matriz assistida por laser, do inglês Matrix Assisted Laser Dessorption/Ionization

m/z Razão massa carga

NOESY Espectroscopia de aprimoramento nuclear Overhauser, do inglês Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY

NOE Efeito nuclear Overhauser, do inglês Nuclear Overhauser Effect PAMs Peptídeos Antimicrobianos

PDB Banco de dados de proteína, do inglês Protein Data Bank PIPE 4-metilpiperidina

POPC 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, do inglês 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-PhosphoCholine

POPE 1-palmitoil-2-oleoil-fosfoetanolamina, do inglês 1-Palmitoyl-2-Oleoyl PhosphatidylEthanolamine

POPG palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol), do inglês 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-Phospho-(1'-rac-Glycerol) RMN Ressonância Magnética Nuclear

RMSD Raiz quadrada dos desvios médios quadrados, do inglês Root of Mean Square Deviation

SDS Dodecil sulfato de sódio, do inglês Sodium Dodecyl Sulphate SPFS Síntese de Peptídeos em Fase Sólida

SOFS Síntese Orgânica em Fase Sólida StigA15 Stigmurina Análogo 15

SUVs Vesículas unilamelares pequenas, do inglês Small Unilamellar Vesicles

TFA Ácido trifluoracético TFE 2,2,2-trifluoroetanol

TIS tri-isopropilsilano

TOCSY Espectroscopia de correlação total, do inglês TOtal Correlation SpectroscopY

ToF Tempo de vôo, do inglês Time of Flight

tr tempo de retenção

Tris-HCl Cloridrato de 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol



SUMÁRIO

3.1 Peptídeos Antimicrobianos (PAMs) ... 20

3.2 Relação Estrutura e Atividade Antimicrobiana e Mecanismos de Ação .. 25

3.3 Peptídeo Bioativo na Peçonha do Escorpião Tityus stigmurus ... 28

3.4 Síntese de Peptídeo em Fase Sólida Via Estratégia Fmoc ... 30

3.5 Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) ... 37

3.6 Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) ... 37

3.7 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 39

4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 42

4.1 Obtenção do Peptídeo StigA15 ... 42

4.1.1 Preparação da resina ... 42

4.1.2 Remoção do grupo Fmoc ... 43

4.1.3 Teste de Kaiser ... 44

4.1.4 Etapa de acoplamento ... 44

4.1.5 Reação de clivagem do peptídeo da resina ... 45

4.2 Obtenção do Peptídeo Stigmurina ... 46

4.3 Purificação do Peptídeo StigA15 ... 48

4.4 Caracterização por Espectrometria de Massa MALDI-ToF... 48

4.5 Ensaios Biológicos ... 48

4.5.1 Microrganismos ... 48

4.5.2 Atividade antimicrobiana in vitro ... 49

4.5.3 Atividade hemolítica ... 50

4.6 Preparação das Vesículas Fosfolipídicas ... 50

4.8 Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) ... 51

4.9 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 52

4.10 Determinação das estruturas tridimensionais dos peptídeos a partir dos dados de RMN. ... 53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 54

5.1 Análise in silico e Sequenciamento ... 54

5.2 Síntese e Caracterização do Peptídeo StigA15 ... 55

5.3 Ensaios Biológicos ... 58

5.4 Estudo de Interação por Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) ... 61

5.5 Estudos das Preferências Conformacionais por Espectroscopia de Dicroísmo Circular ... 65

5.6 Obtenção das Estruturas dos Peptídeos por RMN ... 70

6 CONCLUSÃO ... 89 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 90 8 ANEXOS ... 99 8.1 Anexo A ... 99 8.2 Anexo B ... 101 8.3 Anexo C ... 102

1 INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, microrganismos multirresistentes a antibióticos vêm preocupando a comunidade científica, devido ao aumento substancial no número de casos de doenças causadas por esses seres e, em paralelo a esse crescimento, o conhecimento sobre novos medicamentos é fundamental, para se combater esse sério problema de saúde pública mundial (Ghosh et al., 2019; O’Neill, 2014). Nesse sentido, cientistas do mundo inteiro visam desenvolver medicamentos para combater essas enfermidades. Nesse contexto, Peptídeos Antimicrobianos (PAMs) são uma classe de moléculas promissoras como agentes antimicrobianos (Bahar & Ren, 2013; Ciumac et al., 2019; Ghosh et al., 2019; Hazam et al., 2018; Kumar et al., 2018; Travkova et al., 2017; Yeaman & Yount, 2003).

Os PAMs se tornaram uma alternativa interessante como antimicrobianos, por seu mecanismo de ação estar relacionado ao ataque à membrana dos microrganismos, não sendo, em grande parte dos casos, mediado por receptores (Ciumac et al., 2019; Kumar et al., 2018; Travkova et al., 2017; Yeaman & Yount, 2003), embora alguns resultados mostrem que alguns PAMs interagem com alvos internos, após ultrapassarem barreira da membrana (Hale & Hancock, 2007; Park et al., 1998). As perturbações físicas das membranas dos micróbios podem reduzir a incidência de resistência microbiana, uma vez que é difícil a reparação da membrana durante os períodos de ação (Travkova et al., 2017; Yeaman & Yount, 2003).

