4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Obtenção do Peptídeo StigA15
O peptídeo foi obtido de acordo com a metodologia de síntese em fase sólida via estratégia Fmoc (Chan & White, 2000) no Laboratório de Síntese e Estrutura de Peptídeos (LASEP) da UFMG. O suporte sólido utilizado foi a resina Rink-Amide (Iris Biotech, Marktredwitz, Alemanha) (Fig. 6, pag. 31) com grau de substituição 0,40 mmol/g, o qual fornece um produto carboxamida no terminal-C na sequência polipeptídica, mantendo-se assim padrão similar ao do peptídeo nativo (Tab. 1, pag. 30).
Todos os resíduos de aminoácidos com os respectivos grupos protetores de cadeia lateral, utilizados na síntese do peptídeo StigA15 (Tab. 2, pag. 45) tendo sido obtidos da Iris Biotech, Marktredwitz, Alemanha, e as medidas das massas foram feitas em balança da Metler AE 163 com precisão de 0,01 mg. A síntese foi planejada para obtenção de 150 mg do peptídeo, i.e., 0,079 mmol do peptídeo StigA15 e, para as etapas de acoplamento, utilizou-se excesso estequiométrico de quatro equivalentes de Fmoc-aminoácidos e ativadores.
No intervalo de cada etapa de acoplamento ou de desproteção, a peptidil-resina foi submetida a lavagem conforme o Protocolo 1.
Protocolo 1: Procedimento utilizado na etapa de lavagem.
1 – Preencher a seringa com N,N-dimetilformamida (DMF) e, após, 10 s removê-lo por filtração.
2 – Repetir a etapa 1, porém com álcool isopropílico (IPA). 3 – Repetir as etapas 1 e 2 mais duas vezes.
4 – Encerrar o processo com uma última lavagem com diclorometano (DCM). A seguir são descritas de forma mais sucinta as etapas da síntese.
4.1.1 Preparação da resina
Antes de iniciar o acoplamento do primeiro resíduo de aminoácido ao suporte polimérico, é feita a preparação da resina. Inicialmente pesaram-se 199,7 mg da resina
polimérica 2, sendo posteriormente transferida para uma seringa de polipropileno de 10,0 mL,
contendo um filtro poroso. Na figura 14 é apresentada o modelo da seringa usualmente utilizada na síntese de peptideo em fase sólida. Em seguida foram succionados para a seringa 5,0 mL de DCM (processo de dilatação da resina) e a seringa foi colocada sob agitação mecânica por 30 minutos. Na seqüência, o DCM foi removido com auxílio de bomba de vácuo. A seguir foi feita a lavagem da resina conforme descrito o Protocolo 1. Efetuou-se então a etapa de desproteção da resina (retirada do grupo Fmoc da resina), conforme descrito o item 4.1.2. Esse procedimento foi repetido por duas vezes, a fim de garantir a eficiência da remoção do grupo protetor. Uma alíquota da resina foi então retirada para se realizar o teste de Kaiser (item 4.1.3).
Figura 14. Em detalhe, modelo da seringa utilizada na Fmoc-SPFS.
Fonte: Adapatado (Guimarães, 2017)
4.1.2 Remoção do grupo Fmoc
A etapa de desproteção da resina e dos respectivos resíduos de aminoácidos (retirada do grupo Fmoc - Fig. 7, pag. 32) foi efetuado adicionando-se 5,0 mL da solução de 4- metilpiperidina (PIPE) a 20% v/v em DMF previamente destilada, deixando-se o sistema sob agitação mecânica por 12 minutos. Ao término desse período, a peptidil-resina foi lavada conforme o Protocolo 1. A eficiência da desproteção e dos acoplamentos foi verificada com o teste de Kaiser.
2 massa da resina =
massa desejada do peptídeo massa molar do peptídeo∗
grau de substituição da resina *Obtido: https://pepcalc.com/
4.1.3 Teste de Kaiser
Para a verificação do sucesso das etapas de acoplamento e desproteção, foi realizado o teste de Kaiser, também conhecido como teste de ninidrina (Troll et al., 1953). O resultado positivo da reação, caracterizado pela coloração azul de Ruhemann dos grãos da resina, indica a presença de amina primária, como mostrado na Fig. 9, pag. 34. O resultado positivo indica etapa de acoplamento ineficaz, que necessita de repetição, ou conclusão da etapa de desproteção. Por sua vez, o resultado negativo indica etapa de acoplamento eficaz, ou da etapa de desproteção ineficaz, que necessita de repetição.
O teste é realizado a 100 ºC por 5 minutos e consiste na seleção de alguns grãos da peptidil-resina (entre 5 a 10 grãos), que são transferidos para um tubo de ensaio, seguindo- se adição das soluções descritas abaixo.
Solução 1 – Piridina a 2 % v/v em solução aquosa de cianeto de potássio (KCN) 1 mM; Solução 2 – Solução de fenol a 80 % m/v em etanol;
Solução 3 – Solução de ninidrina a 5 % m/v em piridina.