Desde o isolamento do primeiro peptídeo bioativo (Neumann et al., 1952) a busca de moléculas peptídicas com potencial terapêutico e quimioterápico de fontes naturais vem sendo extensivamente estudada (Gusmão et al., 2017; Magalhães et al., 2013; Melo et al., 2015; Santos et al., 2010). A substituição de resíduos de aminoácidos da sequência nativa, também vem sendo muito utilizada, a fim de potencializar suas atividades biológicas (Amorim et al., 2019; Parente et al., 2018; Reis et al., 2018). Outras modificações químicas, como a inserção de unidades glicotriazólicas (glicose-triazol-peptídeo) e de cumarina (1,2-Benzopirona-triazol-peptídeo), também têm levado a potencialização das atividades antifúngicas ou antibacterianas (Ferreira et al., 2018; Junior et al., 2017), bem como formação de dímeros, a qual tem levado o aumento nas atividades antimicrobianas quando compado ao peptideo monodimérico (Verly et al., 2017).

Essas biomoléculas podem ser encontradas em diversos organismos de diferentes reinos, sendo elas constituintes do sistema imunológico inato desses seres (Bahar & Ren, 2013; Hazam et al., 2018). Além disso, essas moléculas bioativas apresentam uma ampla multifuncionalidade biológica. Esse amplo espectro de atividade se deve às características estruturais e físico-químicas da interação (Ciumac et al., 2019; Kumar et al., 2018).

O reino animal apresenta um grande arsenal de peptídeos antimicrobianos. Nesse sentido, a peçonha de escorpião provou ser uma fonte rica de moléculas bioativas, sendo nos últimos anos cada vez mais reconhecida uma oferta abundante de PAMs isolados desses animais (Asmari et al., 2017; Harrison et al., 2014; Wang & Wang, 2016). Diante disso, peptídeos de várias classes presentes na peçonha de diferentes espécies de escorpiões vêm sendo estudados, avaliando suas atividades biológicas. Os PAMs isolados da peçonha do escorpião são tipicamente catiônicos, anfipáticos e podem ser divididos de acordo com a conformação que eles adotam em ambiente anfipático, sendo predominantemente  -helicoidais e conformações-β (Harrison et al., 2014).

Diante da diversidade de escorpiões, destacam-se as espécies do gênero Tityus, que vêm apresentando uma fonte promissora de peptídeos bioativos, como é o caso da espécie

Tityus discrepans. Dessa espécie foram isolados seis peptídeos

antimicrobianos, denominados bactridinas (Bactos), contendo quatro ligações dissulfeto e carregados positivamente. Essas biomoléculas foram capazes de, além de interagir com a membrana bacteriana, bloquear os canais de sódio dos microrganismos resultando na lise celular (Díaz et al., 2009).

Peptídeos lineares, sem a presença de ligações dissulfeto, já foram isolados de escorpiões pertencentes a esse táxon. Por exemplo, o peptídeo TsAP-1 foi isolado da peçonha de Tityus serrulatus (Guo et al., 2013), sendo amidado na porção C-terminal, constituído por 17 resíduos de aminoácidos, com carga liquida de +1 e, apesar de ter apresentado atividade antimicrobiana moderada, mostrou ser muito pouco tóxico a células de mamíferos. Além disso, esse peptídeo apresenta conformação helicoidal, sendo esse tipo de estrutura de maior representatividade em peptídeos isolados de escorpiões (Harrison et al., 2014; Wang et al., 2016).

Diante da diversidade de PAMs isolado da peçonha desses animais (cf. Harrison et al., 2014), em 2015 foi relatado um novo peptídeo antimicrobiano, denominado de Stigmurina, isolado da peçonha do escorpião Tityus stigmurus (Melo et al., 2015). Esse peptídeo catiônico possui uma sequência linear, constituída por 17 resíduos de aminoácidos, amidado na porção C-terminal (FFSLIPSLVGGLISAFK-NH2), sendo que a molécula apresenta conformação  -helicoidal em meios miméticos de membrana (Melo et al., 2015). Além disso, sua atividade biológica foi avaliada em bactérias Gram-positivas, verificando-se resultados promissores como antibiótico (Melo et al., 2015). O mecanismo de ação se deve à natureza catiônica da Stigmurina, que potencializa interações com a carga negativa da membrana fosfolipídica da bactéria, enquanto o caráter anfifílico do peptídeo possibilita potencializar sua permeabilização na bicamada (Daniele et al., 2016; Melo et al., 2015).

Desse modo, neste trabalho são propostos estudos conformacionais e da interação peptídeo-membrana de uma nova sequência com base na estrutura primária da Stigmurina,

a qual foi nomeada StigA15 (FFSLIPKLVGGLIKAFK-NH2). Para a realização dos estudos, pretende-se obter a molécula por Síntese Orgânica em Fase Sólida (SOFS) via estratégia Fmoc (Chan & White, 2000). Para a purificação do novo peptídeo, utiliza-se a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE/HPLC) e para a sua caracterização é utilizada a espectrometria de massas (Cantú et al., 2008). As preferências conformacionais do peptídeo foram investigadas por espectroscopia de dicroísmo circular (CD), método muito utilizado para a análise dos perfis de estrutura secundária de proteínas e peptídeos (Maria et al., 2016). Os estudos da termodinâmica de interação peptídeo-membrana foram realizados por meio da calorimetria de titulação isotérmica (ITC) (Seelig, 2004). As estruturas tridimensionais dos peptídeos StigA15 e Stigmurina foram ainda investigadas pela espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), auxiliada por ferramentas de cálculos computacionais (Resende et al., 2008).

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Síntese, caracterização estrutural e estudos biológicos de uma sequência aminoacídica bioativa obtida por quimioinformática do peptídeo natural Stigmurina

.

2.2

Específicos

● Obter, por síntese em fase sólida, o peptídeo StigA15 com rendimentos satisfatórios para posteriores análises;

● Caracterizar o peptídeo sintetizado por espectrometria de massa;

● Avaliar as preferências conformacionais do peptídeo em água, soluções de H2O:TFE, na presença de micelas de DPC e SDS, e na presença de vesículas de POPC e

POPC:POPG (3:1) por espectroscopia dicroísmo circular;

● Estudar a termodinâmica por interação do peptídeo na presença de vesículas de POPC e POPC:POPG (3:1) por calorimetria de titulação isotérmica;

● Avaliar a atividade antimicrobiana do peptídeo análogo e nativo, utilizando o método de microdiluição em caldo;

● Avaliar a atividade hemolítica dos peptídeos em eritrócitos humanos;

● Determinar a estrutura tridimensional dos peptídeos StigA15 e Stigmurina por espectroscopia de RMN.

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Os peptídeos são biomoléculas constituídas por aminoácidos, que estão ligados covalentemente por ligações peptídica, resultantes de reações de condensação (Figura 1). Tais ligações, denominadas de ligações peptídicas, são formadas pelo ataque do grupo  -amino de um -aminoácido, à carbonila do grupo -carboxila do outro, resultado na eliminação de uma molécula de água (Nelson & Cox, 2014).

Figura 1. Representação da cadeia peptídica pela formação da ligação peptídica.

Fonte: Autor, 2019

As moléculas de proteínas e peptídeos são constituídas por aminoácidos na configuração L, embora já tenham sido registradas ocorrências pouco frequentes de resíduos de D-aminoácidos na composição dessas moléculas. Inicialmente, foram registrados apenas em bactérias, mas tem sido relatada a ocorrência também em outros organismos vivos, como é o caso da fenilseptina, um PAM isolado do anuro Hypsiboas punctatus, que ocorre naturalmente como dois epímeros (D e L), diferenciando-se apenas na configuração do resíduo fenilalanina-2 (Magalhães et al., 2013).

Dentre as defesas que os seres vivos foram capazes de desenvolver, peptídeos antimicrobianos surgiram como produto da evolução, sendo hoje conhecidos como componentes essenciais da imunidade inata nesses seres vivos, atuando na primeira linha de defesa dos organismos contra infecções e na eliminação de organismos invasores ( Bahar & Ren, 2013; Hazam et al., 2018).Essas biomoléculas podem ser isoladas a partir de vários organismos ou podem ser sintetizadas em laboratório, embora que, muitas das vezes, essas sínteses são acompanhadas por modificações químicas na sequência dos peptídeos, visando potencializar suas atividades antimicrobianas (Junior et al., 2017; Reis et al., 2018; Verly et al., 2017).

Até maio de 2019, o Banco de Dados de peptídeos antimicrobianos registrou 3065 peptídeos de seis fontes naturais distintas, além dos sintéticos (APD - Antimicrobial Peptide Database, disponivel: http://aps.unmc.edu/AP/) (Wang et al., 2016). A Figura 2 mostra a divisão dos peptídeos antimicrobianos isolados de fontes naturais já registrados. Pode-se observar que a maioria deles, até o momento, são de origem eucariótica (animais, fungos e plantas), sendo que cerca de 74.1 % (2272) do total são de animais e, mais especificamente 84 de escorpião. De acordo com esse banco de dados, esses peptídeos apresentam uma ampla gama de atividades, podendo servir como bacteriostáticos, antivirais (incluindo

anti-HIV), antifúngicos, anticancerígenos, antiparasitários, antioxidantes, inibidores de proteases e até mesmo como inseticidas.

Apesar de serem moléculas heterogêneas produzidas por diversos organismos, os PAMs são, na sua maioria, compostos por 10 a 50 resíduos de aminoácidos, são tipicamente catiônicos (devido à presença de resíduos de arginina, lisina e histidina em pH fisiológico), além de também apresentarem resíduos hidrofóbicos, conferindo um caráter anfipático (Ciumac et al., 2019; Hazam et al., 2018; Kumar et al., 2018). Uma característica comum entre grande parte deles, é a existência de estruturas tridimensionais bem definidas, uma vez expostos ao ambiente de membranas. As diferenças na composição de aminoácidos e no comprimento da sequência podem implicar em diferentes perfis de estruturas secundárias, tais como -hélices e conformações-β, sendo esses motivos estruturais mais comumente encontrados na natureza (Ciumac et al., 2019; Hazam et al., 2018; Kumar et al., 2018). A seguir são descritas as principais características estruturais e funcionais dos PAMs, que estão relacionadas a seus mecanismos de ação

Figura 2. Gráfico de pizza da distribuição de peptídeos isolados de fontes naturais (total 3065) depositados no APD.

Fonte: http://aps.unmc.edu/AP, acesso: 02 de maio de 2019

Carga residual: A maioria dos PAMs naturais é tipicamente catiônica, com as cargas líquidas variando entre +1 e +9 (Ciumac et al., 2019). Contraposto a isso, as membranas microbianas são aniônicas, devido à presença de fosfolipídios carregados negativamente. Essa característica é extremamente importante para a atração eletrostática inicial dos peptídeos antimicrobianos com a membrana fosfolipídicas dos microrganismos (Kumar et al., 2018). Constituídos por 15% de lipídios aniônicos, as membranas bacterianas possuem como principais componentes lipídicos o fosfatidilglicerol (PG) e a cardiolipina (CL) (Estruturas Fig. 35, Anexo A, pag. 99) (Ciumac et al., 2019; Yeaman & Yount, 2003), resultando num potencial

Bactérias (11,02%) Archaea (0,17%) Protistas (0,27%) Fungos (0,59%) Plantas (11,3%) Animais (74,1%) Sintéticos (2,55%)

Bactérias (11,02%) Archaea (0,17%) Protistas (0,27%) Fungos (0,59%) Plantas (11,3%) Animais (74,1%) Sintéticos (2,55%)

elétrico negativo, onde é possível concentrar os peptídeos carregados positivamente nas superfícies microbianas. O alto teor de colesterol também faz com que as interações de PAMs com membranas de mamíferos sejam mais fracas (Verly et al., 2017). Esses fatores levam, em grande parte dos casos, à seletividade entre os alvos microbianos ou células de mamíferos.