4.1.4 Etapa de acoplamento
Neste trabalho, foram empregados como agentes ativadores do grupo carbonila a N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC) e 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (Sigma-Aldrich), juntamente ao respectivo Fmoc-aminoácido (Fig. 8, pag. 33). Para se garantir uma alta eficiência em cada etapa de acoplamento, foi utilizado um excesso estequiométrico de quatro equivalentes dos reagentes ativadores e do Fmoc-aminoácido. O Protocolo 2 apresenta a etapa de acoplamento dos respectivos Fmoc-aminoácidos apresentados na Tabela 2.
Protocolo 2: Procedimento utilizado na etapa de acoplamento do StigA15
1 – Adiciona-se a um recipiente a massa calculada do resíduo de aminoácido 3 (Tab.
2).
2 – Adiciona-se 48,9 mg, i.e., 0,319 mmol de HOBt 4.
3 – Adiciona-se 49,0 L de DIC 5.
3 massa de aminoácido = (massa deseja do peptídeo
massa molar do peptídeo × massa molar do AA) × excesso
4 massa de HOBt = (massa deseja do peptídeo
massa molar do peptídeo × massa molar do HOBt) × excesso
MM HOBt = 153,10g/mol
5 volume do DIC = (nº mol do peptideo x MM do DIC x excesso
densidade do DIC × excesso)
MM DIC = 126,20 g/mol densidade DIC = 0,815 g/mL
4 – Acrescentam-se ao recipiente 2,0 mL de DMF e 1,0 mL de DCM, para a dissolução da mistura.
5 – A mistura é homogeneizada sob agitação por 5 min. em vortex.
6– A mistura foi succionada para o interior da seringa e deixada sob agitação por 3 horas em mesa agitadora.
Ao fim desse tempo, a resina foi lavada descrito no Protocolo 1. Segue-se então o teste de Kaiser, a partir do qual se avalia a conclusão da reação ou a necessidade de reacoplamento.
Tabela 2. Fmoc-aminoácidos protegidos e as respectivas massas molares modificadas e obtidas na obtenção do peptídeo StigA15
Ordem de acoplamento Posição na sequência Aminoácido* modificado MM modificado (g/mol) Massa calculada (mg) 1º 17 Fmoc-Lys(Boc)-OH 468,5 149,7 2º 16 Fmoc-Phe-OH 387,4 123,8 3º 15 Fmoc-Ala-OH 311,3 99,4 4º 14 Fmoc-Lys(Boc)-OH 468,5 149,7 5º 13 Fmoc-Ile-OH 353,4 112,9 6º 12 Fmoc-Leu-OH 353,4 112,9 7º 11 Fmoc-Gly-OH 297,3 95,0 8º 10 Fmoc-Gly-OH 297,3 95,0 9º 9 Fmoc-Val-OH 339,4 108,4 10º 8 Fmoc-Leu-OH 353,4 112,9 11º 7 Fmoc-Lys(Boc)-OH 468,5 149,7 12º 6 Fmoc-Pro-OH 337,4 107,8 13º 5 Fmoc-Ile-OH 353,4 112,9 14º 4 Fmoc-Leu-OH 353,4 112,9 15º 3 Fmoc-Ser(tBu)-OH 383,4 122,5 16º 2 Fmoc-Phe-OH 387,4 123,8 17º 1 Fmoc-Phe-OH 387,4 123,8
*Estruturas químicas apresentadas na Figura 36, Anexo A, pag. 100. Fonte: Autor, 2019
4.1.5 Reação de clivagem do peptídeo da resina
Inicialmente removeu-se o grupo Fmoc, como descrito no item 4.1.2 e procederam-se as subsequentes lavagens (Protocolo 1). A seguir, secou-se a peptidil-resina obtida com auxílio de uma linha de vácuo e pela passagem de gás nitrogênio. Em seguida, preparou-se 6,0 mL de solução de clivagem (8 a 12mL/g de resina) do ácido trifluoracético (TFA): triisopropilsilano (TIS): água na proporção 95,0:2,5:2,5 v/v. A mistura foi succionada para o interior da seringa e colocada sob agitação mecânica por 2 horas. Após esse tempo, filtrou-
se para um tubo falcon a solução contendo o peptídeo clivado da resina com o auxílio de uma seringa equipada com filtro e fez-se a lavagem da resina com 2,0 mL de solução análoga à usada para a clivagem, e então submetido a um fluxo de nitrogênio gasoso para a evaporação quase por completo da solução de clivagem. A separação do peptídeo na solução foi realizada com a adição de 5,0 mL de éter diisopropílico gelado (resfriado com nitrogênio líquido), a mistura foi agitada por 2 minutos em Vórtex, resfriada e centrifugada a 6600 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi retirado com o auxílio de uma pipeta Pasteur, de forma a não perturbar o precipitado. Esse procedimento foi repetido por quatro vezes. O sólido formado foi dissolvido em 3,0 mL de água ultrapura, congelado em nitrogênio líquido e colocado em liofilizador por 24 horas.
Na Figura 15 é apresentado um fluxograma com as etapas envolvidas na síntese.