Estudos com análogos da magainina (peptídeo isolado da pele do sapo africano Xenopus laevis), nos quais parâmetros como hidrofobicidade e helicidade são mantidos constantes, têm mostrado que o aumento de carga +3 para +5 resulta num aumento da atividade antibacteriana (Dathe et al., 2001). Esse efeito do aumento de carga também foi verificado nos derivados da sitgmurina StigA6 (+3) e StigA16 (+4) (Parente et al., 2018), e StigA25 (+5) e StigA31 (+7) (Amorim et al., 2019). Baseado nestas considerações, pode-se concluir que há uma forte correlação entre atividade antimicrobiana e cationicidade do peptídeo.

Anfipaticidade e Hidrofobicidade: Essas características se devem à distribuição de resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos nas sequências dos peptídeos. A anfipaticidade é amplamente usada para examinar como os PAMs interagem com a bicamada. Nessas interações, essas moléculas adquirem estruturas anfipáticas, ou seja, mantêm os resíduos polares e carregados em regiões separadas dos resíduos hidrofóbicos. Esta estruturação é possível porque a maioria dos PAMs tem um total de carga de +1 a +9, além de possuírem em sua constituição de 40 a 60% de resíduos hidrofóbicos. Essas taxas são consistentes para que se encontrem estruturas anfipáticas (Ciumac et al., 2019).

A hidrofobicidade é frequentemente descrita como a porcentagem de resíduos hidrofóbicos presente na sequência polipeptídica e é usada para indicar como o mesmo seria permeabilizado na membrana. Para a maioria dos PAMs, é geralmente cerca de 50% (Ciumac et al., 2019). Se a hidrofobicidade é baixa, o peptídeo pode não possuir afinidade suficiente para interagir com a bicamada lipídica, por outro lado, se for muito alta poderia resultar no aumento do efeito hemolítico e, além disso, diminuir interação com membranas aniônicas. Esse efeito foi observado com o peptídeo magainina, estudado por Dathe e Wieprecht (1997). Modificações na sua sequência, resultaram no aumento da permeabilização nas bicamadas zwitteriônicas, isto é, promoveram o aumento na atividade hemolítica, entretanto, a atividade antimicrobiana foi pouca afetada (Dathe et al., 1997; Wieprecht et al., 1997). Este estudo mostra que, como a atividade antimicrobiana foi fracamente afetada, a hidrofobicidade seria um parâmetro secundário para avaliar as interações dos peptídeos com as membranas aniônicas.

Sequência e Conformação: Embora haja uma vasta diversidade de sequências e fontes de peptídeos, é possível categorizá-los pelas suas preferências conformacionais, que são adotadas em ambientes miméticos de membranas. Apesar de uma variedade de estruturas, os grupos estruturais mais proeminentes nos quais os peptídeos podem se estruturar são em -hélice e em conformações-β (Figura 3) (Bahar et al., 2013; Dathe et al., 1999; Hazam et al., 2018).

A estrutura secundária mais adotada por peptídeos antimicrobianos ao interagirem com a membrana é a -hélice (Bahar et al., 2013). A molécula enovela-se, formando uma conformação helicoidal, que se estabiliza por interações intramoleculares com ligações de hidrogênio entre o hidrogênio do grupo amino (-NH) e o oxigênio da carbonila (C=O) distantes na cadeia peptídica por aproximadamente 3 a 4 resíduos de aminoácidos (Bahar et al., 2013). A hélice anfipática é a força motriz da ligação à membrana em muitas proteínas e peptídeos. Essa estrutura, com as cadeias laterais polares alinhadas ao longo de um lado e os resíduos hidrofóbicos ao longo do lado oposto do revestimento helicoidal, permite uma interação ótima dos peptídeos com a estrutura anfifílica da membrana (Bahar et al., 2013; Dathe et al., 1999).

Figura 3. Principais classes estruturais de peptídeos. (A) -hélices, magainina-2 (PDB 2MAG); (B) conformação-, polifemusina (PDB 1RKK); (C) estendidos, indolicidina (PDB 1G89); (D) Dímero da homotarsinina (Verly, et al., 2017).

Fonte: https://www.rcsb.org/. Acesso: janeiro de 2019.

Uma característica dos peptídeos antimicrobianos -helicoidais é que a maioria apresenta um grupo carboxamida na região C-terminal, uma modificação pós-traducional, que pode proporcionar uma maior atividade antimicrobiana aumentando a interação eletrostática entre o peptídeo carregado positivamente e a membrana bacteriana carregada negativamente (Bahar et al., 2013; Kumar et al., 2018).

As conformações-β são, muitas das vezes, estabilizadas por ligações dissulfeto, embora as ligações de hidrogênio também desempenhem importante papel. Contudo, diferentemente da conformação em -hélice, as ligações de hidrogênio ocorrem entre aminoácidos de fitas distintas (Travkova et al., 2017). Embora menos comuns, alguns peptídeos podem apresentar conformação desenovelada (Travkova et al., 2017), como no caso da indolicidina. Além disso, resultados de testes biológicos, bem como várias técnicas biofísicas e espectroscópicas, têm mostrado que as duas cadeias conectadas pela ligação

dissulfeto possibilitam interações, bem como atividades mais pronunciadas para os dímeros, em relação a suas cadeias monoméricas (Verly et al., 2017).

É bem estabelecido que certos resíduos em determinadas posições da sequência favorecem a estruturação helicoidal, enquanto outros a desestabilizam. Assim, estudos iniciais dirigidos para aumentar a atividade na membrana e melhorar o efeito antimicrobiano foram baseados em substituições de aminoácidos apropriadas para aumentar a helicidade do peptídeo. Em outro trabalho com a magainina, os resíduos de glicina foram substituídos por alanina, promotora de hélice em vários casos, aumentando drasticamente seu teor helicoidal e, como consequência, a atividade antimicrobiana do peptídeo (Chen et al., 1988).

O conhecimento desses parâmetros é de suma importância na arquitetura de novos peptídeos, tendo como objetivo potencializar sua interação com a membrana, sendo esse o modelo de ação contra os mais graves patógenos resistentes a antimicrobianos comuns (Ghosh et al., 2019; Ciumac et al., 2019; Kumar et al.; 2018; Yeaman & Yount, 2003).

A resistência microbiana vem crescendo nos últimos tempos e tornando-se uma questão de saúde pública global. De acordo com o relatório do Sistema Global de Vigilância Antimicrobiana, divulgado pela Organização Mundial de Saúde (OMS), há registros de ocorrência a resistência aos antibióticos em países de baixa e alta renda, totalizando vinte e dois países, incluindo o Brasil (Global Antimicrobial Surveillance System, 2018). Esse evento está relacionado ao uso excessivo e indevido de antibióticos, resultando no surgimento de patógenos super-resistentes, tornando os tratamentos convencionais ineficazes (cf. Ghosh et al., 2019; O’Neill, 2014). Como resultado, as infecções persistem, podendo causar surtos globais com alta morbidade e mortalidade. Um estudo divulgado no ano de 2017 pela OMS listou doze famílias de bactérias resistentes aos antibióticos convencionais, que representam ameaças à saúde humana (OPAS/OMS, 2017). As bactérias resistentes mais comumente relatadas foram: Enterococcus spp. resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente à meticilina, Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomona spp. e Salmonella spp.

A necessidade urgente ao desenvolvimento de novas terapias antimicrobianas foi recentemente enfatizada no relatório publicado no Fórum Econômico Mundial (FEM), no qual foram indicadas que 700.000 mortes a cada ano são atribuídas a resistência antimicrobiana, podendo-se chegar a 10 milhões anualmente até 2050, vindo a ser a principal causa de morte no mundo (World Economic Forum, 2018). Além disso, o relatório discute a necessidade de investir em pesquisas na obtenção de novas substâncias promissoras para driblar a resistência antimicrobiana, sendo economicamente mais viável esse investimento em comparação ao enorme impacto financeiro que isso pode causar na saúde global.

Diversos estudos mostraram que modificações na sequência de peptídeos são capazes de promover a atividade biológica, permitindo compreender seu mecanismo de ação frente a meios miméticos de membranas, nas quais já se sabe que os PAMs atuam, podendo causar danos irreversíveis e, como consequência, observar-se maior dificuldade dos microrganismos patogênicos em desenvolver resistência a essas substâncias (Kumar et al., 2018; Yeaman & Yount, 2003). Essa interação com a membrana é favorecida devido a características estruturais e físico-químicas dos peptídeos (Travkova et al., 2017). De forma ampla, o processo de interação ocorre em duas etapas. Primeiramente uma atração eletrostática entre o peptídeo e a superfície externa da membrana, seguida da inserção da região hidrofóbica do peptídeo na interface da bicamada fosfolipídica causando sua desorganização (Yeaman & Yount, 2003).

Além da interação eletrostática ser inicialmente favorecida, as interações hidrofóbicas contribuem para inserção dos PAMs na membrana, que é constituída por longas cadeias carbônicas apolares. Essa natureza anfifílica das bicamadas lipídicas favorece na estruturação dos peptídeos ao interagirem com a bicamada fosfolipídica (Yeaman & Yount, 2003). Estudos com Pandinina-2, identificado na peçonha do escorpião Pandinus imperator, mostraram que os resíduos aromáticos presente neste peptídeo são fundamentais na interação com a interface da bicamada, que é favorecida por interações de Van der Waals (Velasco et al., 2018).

Grande parte das conformações que os peptídeos adotam, estão relacionadas ao favorecimento de uma natureza anfipática. Tal característica torna-se importante pois as regiões hidrofóbicas podem se ligar à região apolar da membrana, enquanto as regiões hidrofílicas interagem com a superfície carregada das membranas dos microrganismos. Estas regiões geralmente são bem definidas na conformação adotada durante a interação e se localizam em faces opostas na estrutura tridimensional do peptídeo. A anfipaticidade permite ainda a formação de agregados de peptídeo na superfície da membrana. Essa desorganização pode tensionar a bicamada e o excesso de peptídeos na mesma membrana pode gerar a formação de poros de tamanhos variáveis, permitindo assim o extravasamento do conteúdo intracelular (íons e outros solutos citoplasmáticos) e, consequentemente, a lise celular (Hazam et al., 2018; Kumar et al., 2018; Travskova et al., 2017). Diante disso, vários modelos foram propostos para descrever a ação desses peptídeos. A Figura 4 representa os quatro modelos de mecanismo de ação desses peptídeos mais citados na literatura.

No modelo de barril (Fig.4A), os peptídeos, após a agregação na superfície, se inserem perpendicularmente à bicamada, formando poros. Esses poros atuam como um canal de condutância, que permite um vazamento de componentes intracelulares e, consequentemente, a lise celular. Nesse modelo, a face hidrofóbica das cadeias helicoidais de moléculas de peptídeo interage com as cadeias carbônicas dos fosfolipídios, deixando

exposta a face hidrofílica. O tamanho do poro aumenta proporcionalmente com a concentração do peptídeo (Travkova et al., 2017). Além disso, os peptídeos podem ser transportados para o interior da membrana devido a diferença de potencial eletroquímico e do gradiente de concentração dos peptídeos ligados à superfície (Fig.4B). Esse tipo de modelo está frequentemente associado a peptídeos bastante hidrofóbicos, contendo vinte ou mais resíduos de aminoácidos (Ciumac et al., 2019; Travkova et al., 2017).

Figura 4. Representação esquemática dos principais modelos de ação dos peptídeos antimicrobianos helicoidais: (A) modelo de barril, (B) eletroporação molecular, (C) poro toroidal e (D) modelo carpete. Em vermelho representa-se uma parte hidrofílica, e em azul uma parte hidrofóbica

Fonte: Adaptada (Travkova et al., 2017). Aurotizada pela Elsevier (ANEXO B).

Embora muito parecido com o modelo anterior, no poro toroidal (Fig.4C) os peptídeos se inserem na bicamada numa orientação perpendicular aos lipídeos devido uma interação eletrostática forte da face hidrofílica do peptídeo com as cabeças também polares da superfície externa da membrana, fazendo com que ocorra a formação de poros (Travkova et al., 2017). Em seguida, o aumento de moléculas de peptídeo e a forte interação eletrostática peptídeo-membrana causam uma curvatura da bicamada lipídica. Por fim, no modelo carpete (Fig.4D), os peptídeos se acumulam na superfície da bicamada em uma orientação paralela, devido à interação eletrostática inicial, de forma similar a um “carpete”. Após alcançar uma concentração crítica, ocorre uma redistribuição dos lipídios, resultando em uma tensão na curvatura da membrana, que pode levar ao seu rompimento e à formação de estruturas micelares compostas por fosfolipídios envolvidos por moléculas de peptídeo (Hazam et al., 2018; Travkova et al., 2017; Yeaman & Yount, 2003).

A inserção do peptídeo na membrana pode ser acompanhada por uma série de eventos que, contribuem para a desativação celular: despolarização da membrana, vazamento de metabólitos essenciais, perda de composições específicas na membrana

devido às perturbações nos fosfolipídios (Travkova et al., 2017; Yeaman & Yount, 2003)e ainda, em alguns casos, interação com alvos internos (Hale & Hancock, 2007; Park et al., 1998). Além disso, outros eventos de mecanismo de ação de PAMs foram descritos além dos modelos clássicos citados (Nguyen et al., 2011), entretanto, vale ressaltar que, na sua maioria, os peptídeos antimicrobianos requerem um ambiente membranoso para adotar uma conformação estável e o seu modo de ação geralmente envolve interromper a integridade da membrana citoplasmática. Além disso, estudos recentes realizados por dinâmica molecular mostraram que os PAMs podem provocar a lise celular seguindo uma única via de ação ou por um conjunto de mecanismos provocado pelo mesmo peptídeo (Cheraghi et al. 2018).

Os mecanismos de ação dos PAMs têm sido amplamente descritos na literatura (Ciumac et al., 2019; Kumar et al., 2018; Hazam et al., 2018; Travkova et al., 2017; Yeaman & Yount, 2003). Modificações em suas sequências podem resultar em diferentes modos de ação, visando potencializar suas atividades. A ampliação dos conhecimentos sobre o modo de interação peptídeo-membrana torna-se relevante para o desenvolvimento de fármacos. Nesse sentido, para os estudos biofísicos de interação peptídeo-membrana que permitam a compreensão do modo de ação dos peptídeos, neste trabalho são empregados meios biomiméticos de composições químicas variáveis e que mimetizam a célula alvo.

3.3 Peptídeo Bioativo na Peçonha do Escorpião Tityus stigmurus

O isolamento do primeiro peptídeo antimicrobiano da peçonha de um escorpião, a saber da espécie Leiurus quinquestriatus (Cociancich et al., 1993), levou à busca por novos peptídeos bioativos provenientes desses animais. Desde então, diversos peptídeos já foram isolados e suas atividades contra vários microrganismos, incluindo-se também atividades em células tumorais (Daniele et al., 2016; Harrison et al., 2014; Wang et al., 2016) foram caracterizadas.

O veneno de escorpião provou ser uma fonte rica de moléculas bioativas, com potencial promissor para serem utilizadas na terapêutica (Almeida et al., 2012; Al-Asmari et al., 2017; Harrison et al., 2014). A presença de PAMs pode proteger a glândula de veneno de possíveis infecções e, além disso, facilitar a ação de outras neurotoxinas (Harrison et al., 2014). Pesquisas com peptídeos isolados a partir da peçonha de animais têm sido realizadas por constituírem modelos moleculares interessantes para indústrias farmacêuticas, no desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas (Klint et al., 2013)

.

Na avaliação da análise transcriptômica da glândula do veneno do escorpião T. stigmurus foi observado uma mistura complexa de moléculas biologicamente ativa, na qual foram identificados diversos genes codificantes para hipotensinas, moléculas semelhantes à lectinas, bradicininas, neurotoxinas, metaloproteinases, peptídeos ricos em cisteína, peptídeos aniônicos, peptídeos antimicrobianos e outras substâncias com função não elucidada, sendo que 25,19% do total de transcritos correspondem a PAMs (Almeida et al., 2012).

A Stigmurina1 _{é um peptídeo antimicrobiano constituído por dezessete resíduos de}

aminoácidos, amidado na porção C-terminal e com carga global +2, essa carga é devido a presença de lisina (K) carregada e a protonação da amina na porção N-terminal em pH fisiológico (Melo et al., 2015). As preferências conformacionais foram avaliadas por espectroscopia de dicroismo circular, adotando uma conformação helicoidal em meio biomiméticos, sendo a estrutura secundária em -helice obtida por modelagem molecular (Melo et al., 2015). Sua atividade antimicrobiana in vitro foi comprovada em cepas de bactérias Gram-positivas e sobre leveduras, tendo ainda apresentado baixa atividade hemolítica (Melo et al., 2015), bem como, ação antiproliferativa in vitro sobre as linhagens celularSiHa (células de câncer cervical humano) e Vero E6 (células de câncer renal de macaco verde africano) (Daniele et al., 2016). Nesse contexto, o referido peptídeo apresenta características promissoras para ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.

Figura 5. Espécie Tityus stigmurus, popularmente conhecido como escorpião amarelo.

Fonte: Ministério da Saúde, 2009. (Foto: M. C., Denise). Reprodução autorizada conforme o item destacado no Manual de Controle de Escorpiões (ANEXO C).

Sendo assim, a partir da Stigmurina, o grupo de pesquisa do prof. Dr. Matheus F. F. Pedrosa usando uma abordagem in silico, propôs trinta e um peptídeos análogos via

1 _{Cadastrado no dia 24/04/2018 no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético (SisGen) nº} AAF17D9.

modificações na estrutura primária do peptídeo nativo, o que resultou num depósito de pedido de patente junto ao instituto Nacional de Propriedades Intelectual (INPI) com número BR 10 2015029044 6.

Como foi discutido anteriormente, os PAMs possuem mecanismos de ação que é iniciado pelas interações eletrostáticas com a membrana aniônica fosfolipídica. Estudos anteriores mostram que a presença de lisina na sequência primária potencializa a estruturação dessas moléculas (Almaaytah et al., 2014; Sato & Feix, 2008), efeito esse também verificado em dois estudos recentes com derivados da Stigmurina. Substituições por resíduos carregados de lisina na sequência primária da Stigmurina mostrou uma melhora significativa na atividade antimicrobiana, quando comparados ao peptídeo nativo. Suas concentrações inibitórias mínimas (Minimum Inhibitory Concentration-MIC) contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e leveduras foram inferiores às da Stigmurina, com efeitos hemolíticos consideráveis em células humanas (Amorim et al., 2019; Parente et al., 2018).

Nesse contexto, o trabalho objetiva o estudo de molécula derivada da Stigmurina, a StigA15, contendo dezessete resíduos de aminoácidos e carga líquida +4. Esse aumento de carga se deu com substituição de dois resíduos de serina por dois de lisina, o que influencia nas propriedades de interação do peptídeo com membranas. A Tabela 1 mostra a sequência linear da Stigmurina e do derivado foco desse projeto.

Tabela 1. Sequências e cargas líquidas da Stigmurina e do StigA15 investigado neste trabalho.

Peptídeos Sequência Carga

Stigmurina StigA15 F F S L I P S L V G G L I S A F K -NH2 F F S L I P K L V G G L I K A F K -NH2 +2 +4

*Em negrito são apresentados os resíduos da Stigmutina que a serem substituídos e os resíduos escolhidos para substituição na sequência da StigA15.

Fonte: Autor, 2019

Visto isso, o novo peptídeo foi obtido por Síntese de Peptídeos em Fase Solida (SPFS), via estratégia Fmoc (Chan & White, 2000).

3.4 Síntese de Peptídeo em Fase Sólida Via Estratégia Fmoc

A partir da década de 50 vários peptídeos ativos foram descobertos e tiveram as suas estruturas químicas determinadas (Juliano, 1990). Essas descobertas geraram um enorme interesse por esta classe de compostos e por metodologias para o seu isolamento, análise, purificação, identificação e quantificação, as quais passaram a ser estudadas e aprimoradas (Chan & White, 2000). Com isso, deparou-se com necessidade de se sintetizarem essas moléculas, e alguns derivados em escala suficiente para os estudos químicos, farmacológicos e bioquímicos, dentre outros, principalmente porque as fontes naturais são pobres em quantidades desses compostos, o que dificulta o isolamento em quantidades suficientes para

a realização desses estudos (Marquardt & Eifler-Lima, 2001; Juliano, 1990). Assim, a Síntese Orgânica em Fase Sólida (SOFS) vem sendo usada na obtenção de novos peptídeos, desde a sua descoberta por Bruce Merrifield na década de 50, por apresentar excelentes rendimentos, em um curto período, além do uso de poucos reagentes e solventes (Chan & White, 2000). Tal trabalho rendeu para Bruce Merrifield o Prêmio Nobel em química em 1984 (Disponível: www.nobelprize.org, acesso: 01 de maio de 2019).

O planejamento de uma síntese em fase sólida começa com a escolha do suporte polimérico. O mesmo deve ser permeável e facilmente solvatado por solventes polares apróticos, para minimizar ligações de hidrogênio entre o suporte e o peptídeo, e deve ser insolúvel em todos os solventes utilizados (Marquardt & Eifler-Lima, 2001). A escolha do suporte polimérico se deve à porção terminal do peptídeo, que se pretende obter ao final da síntese, podendo ter uma extremidade amidada ou carboxilada. Boa parte dos peptídeos antimicrobianos possuem a porção C-terminal naturalmente amidada, isto é, o grupo -OH é substituído por -NH2, resultando numa carboxamida (Bahar et al., 2013; Ciumac et al., 2019),

de modo que é necessária a utilização de uma resina nitrogenada para obtenção da sequência de interesse. A Figura 6 apresenta dois exemplos de suportes poliméricos que levam a obtenção de peptídeos com à porção C-terminal amidada ou carboxilada.

Figura 6. Exemplos de resinas poliméricas usadas na síntese de peptídeos em fase sólida.

Na síntese de peptídeos, somente um sítio específico em cada um dos aminoácidos envolvidos na formação de uma nova ligação peptídica deve estar disponível para a reação de formação da ligação peptídica, entretanto, moléculas como os aminoácidos possuem dois ou mais grupos funcionais e, portanto, esses grupos disponíveis de sofrer reações laterais devem estar devidamente protegidos. Desse modo, para contornar esse problema, pode-se utilizar o grupo 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) para proteção do grupo -amino. Sua remoção é realizada com a utilização de uma base, como a 4-metilpiperidina (Figura 7) (Chan & White, 2000). Já as cadeias laterais contendo grupos funcionais diferentes de hidrocarbonetos, como a lisina, histidina, triptofano e dentre outros aminoácidos, são protegidos por grupos que são facilmente eliminados por acidólise (como por exemplo o grupo terc-Butiloxicarbonila –Boc e terc-Butil –tBu (Estruturas Fig. 36, Anexo A, pag.100).

Figura 7. Mecanismo genérico proposto para a reação de desproteção (remoção do grupo Fmoc) com 4-metilpiperidina (condição básica) para gerar o N-terminal.

Fonte: Adaptado (Chan & White, 2000)

Além dos grupos amino essencialmente protegidos, é necessária a ativação do carbono da carbonila, pois a hidroxila não é facilmente removida. Na ativação, o carbono da carbonila terá sua eletrofilicidade potencializada por substituintes eletroaceptores ligados diretamente a ela, facilitando o ataque do grupo amino (do outro aminoácido), que é o nucleófilo da reação. A diisopropilcarbodiimida (DIC) e o 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) são reagentes de acoplamento que usualmente convertem o ácido carboxílico em um éster reativo, que reage com o grupo amino da porção N-terminal da peptidil-resina. Além disso, a utilização do DIC leva a formação da N,N’-diisopropilureia, um coproduto ureia formado na etapa de acoplamento (Figura 8).

Figura 8. Mecanismo genérico proposto para a reação de ativação seguida do acoplamento de Fmoc-aminoácido.

Fonte: Adaptado (Chan & White, 2000)

A eficiência de cada acoplamento e desproteção é confirmada com o uso do teste de Kaiser, o qual consiste no uso da ninidrina que, ao reagir com amina primária, leva a solução com coloração violeta (Troll et al., 1953) (Figura 9). O teste positivo apresenta uma coloração violeta, indicando a presença de NH2 livre (Figura 9), confirmando a eficiência da desproteção

(remoção do grupo Fmoc), enquanto na ausência de aminas primárias a solução apresenta uma coloração amarelada ou incolor, na qual indica a eficiência do acoplamento.

Figura 9. Mecanismo genérico proposto para o teste de Kaiser.

Fonte: Adaptado (Chan & White, 2000)

Normalmente, uma solução contendo ácido trifluoroacético (TFA), na presença de capturadores de carbocátions, como o triisopropilsilano (TIS), é utilizada como reagente de clivagem. A remoção dos grupos protetores das cadeias laterais, pelo emprego da solução ácida, libera intermediários catiônicos reativos e os capturadores de carbocátions minimizam as reações colaterais, que podem ocorrer com cadeias laterais de resíduos como triptofano,

tirosina, metionina e cisteina (que podem atuar como nucleófilos) (Chang & White, 2000). A clivagem do peptídeo da resina ocorre de acordo com o mecanismo apresentado na Figura 10.

Figura 10. Mecanismo da clivagem libera o C-terminal amídico do peptídeo da peptidil-resina, pelo emprego de uma solução de TFA (catálise ácida)

Fonte: Adaptado (Chan & White, 2000)

A Figura 11 apresenta o esquema básico de síntese em fase sólida, usando a estratégia de Fmoc (Chan & White, 2000). Neste método, o processo é iniciado pela clivagem do grupo Fmoc (vermelho) da resina, na qual é efetuada pelo emprego de uma solução básica como foi mostrado na Figura 7.

Como os peptídeos estudados neste projeto são amidados na porção C-terminal, decidiu-se utilizar a representação da própria resina efetuada na atual síntese. Para se realizar o acoplamento do primeiro aminoácido, sendo neste trabalho a lisina (azul), na resina, esse deve ser inicialmente ativado (Fig. 8, pag.16), a fim de se ter um grupo mais reativo que a carbonila do ácido carboxílico. Uma vez ativado o aminoácido, inicia-se a reação de acoplamento entre este e a resina, obtendo-se então o aminoácido protegido ligado à resina.

Figura11. Esquema geral da síntese de peptídeos em fase sólida, segundo estratégia Fmoc.

Fonte: Adaptado (Chan & White, 2000).

Os sucessivos acoplamentos dos demais aminoácidos da sequência são procedidos de maneira similar. Após cada etapa de acoplamento, a peptidil-resina é desprotegida, o